Name: Modelo do rato para transplante de pâncreas, usando uma técnica modificada do manguito (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Aprenda o modelo de transplante de pâncreas em camundongos usando técnica de manguito sem sutura. Este método permite estudar lesões por isquemia-reperfusão e viabilidade do enxerto em pesquisa de biologia de transplantes.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios #2008-1-596 e #UNI-0404/1956 do "Tiroler Wissenschaftsfonds (TWF)" (https://www.tirol.gv.at/en/) e pela concessão #2013-042018 do "Förderungsprogramm de MUI-Start" da universidade médica Innsbruck.

A fim de evitar respostas alloimmune e estritamente investigar danos de enxerto relacionadas com lesão de reperfusão de isquemia, um syngeneic par doador-receptor deve ser usado. Neste protocolo, machos C57BL6 (H2b) 10-12-semanas ratos pesando 26 a 28 g foram usados como pares de doador-beneficiário de tamanho correspondente. Todos os animais foram alojados em uma instalação livre de patógeno de barreira e receberam atendimento humano em conformidade com os "princípios de laboratório Animal cuidados" formulado pela sociedade nacional para a pesquisa médica e o "guia para o cuidado e uso de animais de laboratório" preparado pela Academia Nacional de Ciências e publicado pela National Institutes of Health (NIH publicação n º 86-23, revista em 1985). Ministério da educação, ciência e cultura da Áustria aprovou os experimentos descritos neste manuscrito (BMWF-66.011/0056-II/3b/2011).
1. pâncreas Procurement
<ol>
	<li>Anestesia o animal dador com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de xilazina (5 mg/kg de peso corporal) e cetamina (100 mg/kg de peso corporal) usando uma agulha (G) 27.</li>
	<li>Raspar o cabelo na região abdominal, usando um barbeador elétrico e consertar o mouse sobre o campo operatório em posição supina com fios de fita.</li>
	<li>Esfregue o campo operatório três vezes com gazes encharcada de clorexidina.</li>
	<li>Realize uma incisão abdominal com uma extensão de subcostal bilateral usando a tesoura. Delicadamente exteriorize as vísceras para a esquerda com varas de algodão estéril e embrulhe-as em uma gaze umedecida. Levante o xyphoid cranialmente com uma pinça mosquito para fornecer a máxima exposição da cavidade abdominal para as etapas seguintes.</li>
	<li>Usando uma agulha de 19g, injete 400 µ l de uma estéril, solução de cloreto de sódio-heparina 1:4 para heparinisation para a veia cava inferior (VCI). Depois de retirar a agulha, abater o animal por sangria cruza da aorta.</li>
	<li>Disse a aorta abdominal entre a origem da artéria mesentérica superior e a artéria renal direita separando delicadamente o tecido fibroso, usando pinça de ponta curva. Minar a aorta e amarrá-lo com uma ligadura de seda 8/0.</li>
	<li>Identifica o ligamento hepatoduodenal, que corre entre o pós-pilórico duodeno e o Hilo do fígado. Dividir o ducto biliar abaixo da entrada do ducto cístico após ligadura distal e suavemente dissecar e transecto a veia porta mais distalmente possível ter comprimento suficiente para realizar a anastomose do receptor.</li>
	<li>Usando pinças de ponta curvada, sem rodeios a dissecar a aorta abdominal a partir a ligadura anterior (consulte a etapa 1.6). Minar o tecido periaortic usando pinça de ponta curva, amarrá-lo com uma ligadura de seda 8/0 e transecto-lo com uma tesoura.<ol>
		<li>Usando a pinça bipolar, coagulam todos os seus ramos lombares e transecto a aorta com tesoura tão perto quanto possível para o diafragma, a fim de proporcionar suficiente comprimento para anastomose de vasos. Finalmente, transeção da aorta já amarrada acima da artéria renal esquerda.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfundir o pâncreas com uma seringa de 19 G com 5 mL de solução de perfusão de histidina-triptofano-cetoglutarato 4 ° C em uma forma de hemorragias anterógradas através da aorta abdominal, até que haja um claro efluente proveniente da veia porta. Aplique pressão baixa para evitar a formação de edema. Nota: Para executar etapas 1.5 1.9 de forma rápida e padronizada, para evitar qualquer viés por deterioração isquêmica quente do enxerto recuperado.</li>
	<li>Substitua as vísceras na cavidade peritoneal, usando varas de algodão estéril.</li>
	<li>Usando pinças de ponta curvada, separe o pâncreas gradual a partir do duodeno pós-pilórico e avançar até atingir o ligamento de Treitz. Para estas etapas, identifica áreas de avascular do tecido conjuntivo entre o pâncreas e a parede duodenal.<ol>
