Modelo do rato para transplante de pâncreas, usando uma técnica modificada do manguito
16 de dezembro de 2017
Entre a transplantação de órgãos sólidos abdominal, enxertos pancreáticos são propensos a desenvolver danos de enxerto associada a lesão de reperfusão isquemia severa, levando eventualmente a perda precoce do enxerto. Este protocolo descreve um modelo de transplante de pâncreas murino utilizando uma técnica não-sutura do manguito, ideal para analisar estes danos deletérios, cedo.
Meu nome é Benno Cardini, do Laboratório de Pesquisa Daniel Swarovski do Departamento de Cirurgia Visceral, Transplante e Torácica da Universidade Médica de Innsbruck. Hoje, vamos mostrar um modelo de camundongo para transplante de pâncreas usando uma técnica de manguito modificada. Anestesiar o animal doador com uma injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina e raspar a região abdominal.
Em seguida, coloque o receptor em um campo operatório em decúbito dorsal e esfregue a região cirúrgica três vezes com clorexidina. Agora, faça uma laparotomia da linha média da região púbica para a xifóide e amplie a incisão subcostalmente para ambos os lados para obter uma melhor visão do campo operatório. Em seguida, exteriorize as vísceras para o lado esquerdo e injete heparina na veia cava infrarrenal.
Na próxima etapa, identifique a aorta abdominal proximal ao cruzamento da veia renal esquerda, mine a aorta e amarre-a nesse ponto. Agora, vá para o hilo do fígado, identifique e disseque o ducto biliar comum próximo ao fígado e ligue-o perto do pâncreas. Finalmente, faça o transeccionamento do ducto colédoco acima da ligadura.
Em seguida, disseque a veia porta perto do fígado para obter comprimento suficiente para uma anastomose venosa. Como dica, deixe um pequeno pedaço de fígado na veia porta para facilitar a identificação posterior. Em seguida, minar a veia renal esquerda no tecido periaórtico e ligá-la.
Em seguida, faça o transecto da veia renal e do tecido periaórtico, permanecendo do lado direito da ligadura. Em seguida, disseque sem rodeios a aorta abdominal do tronco celíaco para o diafragma, mine a aorta perto do diafragma e atravesse-a nesse ponto. Em seguida, identifique e coagule todos os ramos lombares e faça o transecto.
Agora transeccione a aorta sob a ligadura previamente definida. Agora perfunda o pâncreas através do adesivo aórtico com solução de perfusão gelada até ver o efluente saindo da veia porta. Na parte superior você pode ver a veia porta perfundida e abaixo da aorta perfundida.
Agora substitua as vísceras na cavidade peritoneal e separe o pâncreas do intestino usando 8-0 ligaduras de seda. A partir da região pós-pilórica, minar o duodeno duas vezes e puxar 8-0 ligadura de seda através dele. Em seguida, ligue-o e separe nitidamente o pâncreas do duodeno.
Essa abordagem é realizada repetidamente até atingir o ligamento de Treitz. É essencial não danificar o duodeno, pois isso excluiria o enxerto dos experimentos devido à possível contaminação. Depois que o pâncreas estiver completamente separado do duodeno, vá para o mesentério, mine-o e ligue-o e, em seguida, corte-o.
Em analogia com as etapas anteriores, separe o pâncreas do cólon transverso, minando-o, ligando-o e, finalmente, cortando-o. Agora, usando a mesma abordagem, separe o pâncreas da região biliar, dissecando-o nitidamente após a ligadura. Posteriormente, disseque sem rodeios o pâncreas do estômago.
Identifique a artéria gástrica esquerda, ligue-a e corte-a. No final, remova o pâncreas com o baço anexado e coloque-o em solução de reperfusão gelada até a implantação. Use o baço como alça.
Em analogia ao doador, anestesiar o animal receptor com uma injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina e raspar a região cervical. Em seguida, colocar o animal doador no campo operatório em decúbito dorsal e esfregar a região cervical três vezes com clorexidina. Em seguida, faça uma incisão na pele da incisão jugular até o ângulo mandibular direito.
Em seguida, identifique todos os ramos laterais da veia jugular externa direita, mobilize-os, mine-os e divida-os após a coagulação bipolar. Em seguida, segure o polo inferior da glândula submandibular direita, levante-a cranialmente e disseque-a após a coagulação bipolar de seus vasos de alimentação. Agora transeccione todos os ramos mediais da veia jugular externa direita após a coagulação bipolar.
Ligue a veia jugular externa duas vezes mais cranialmente possível e divida-a entre as ligaduras. Passe a extremidade proximal da veia jugular externa através de um manguito de polietileno. Aqui é importante que a alça do manguito fique voltada para o cirurgião operador.