		<li>Sem rodeios disse estas áreas usando pinça de ponta curva para isolar navios de pontes entre o pâncreas e o duodeno. Passar uma ligadura de seda 8/0 em torno de cada estrutura vascular isolada e amarrá-lo.</li>
		<li>Finalmente, transecto a estrutura vascular com tesoura em direção à parede duodenal. Da mesma forma, use uma sutura de seda 8/0 para separar o pâncreas, o estômago, o cólon transverso e o mesentério. Nota: Durante este procedimento, ducto pancreático-choledocho é ligado.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identifica o ligamento gastroesplênico correndo do baço para o estômago e os curtos Ramos gástricos, levantando o estômago cranialmente e cortá-lo com uma tesoura. Deixe o baço anexado ao enxerto recuperados. Nota: A fim de minimizar o reaquecimento do enxerto, irriga o pâncreas continuamente, utilizando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 19g com a solução de perfusão de histidina-triptofano-cetoglutarato frio armazenada no gelo.</li>
	<li>Finalmente, remova o pâncreas do local doador (figura 1B), agarrando o baço com fórceps e transferi-lo para o destinatário.<ol>
		<li>Como alternativa, para desencadear a lesão de reperfusão de isquemia severa, armazene o enxerto em estéril, solução de perfusão de 4 ° C durante 16 h antes de implantar isso no animal destinatário.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. destinatário preparação
<ol>
	<li>Anestesia o animal destinatário com uma injeção i.p. de xilazina (5 mg/kg de peso corporal) e cetamina (100 mg/kg de peso corporal) usando uma agulha 27G.</li>
	<li>Raspar a região cervical lateral direita, usando um barbeador elétrico e coloque o mouse sobre o campo operatório em posição supina. Corrigi o mouse usando fios de fita. Evite a distensão excessiva dos membros dianteiros para evitar comprometer a respiração.</li>
	<li>Esfregue o campo operatório três vezes usando gazes encharcada de clorexidina.</li>
	<li>Fazer uma paramediana direita, incisão de pele ligeiramente oblíqua da jugular incisão para o ângulo da mandíbula direita.</li>
	<li>Sem rodeios, identificar e mobilizar os ramos laterais da veia jugular externa direita. Coagulá-los com pinça bipolar e transecto-los com uma tesoura.</li>
	<li>Levante o lobo direito da glândula salivar submandibular cranialmente, identificar o pedículo vascular e cauterizar usando pinça bipolar. Remova o lobo, cruza o pedículo cauterizado com uma tesoura.</li>
	<li>Em analogia ao passo 2.5, identificar todos os ramos medial da veia jugular externa, cauteriza-los com pinça bipolar e transecto-los com uma tesoura.</li></ol>Minar a veia jugular externa com a pinça de ponta curva como cranialmente quanto possível e ligam com ligaduras seda dois 8/0, deixando espaço suficiente entre as ligaduras.
	<li>Transecto a veia jugular externa entre as duas ligaduras previamente colocadas com uma tesoura reta.</li>
	<li>Passe a extremidade proximal da veia jugular externa através da braçadeira de polietileno (diâmetro interno de 0,75 mm, diâmetro externo de 0,94 mm) e consertar o puxador do manguito com uma pinça de microhemostat venosa.</li>
	<li>Retire o laço na extremidade do coto navio e evert o navio sobre o manguito. Fixe a veia sempre no punho com uma circular 8/0 - seda ligadura (figura 1A).</li>
	<li>Proximal e distal cauterizar a parte superficial do músculo esternocleidomastoideo direito, transecto-lo com uma tesoura e removê-lo.</li>
	<li>Suavemente mobilize a artéria carótida comum, miná-lo abaixo da bifurcação e ligate duas vezes, tendo o cuidado de não amarrar a bifurcação carotídea. Corte o vaso entre os laços.</li>
	<li>Semelhante ao passo 2.9, passar a extremidade proximal da artéria carótida comum através da braçadeira de poliamida (diâmetro interno de 0,57 mm, diâmetro externo de 0.6 mm) e corrigi-lo com uma pinça arterial microvascular.</li>
	<li>Remover a ligadura na extremidade do coto vascular e gentilmente ampliar o lúmen usando dilatadores de vaso. Evert o navio sobre a braçadeira de pulso arterial e corrigi-lo com uma ligadura de seda 8/0 (figura 1A).</li>

3. a implantação
<ol>
	<li>Lugar o enxerto na região de pescoço do destinatário usando o baço como uma alça, com a cabeça voltada para lateralmente, a cauda incluindo o baço medialmente e os navio tocos ventro-caudalmente. Varas de algodão de uso para posicionar o enxerto corretamente.</li>
	<li>Encoste suavemente a veia porta do enxerto pancreático veia jugular externa do animal destinatário, o qual tem sido anteriormente revirada, e fixa-se na braçadeira apropriada (consulte a etapa 2.10). Corrigi-lo com uma ligadura de seda circular 8/0.</li>
	<li>Encoste o coto da aorta abdominal do enxerto para a artéria carótida comum sempre do destinatário animal. Corrigi-lo com uma ligadura de seda 8/0 e circunferencial (Figura 1).</li>
	<li>Identificar os vasos esplênico perto do hilo do baço e enfraquecê-los com pinça de ponta curva. Amarre-os com ligaduras seda 8/0 e transecto os vasos esplênico para remover o baço. Finalmente, encurte os laços.</li>
	<li>Usando uma pinça aplicando fórceps, remova a braçadeira a braçadeira venosa primeiro. Em seguida, retire a pinça arterial. Nota: Se o transplante foi um sucesso, o enxerto pancreático vai ser perfundido imediatamente, mostrando uma cor rosada homogénea e pulsação arterial visível (Figura 1).</li>
	<li>Umedeça o enxerto com solução salina normotérmico.</li>
	<li>Retire o cabo da braçadeira venosa utilizando pinça reta.</li>
	<li>Feche a ferida cirúrgica com uma execução sutura 6/0.</li>
</ol>
4. pós-operatório cuidados (Endpoint)
<ol>
	<li>Após o procedimento, aplicam-se a 0,5 mL de solução salina por via subcutânea (s.c.) para substituição da perda de líquidos no intra-operatório utilizando uma agulha de 19g.</li>
	<li>Manter o animal destinatário em uma almofada de aquecimento até a completa recuperação da anestesia.</li>
	<li>Uma vez acordada, retornar o destinatário animal para a instalação de habitação, onde pode ter comida e água ad libitum.</li>
	<li>Para evitar a dor pós-operatória, administrar logo após a operação (1) Buprenorphin (0,1 mg/kg de peso corporal) cada 12 h para os 5 primeiros dias e carprofeno (2) 4 mg/kg de peso corporal cada 12 h s.c. na primeira semana.</li>
	<li>A fim de avaliar a ingestão nutricional adequada, monitorar o peso (g) de cada destinatário animal todos os dias. Uma perda de peso de mais de 10-15% em relação ao peso no dia da cirurgia, apatia, incapacitante, uma muito curvado para trás, bem como infecções cirúrgicas lado representam pontos de extremidade.<ol>
		<li>Neste caso, bem como depois de atingir o ponto de extremidade clínico, sacrifica o animal usando terminal isoflurano inalação.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

IRI-associada a enxerto dano é inerente à transplantação de órgãos sólidos, e é caracterizada por um distúrbio da microcirculação. Acumulação de vários metabólitos fase isquêmica, e iniciação de cascatas inflamatórias mediada principalmente por espécies reactivas do oxigênio e nitrogênio, resulta em danos nos tecidos durante de reperfusão do enxerto4. Esta cascata pode comprometer o sucesso não só a curto prazo, mas também a longo prazo e, portanto, significativamente influências de sobrevivência de pacientes14. Até à data, o transplante de pâncreas rim combinado representa a terapia de escolha para pacientes que sofrem de tipo 1 diabetes com final de doença renal de estágio15. Vários estudos têm mostrado que um transplante de pâncreas rim combinado bem sucedida não apenas restaurar e proteger a função do enxerto renal em pacientes diabéticos, mas também estabiliza ou mesmo reverte as complicações secundárias, incluindo a neuropatia, bem como micro e macroangiopatia16,17,18.
Apesar de esforços contínuos em substituição, redução e refinamento (3 R) em pesquisas com animais, a reprodução de complexos processos fisiopatológicos, como IRI é meramente impossível nas configurações em vitro . Portanto, os modelos animais ainda são considerados para ser a ferramenta ideal para investigação de translação19,20. Modelos de mouse, como o descrito aqui tem várias vantagens em comparação com o rato ou outro animal modelos. Estes incluem a disponibilidade de uma vasta quantidade de cepas de rato puras geneticamente bem definida (por exemplo, cepas transgênicas e knock-out), uma infinidade de ferramentas de análise molecular, bem como um fácil e barato tratamento21. Uma grande vantagem do modelo descrito encontra-se na técnica não-sutura do manguito. Usando a técnica aqui apresentada, as taxas de sucesso de &#62; 90% são realizáveis, que é dramaticamente melhor em relação ao anteriormente descrito modelos22. Usando esta técnica de sutura não, reduzimos significativamente comuns complicações como choque hipovolêmico, trombose e estenose das anastomoses12. Uma vantagem adicional desse método consiste em posição abdominal extra do enxerto, que é associado com a rápida recuperação pós-operatória do destinatário. Além disso, a localização cervical torna perfeitamente adequado para na vivo de análise, como a imagem ao vivo do enxerto por exterioration sem qualquer tensão22.