Como próximo passo, coloque a pinça venosa microvascular vinda do lado lateral. Agora umedeça a veia com heparina, remova a ligadura e puxe suavemente a veia sobre o manguito de polietileno. No final, fixe a veia sobre o manguito com um 8-0 circular ligadura de seda com um nó nas costas e três na frente.
Para obter acesso à artéria carótida comum direita, mobilize e faça a transsecção do músculo esternocleidomastóideo direito após a coagulação proximal e distal. Em seguida, mobilize suavemente a artéria carótida comum, tomando cuidado para não prejudicar as estruturas adjacentes, como o nervo vago. Em analogia com a veia, ligue a artéria carótida comum duas vezes, o mais cranialmente possível, e divida-a entre as ligaduras.
Agora passe o vaso pelo manguito arterial. Por fim, fixe o manguito arterial com a pinça microvascular, vinda do lado medial. Em seguida, remova a ligadura e alargue o lúmen da artéria usando dilatadores de vasos.
Após alargamento suficiente do lúmen, puxe a artéria sobre o manguito arterial. No final, em analogia com a veia, fixe a artéria com o 8-0 ligadura de seda. Aqui você pode ver a veia e a artéria reparadas para anastomose venosa arterial.
Para implantação, coloque o enxerto em um Ace umedecido na região cervical. Em seguida, puxe a veia porta através de um 8-0 laço de ligadura de seda, encurte a veia para uma anastomose sem tensão e, em seguida, puxe a veia porta sobre o manguito venoso. Finalmente, fixe a veia com um 8-0 circular ligadura de seda.
Em analogia com a veia, passe o coto aórtico por uma alça de ligadura e encurte a aorta. Em seguida, puxe a aorta sobre o manguito arterial e, finalmente, fixe-a com um 8-0 circular ligadura de seda. Antes da reperfusão, identifique os vasos esplênicos e ligue-os e, finalmente, disseque-os bruscamente e remova o baço.
Para a reperfusão, remova primeiro a pinça venosa, seguida pela pinça arterial. Uma reperfusão adequada do enxerto mostra uma pulsação visível da artéria e uma cor rosada de todo o enxerto. Umedeça o enxerto com solução salina normotérmica.
Antes do fechamento da ferida, remova a alça do manguito venoso para evitar uma torção do vaso. No final, feche a ferida com sutura contínua 6-0 e injete 0,5 mililitros de solução salina normotérmica por via subcutânea. Para validar o modelo, testamos a função endócrina do pâncreas transplantado.
Os camundongos foram hipoglicêmicos por pré-tratamento com estreptozotocina quatro dias antes da cirurgia e foram considerados hipoglicêmicos se os níveis de glicose no sangue estivessem acima de 300 miligramas por cento. Esta foto mostra os níveis de glicose no sangue de camundongos controle vivos não transplantados em vermelho, bem como de receptores de enxertos não expostos a tempo prolongado de isquemia fria em azul. Além disso, os níveis glicêmicos de receptores de enxertos pancreáticos expostos a 16 horas de tempo de isquemia fria são mostrados em verde.
Os camundongos vivos permaneceram hipoglicêmicos durante todo o período de observação. Em contraste, o transplante de enxertos pancreáticos não expostos a um tempo prolongado de isquemia fria resultou em glicemia normal em 24 horas, confirmando a função endócrina do enxerto. O transplante de enxertos expostos a 16 horas de tempo de isquemia fria não restaurou a glicemia normal aos receptores.
Ainda mais, neste grupo, todos os camundongos tiveram que ser sacrificados em 48 horas devido à lesão de isquemia e reperfusão associada a danos precoces no enxerto. Neste vídeo, apresentamos um método para transplante de pâncreas em camundongos usando uma técnica de manguito sem sutura. Isso é técnica e microcirurgicamente viável com excelentes taxas de sucesso.
No entanto, dada a fibrose progressiva do pâncreas, devido à oclusão do ducto, é nossa opinião que este modelo é mais adequado para áreas de pesquisa com foco no dano do enxerto associado à lesão de isquemia reperfusão mais precoce.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para um modelo de transplante de pâncreas murino utilizando uma técnica de luva sem sutura. Este método é particularmente útil para o estudo da lesão por isquemia-reperfusão e seu impacto na viabilidade do enxerto.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia do Transplante
- Lesão por Isquemia-Reperfusão
- Modelos em Camundongos
Antecedentes
- Enxertos pancreáticos são suscetíveis a lesão por isquemia-reperfusão.