A principal desvantagem deste modelo é a oclusão do ducto pancreático, que não se assemelham a realidade clínica. Neste modelo, drenagem exócrina é gerida pela subordinação ducto pancreático-choledocho. A longo prazo, isso resulta em um marcado de fibrose e atrofia da glândula sem levando a pancreatite22do enxerto. Devido a esta deterioração do tecido exócrino, que observamos mais cedo, no dia 30, após o transplante, acreditamos que este modelo não é adequado para observação de prazo longo. Em contraste, a função endócrina inquebrantável faz gylcemic controles do destinatário uma ferramenta fácil para avaliação diária da função do enxerto13,23,24.
Estas características isso torna um modelo ideal para a análise de lesões de enxerto precoce associados com períodos longos de preservação ou com técnicas e soluções diferentes de preservação. Para alcançar os melhores resultados com este modelo, devem considerar-se várias etapas cruciais. O pâncreas em si é muito suscetível à manipulação. Portanto, suave manipulação usando varas de algodão durante a recuperação do órgão e durante o implante minimiza o trauma mecânico. Agarramento direto da glândula com a pinça deve ser evitado, desde que inevitavelmente resultaria em danos graves de enxerto. Pela mesma razão, o baço é recuperado juntamente com o pâncreas e é usado como um identificador. Isto também é estabelecido na prática clínica. Uma armadilha mais envolve perfusão fria, que é conseguida pela perfusão através da aorta tronco usando solução de perfusão de histidina-triptofano-cetoglutarato de 4 ° C. Por este meio, um aumento excessivo da glândula pode ser evitado pelo perfusing suavemente o enxerto. A solução de perfusão restante deve ser usada para umedecer o enxerto, a fim de manter a sua temperatura baixa durante a recuperação do órgão.
No que respeita à preparação destinatário uma dissecção cuidadosa da veia jugular externa, bem como a artéria carótida comum define a base para o revascularisation bem sucedida. Em particular, a completa exposição da veia, removendo não só todos os afluentes, mas também do tecido adiposo circundante, é necessário para evitar a compressão externa e estenose pelo restante de tecido adiposo. A seleção de diâmetros o manguito adequado é crucial. Um diâmetro interno de 0,57 mm para a braçadeira de pulso arterial e entre 0,75 e 0,8 mm para a braçadeira venosa, com base na experiência partilhada, para ratos com peso entre 25 a 28 g, é apropriado. Precisos, corte limpo das bordas das algemas é obrigatória para evitar rasgar o coto do navio. Dilatação dos vasos, especialmente das artérias, é conseguida melhor com o uso de dilatadores de vaso com dicas bem. Como regra geral, o navio deve ser capaz de ampliar para duas vezes o lúmen do manguito. Durante o processo de eversão do navio sobre e corrigi-lo na braçadeira, recomendamos estabilizar pinças vasculares, colocando-os sob uma aba de pele, como isso facilita esta etapa crucial.
Como já mencionado, a não-sutura do manguito-técnica representa um método fácil para anastomose vascular e pode ser realizada dentro de 5 min. No entanto, o posicionamento correto do enxerto na região do pescoço do destinatário é de extrema importância para revascularização correta. Por este meio, o posicionamento final correto do enxerto na região do pescoço deve ser prevista a fim de permitir uma anastomose segura, em linha reta e sem tensão de veia e artéria. Navios que são muito longos tem que ser evitada, pois isso pode levar à obstrução de saída devido a formação de dobras. Pela mesma razão, o manguito-identificador na anastomose venosa também deve ser removido após a reperfusão. Em casos de hemorragias localizadas do enxerto pancreático, hemostasia bem sucedida pode ser conseguida comprimindo suavemente o lado sangramento por 5 min, usando varas de algodão. Esta é a maneira apenas bem sucedida para gerenciar este tipo de complicação.Cauterização, embora altamente seletiva, resultou na perda do enxerto em quase todos os casos, devido à pancreatite necrótica.
Em resumo, nós desenvolvemos um método para transplante de pâncreas em ratos, usando uma técnica não-sutura do manguito, que é tecnicamente viável e hipoglossal e tem taxas de sucesso excelente. Dada a fibrose progredient do pâncreas devido a oclusão do duto, este modelo é adequado melhor para áreas de pesquisa focando danos precoce do enxerto. Este manuscrito destina-se a permitir que os investigadores estabelecer com segurança Este modelo em seus laboratórios.

Transplante de pâncreas-rim simultâneo (SPK) representa o atual padrão de atendimento para pacientes que sofrem de diabetes mellitus e final doença renal. Transplante bem sucedido resulta em independência de insulina a longo prazo associada com estabilização ou mesmo regressão de microangiopatia diabética e uma melhor qualidade de vida1. No entanto, em contraste com outros transplantes de órgãos sólidos comuns, como rim e transplante hepático, pancreáticos enxertos são mais suscetíveis à lesão de isquemia reperfusão (IRI). Incidência relatada de até 35% em risco não só de enxerto, mas mesmo paciente, sobrevivência2,3.
Estresse oxidativo, transtornos microcirculatory, aumento da expressão de citocinas pró-inflamatórias e moléculas de adesão resultando finalmente na ativação endotelial e a perda de sua integridade, todos foram atribuídos para esta lesão do enxerto alogênico não 4. até agora, os mecanismos moleculares exatos do IRI são em grande parte desconhecidos e pode variar de órgão para órgão.
Apesar dos grandes progressos utilizando modelos em vitro , o desenvolvimento de modelos animais é fundamental para aprofundar o conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos nas alterações de IRI-associado do enxerto após transplante de pâncreas. Foram desenvolvidos vários modelos de transplante de pâncreas em roedores5,6, mas o único que é relatado em ratos7. O calcanhar de Aquiles esta altamente exigentes de procedimento microcirúrgico é a taxa de sobrevivência baixa de 46%. No entanto, modelos de rato representam o melhor modelo para a investigação relacionada com o transplante, desde a mais ampla variedade de ferramentas de análise molecular pode ser aplicada a eles. Com base na vasta experiência microcirúrgica em camundongos com transplantes de órgãos diferentes8,9,10, desenvolvemos uma técnica nova, altamente reprodutível para pâncreas heterotópica, cervical transplante em ratos com &#62; 90% taxa de sucesso usando uma técnica não-sutura do manguito. Com esta técnica, complicações relacionadas com anastomoses são reduzidas ao mínimo, e uma elevada taxa de sucesso pode ser alcançada em comparação com a sutura modelo11. Até agora, apenas um modelo do rato com taxas de sucesso semelhantes tem sido descrito por Liu et al.12. No entanto, não há nenhum estudo publicado utilizando este modelo até agora.

<table><tbody><tr><td>Adventitia Tesoura</td><td>S & T</td><td>S-00102</td><td>Pinça</td></tr><tr><td>Reta Dumont # 7 FST</td><td></td><td>&nbsp; 11271- 30</td><td>Ponta Curva 0,17 x 0,1 mm</td></tr><tr><td>Yasargil Clip Mini Permanente 7mm</td><td>Aesculap</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>Micro vaso</td><td>clipe S & T</td><td>B1 00396 V</td><td></td></tr><tr><td>Dilatador de vaso</td><td>S& T</td><td>D-5a.2, 00125</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de grampos</td><td>S & T</td><td>CAF-4 00072</td><td>para manguito venoso</td></tr><tr><td>Aplicador de clipe</td><td>Aesculap</td><td>FE572K&nbsp;</td><td>para o manguito arterial</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>Portex Ltd</td><td></td><td>Diâmetro interno 0,75 mm para manguito venoso</td></tr><tr><td>Tubo de poliamida</td><td>Vention Medical&nbsp;</td><td>141-0051</td><td>Diâmetro interno 0,8 mm (Alternativa para tubo de polietileno da Portex Ltd)</td></tr><tr><td>Tubo de poliamida</td><td>Vention Medical</td><td>141-0033</td><td>Diâmetro interno 0,57 mm para braçadeira arteriail</td></tr><tr><td>Pinça bipolar</td><td>Micromed</td><td>140-100-015</td><td></td></tr><tr><td>8/0 ligaduras de seda</td><td>Catgut GmbH, Merkuramed</td><td>17209008</td><td></td></tr><tr><td>Solução Custodiol HTK</td><td>Dr. Franz K&ouml; hler Chemie</td><td>59997</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin Graeub</td><td>aniMedica GmbH</td><td>32554</td><td></td></tr><tr><td>Xylasol Graeub</td><td>aniMedica GmbH</td><td>50855</td><td></td></tr></tbody></table>

modelo do rato para transplante de pâncreas, usando uma técnica modificada do manguito

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Modelos de mouse tem várias vantagens em pesquisa de transplante, incluindo a manipulação fácil, uma variedade de cepas geneticamente bem definidas e a disponibilidade da mais ampla gama de sondas moleculares e reagentes para executar na vivo , bem como em Vitro estudos. Baseado em nossa experiência com vários modelos de transplante murino, desenvolvemos um modelo de transplante heterotópico pâncreas em ratos com a intenção de analisar os mecanismos subjacentes grave isquemia reperfusão associada a lesão precoce enxerto danos. Em contraste com anteriormente descritas técnicas usando técnicas de sutura, neste documento descrevemos um novo procedimento usando uma técnica não-sutura do manguito.
Nos últimos anos, realizamos mais de 300 transplantes de pâncreas em ratos com uma taxa de sucesso global de &gt; 90%, uma taxa de sucesso nunca descrito antes no transplante de pâncreas de rato. A espinha dorsal desta técnica de sutura não braçadeira para revascularização do enxerto consiste de duas etapas principais: (I) encostando o navio recebedor um manguito de polietileno-poliamida e corrigi-lo com uma ligadura circunferencial e (II) do navio dador, colocando sobre o revirado navio recebedor e corrigi-lo com uma segunda ligadura circunferencial. A continuidade resultante dos resultados em menos lesões trombogénico com perviedade alta camada endotelial e, finalmente, altas taxas de sucesso.