- Essas lesões podem levar à perda precoce do enxerto.
- Compreender esses mecanismos é crucial para melhorar os resultados do transplante.
- Este estudo apresenta uma técnica cirúrgica inovadora para facilitar a pesquisa nesta área.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um modelo confiável em camundongo para transplante de pâncreas.
- Analisar danos precoces no enxerto decorrentes da lesão por isquemia-reperfusão.
- Aprimorar técnicas cirúrgicas que possam melhorar a sobrevida do enxerto.
Métodos Utilizados
- Preparação do camundongo doador com anestesia e limpeza do local cirúrgico.
- Laparotomia mediana para acesso aos órgãos abdominais.
- Isolamento e perfusão do pâncreas antes do transplante.
- Preparação do camundongo receptor e anastomose vascular utilizando técnica de cânula.
Resultados Principais
- Estabelecimento bem-sucedido de um modelo de transplante de pâncreas.
- Demonstração da técnica de manga sem sutura para conexões vasculares.
- Observações iniciais da viabilidade do enxerto após o transplante.
- Potencial para estudos adicionais sobre os efeitos da lesão por isquemia-reperfusão.
Conclusões
- A técnica de cânula sem sutura é eficaz para transplante de pâncreas em camundongos.
- Este modelo pode ser utilizado para estudar os mecanismos de lesão do enxerto.
- Pesquisas futuras podem levar a estratégias aprimoradas para a preservação do enxerto.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite o transplante reprodutível de pâncreas murino com altas taxas de sucesso, apoiando estudos mecanicistas da lesão por isquemia-reperfusão na falha do enxerto. A técnica de luva sem sutura reduz complicações trombogênicas, melhorando a perviedade e a confiabilidade para avaliação pré-clínica de estratégias de preservação do enxerto. Ele fornece uma plataforma escalonável para validação de alvos na biologia do transplante, particularmente para mecanismos precoces de dano ao enxerto.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas às vias de isquemia-reperfusão em enxertos pancreáticos.
- Valor Operacional: Fornece um sistema biologicamente relevante para validação funcional de alvos com taxa de sucesso superior a 90%.
- Valor Preditivo: Apoia o desenvolvimento de modelos pré-clínicos para desmistificação mecanicista de intervenções de preservação de enxertos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera enxertos padronizados e prontos para reperfusão para avaliação quantitativa da integridade e função vascular.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade do ensaio por meio de anastomose consistente com suporte de cânula e altas taxas de perviedade.
- Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma em múltiplos grupos experimentais devido à simplicidade e robustez do procedimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Modela danos precoces no enxerto relevantes para a lesão clínica por isquemia-reperfusão no transplante pancreático humano.
- Alinhamento de Biomarcadores: Permite a avaliação da restauração da função endócrina como biomarcador translacional da viabilidade do enxerto.
- Avanço Ajustado ao Risco: Possibilita a discriminação entre enxertos com e sem exposição prolongada à isquemia fria para decisões de prosseguimento ou não.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até o aperfeiçoamento do modelo pré-clínico, permitindo especificamente a avaliação de estratégias de preservação de enxertos vasculares antes da identificação do composto líder.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre mecanismos moleculares de danos precoces no enxerto após a reperfusão.
- Triagem: Oferece conexões vasculares prontas para ensaios com resultados quantitativos sobre o sucesso da reperfusão e a perviedade do enxerto.
- Análises: Fornece pontos finais mensuráveis, como visibilidade da reperfusão, coloração do enxerto e restauração glicêmica, para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica por meio da avaliação da função endócrina em modelos receptores diabéticos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma cirúrgica reutilizável para testes iterativos de compostos citoprotetores ou anti-inflamatórios em contextos de transplante.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista em modelos de lesão por isquemia-reperfusão.
- Valor Operacional: Oferece padronização, reprodutibilidade e escalabilidade em anastomoses vasculares microcirúrgicas.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de prosseguimento ou interrupção e reduz riscos biológicos em estágios avançados em programas de transplante.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos à preservação de enxertos com base em desfechos funcionais de reperfusão.
Considerações de Implementação
- Exige experiência microcirúrgica em dissecação vascular, ligadura e manipulação de cânulas.
- Depende de instrumentos de precisão, incluindo dilatadores vasculares, pinças microvasculares e ferramentas para sutura.
- Necessita de protocolos padronizados de perfusão e reperfusão entre as equipes operadoras.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes linhagens murinas e tamanhos de enxerto.
- Limitado à pesquisa de isquemia-reperfusão devido à fibrose relacionada à obstrução ductal em enxertos de longo prazo.