Neste modelo, anastomose arterial é conseguido puxando a aorta abdominal do enxerto doador sobre a artéria carótida comum sempre do destinatário animal. Drenagem venosa do enxerto é conseguida encostar a veia porta do enxerto da veia jugular externa sempre do destinatário. Este manuscrito fornece detalhes e etapas cruciais da recuperação do órgão e os procedimentos de implantação do órgão, que permitirão que os investigadores com habilidades microcirúrgicos realizar o transplante com sucesso em seus laboratórios.

Na última década, foram realizadas mais de 300 transplantes de pâncreas em ratos. Depois de estabelecer o protocolo, houve uma sobrevida global de &#62; 90%. Sangramento pós-operatório foi a principal causa de falha, seguida de trombose do enxerto com pancreatite subsequentes enxerto necrótico letal. Em ambos os casos, os pontos de extremidade foram alcançados em 24 h e os animais foram sacrificados. Não havia qualquer doenças neurológicas, sintomas como disfagia e infecções cirúrgicas lado nesta série.
Para investigar a função endócrina de enxertos transplantados e, portanto, validar a patência do modelo, a hiperglicemia foi induzida em ratos destinatários pelo pré-tratamento com uma única dose de estreptozotocina intraperitonealmente aplicada (312,5 mg/kg de peso corporal) 4 dias antes da cirurgia. Foram considerados os ratos hiperglicêmicos se os níveis de glicose no sangue foram &#62; 300 mg/dL. Figura 2A mostra os níveis de glicose do sangue dos diferentes grupos. Ratos recebendo enxertos sem um tempo de isquemia fria prolongada de 16 h chegaram a normogylcemia dentro de 24 h após o transplante e mantiveram neste estado metabólico durante o período de observação de todo. Em contraste, os animais não-transplantados permaneceram hiperglicêmicos. Uma vez que estávamos interessados no impacto dos danos de enxerto associada a lesão de reperfusão de isquemia na função endócrina, adicionamos um terceiro grupo onde os enxertos foram expostos 16 h prolongado tempo de isquemia fria (CIT) e 45 min de tempo de isquemia quente (WIT). Ratos recebendo esses enxertos não chegou normoglycemia e tinham que ser sacrificado após 48 h, devido ao desenvolvimento de pancreatite grave, que foi mostrado para ser letal nesta modelo13.
Este modelo é útil para vários projectos que visam investigar a isquemia reperfusão associada a lesão precoce enxerto danos. Investigações incluíam, entre outros, microscopia confocal fluorescência intravital para quantificação de descontroles microcirculatory realizado 2h após o transplante. Contraste de microvessels dos enxertos foi reforçada pela injeção de 0,3 mL de dextrano de isotiocianato de fluoresceína-marcado um 0,4% (MW 150 000) na veia do pênis. Figura 2B exibe um padrão regular de capilar de um pâncreas murino ingênuo e de um enxerto no pâncreas transplantado, que não foi exposto a CIT prolongada (Figura 2). Em contraste, a Figura 2D apresenta a distribuição da microcirculação como resultado expondo o enxerto pancreático para cit prolongada.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54998/54998fig1.jpg"> 
Figura 1 : Fotos intra-operatória. (A) visão intra-operatória dos destinatários vasos preparados para anastomose. A veia jugular externa (1) foi revirada sobre a braçadeira de polietileno venosa e fixada com uma ligadura de seda circular 8/0. Em analogia, a artéria carótida comum (2) foi revirada e fixa sobre a braçadeira de poliamida arterial menor. Escala da barra 1 mm. (B) o enxerto pancreático ex situ. A veia porta (1) e o coto da aorta abdominal (2) necessário para a anastomose vascular. O baço (3) é obtido juntamente com o pâncreas e é usado como um identificador. O baço será removido antes de reperfusão do enxerto. Escala da barra de 1 cm. (C) visão intra-operatória das anastomoses. A veia porta (1) é puxada sobre a braçadeira da veia jugular externa sempre (2) e corrigida com uma gravata de seda circular 8/0. Da mesma forma, o coto aórtico da aorta abdominal (3) é puxado sobre a braçadeira de pulso da artéria carótida comum sempre (4). Escala barra 1 mm. (D) intra-operatória vista do enxerto pancreático perfundido após 5 min reperfusão: após a remoção da veia, seguida pela pinça arterial, um enxerto do pâncreas transplantado com sucesso exibe uma cor rosada homogénea. O baço foi removido antes de reperfusão (1: embarcação esplênica ligada). Escala da barra de 1 cm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54998/54998fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54998/54998fig2.jpg"> 
Figura 2 : Função endócrina do enxerto pancreático e confocal na vivo microscopia de fluorescência. Figura 2A mostra um gráfico de linha com níveis de glicose de ratos transplantados sem CIT (n = 10, PTX sem o CIT, linha azul), ratos não-transplantados (n = 11, nenhum PTX, linha vermelha) e os ratos recebendo enxertos expostos a CIT prolongada (PTX + 16 h CIT, n = 10, linha verde). Todos os destinatários foram previamente processados hiperglicêmicos com 312,5 mg/kg b.w. estreptozotocina i.p. Enquanto todos os destinatários dos enxertos sem CIT foram capazes de sobreviver o período de observação inteiro (50 dias) com função endócrina intacta, ratos transplantados não permaneceram hiperglicêmicos ao longo do período de observação inteira. Ratos recebendo enxertos expostos às 16h CIT não recuperou da hiperglicemia e tinham que ser sacrificado 48 h após a cirurgia de transplante, devido à perda de peso de mais de 10-15%. Ratos para sobreviver o período inteiro de observação foram sacrificados no dia 50 seguindo uma última medição da glicemia. Microcirculação em enxertos transplantados foi avaliada por microscopia confocal de fluorescência intravital 2h após o transplante. Pâncreas ingênuo serviram como controles. Figura 2B mostra um padrão regular de capilar no pâncreas ingênuo. Uma malha regular capilar também é vista em enxertos transplantados não sujeitos a CIT prolongada (Figura 2). Em contraste, um colapso da microcirculação é observado em enxertos transplantados expostos a CIT prolongada (Figura 2D). Escala barra 100 µm. dados no gráfico são expressos como ± desvio-padrão. PTX: transplante de pâncreas; CIT: tempo de isquemia fria; sem o: sem <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54998/54998fig2large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Entre a transplantação de órgãos sólidos abdominal, enxertos pancreáticos são propensos a desenvolver danos de enxerto associada a lesão de reperfusão isquemia severa, levando eventualmente a perda precoce do enxerto. Este protocolo descreve um modelo de transplante de pâncreas murino utilizando uma técnica não-sutura do manguito, ideal para analisar estes danos deletérios, cedo.

Modelo do rato para transplante de pâncreas, usando uma técnica modificada do manguito

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Meu nome é Benno Cardini, do Laboratório de Pesquisa Daniel Swarovski do Departamento de Cirurgia Visceral, de Transplante e Torácica da Universidade Médica de Innsbruck. Hoje, vamos mostrar um modelo de camundongo para transplante de pâncreas utilizando uma técnica de cânula modificada. Anestesie o animal doador com uma injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina, e depile a região abdominal.Em seguida, posicione o receptor em um campo operatório em posição supina e realize a antissepsia da região cirúrgica três vezes com clorexidina. Agora, realize uma laparotomia de linha média da região púbica até o xifoide e alargue a incisão subcostalmente para ambos os lados para obter uma melhor visualização do campo operatório. Em seguida, exteriorize as vísceras para o lado esquerdo e injete heparina na veia cava infrarrenal.No próximo passo, identifique a aorta abdominal próxima à passagem da veia renal esquerda, descole a aorta e amarre-a nesse ponto. Em seguida, dirija-se ao hilo hepático, identifique e dissecione o ducto biliar comum próximo ao fígado e ligue-o próximo ao pâncreas. Por fim, seccione o ducto biliar comum acima da ligadura.Em seguida, dissecar a veia porta próxima ao fígado para obter comprimento suficiente para uma anastomose venosa. Como dica, deixar um pequeno pedaço de fígado aderido à veia porta para facilitar sua identificação posterior. Em seguida, dissecar subcutaneamente a veia renal esquerda no tecido periaórtico e ligá-la.Em seguida, seccione a veia renal e o tecido periaórtico, permanecendo no lado direito da ligadura. A seguir, dissecar rombamente a aorta abdominal do tronco celíaco até o diafragma, destacar a aorta próximo ao diafragma e seccioná-la nesse ponto. Em seguida, identifique e coagule todos os ramos lombares e seccione-os.Agora, seccione a aorta sob a ligadura previamente posicionada. Em seguida, perfunda o pâncreas através do retalho aórtico com solução de perfusão gelada até observar o efluente saindo da veia porta. Na parte superior, é possível visualizar a veia porta perfundida e, abaixo, a aorta perfundida.Agora, reposicione as vísceras na cavidade peritoneal e separe passo a passo o pâncreas do intestino utilizando ligaduras de seda 8-0. A partir da região pós-pilórica, passe a seda 8-0 duas vezes por baixo do duodeno e puxe a ligadura de seda 8-0 através dele. Em seguida, ligue-o e separe cirurgicamente o pâncreas do duodeno.Essa abordagem é realizada repetidamente até alcançar o ligamento de Treitz. É essencial não danificar o duodeno, pois isso excluiria o enxerto dos experimentos devido a possível contaminação. Após o pâncreas ter sido completamente separado do duodeno, passe para o mesentério, soletre-o, ligue-o e, em seguida, seccione-o.Por analogia aos passos anteriores, separe o pâncreas do cólon transverso descolando-o, ligando-o e, finalmente, seccionando-o. Agora, utilizando a mesma abordagem, separe o pâncreas da região biliar disseccionando-o cuidadosamente após a ligadura. Posteriormente, dissecar o pâncreas do estômago por dissecação romba.Identifique a artéria gástrica esquerda, ligue-a e seccione-a. Ao final, remova o pâncreas com o baço anexo e coloque-o em solução de reperfusão gelada até o subsequente implante. Use o baço como alça.Por analogia ao doador, anestesie o animal receptor com uma injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina e depile a região cervical. Em seguida, posicione o animal doador no campo operatório em posição supina e realize a antissepsia da região cervical três vezes com clorexidina. A seguir, faça uma incisão cutânea do ângulo mandibular direito até a incisão jugular.Em seguida, identifique todos os ramos laterais da veia jugular externa direita, mobilize-os, desinsere-os e seccione-os após coagulação bipolar. Depois, segure o polo inferior da glândula submandibular direita, eleve-o cranialmente e dissecione-o após coagulação bipolar dos seus vasos nutridores. Agora, seccione todos os ramos mediais da veia jugular externa direita após coagulação bipolar.Ligue a veia jugular externa duas vezes mais cranialmente quanto possível e seccione-a entre as ligaduras. Passe a extremidade proximal da veia jugular externa através de uma cânula de polietileno. Aqui, é importante que a alça da cânula esteja voltada para o cirurgião operador.Como próximo passo, posicione o clamp microvascular venoso proveniente do lado lateral. Agora umedeça a veia com heparina, remova a ligadura e puxe suavemente a veia sobre o manguito de polietileno. Ao final, fixe a veia sobre o manguito com uma ligadura circular de seda 8-0, com um nó na parte traseira e três na frente.Para obter acesso à artéria carótida comum direita, mobilize e seccione o músculo esternocleidomastoideo direito após coagulação proximal e distal. Em seguida, mobilize cuidadosamente a artéria carótida comum, tomando cuidado para não danificar estruturas adjacentes, como o nervo vago. Por analogia com a veia, ligue a artéria carótida comum duas vezes, o mais cranialmente possível, e seccione-a entre as ligaduras.Agora, passe o vaso através do manguito arterial. Finalmente, fixe o manguito arterial com o clamp microvascular, vindo do lado medial. Em seguida, remova a ligadura e alargue a luz da artéria utilizando dilatadores vasculares.Após a dilatação suficiente da luz, puxe a artéria sobre o manguito arterial. No final, por analogia com a veia, fixe a artéria com a ligadura de seda 8-0. Aqui você pode ver a veia e a artéria reparadas para anastomose arteriovenosa.Para a implantação, posicione o enxerto sobre uma gaze umedecida no região cervical. Em seguida, passe a veia porta através de uma alça de ligadura de seda 8-0, encurte a veia para uma anastomose sem tensão e, a seguir, puxe a veia porta sobre o manguito venoso. Por fim, fixe a veia com uma ligadura circular de seda 8-0.Por analogia com a veia, passe o coto aórtico através de uma laçada de ligadura e encurte a aorta. Em seguida, puxe a aorta sobre a cânula arterial e, finalmente, fixe-a com uma ligadura circular de seda 8-0. Antes da reperfusão, identifique os vasos esplênicos, ligue-os e, por fim, seccione-os com precisão e remova o baço.Para a reperfusão, remova primeiro o clamp venoso, seguido pelo clamp arterial. Uma reperfusão adequada do enxerto mostra uma pulsação visível da artéria e uma coloração rósea em todo o enxerto. Umedeça o enxerto com solução salina normotérmica.Antes do fechamento da ferida, remova o cabo do manguito venoso para evitar uma torção do vaso. Ao final, feche a ferida com sutura contínua 6-0 e injete 0,5 mililitros de solução salina normotérmica por via subcutânea. Para validar o modelo, testamos a função endócrina do pâncreas transplantado.Os camundongos foram tornados hipoglicêmicos por meio de pré-tratamento com estreptozotocina quatro dias antes da cirurgia e foram considerados hipoglicêmicos se os níveis de glicose no sangue estivessem acima de 300 miligramas por cento. Esta linha do gráfico mostra os níveis de glicose no sangue de camundongos controles vivos não transplantados em vermelho, bem como dos receptores de enxertos não expostos a tempo prolongado de isquemia a frio em azul. Além disso, os níveis de glicose no sangue dos receptores de enxertos pancreáticos expostos a 16 horas de tempo de isquemia a frio são mostrados em verde.Os camundongos vivos permaneceram hipoglicêmicos durante todo o período de observação. Em contraste, o transplante de enxertos pancreáticos não expostos a tempo prolongado de isquemia a frio resultou em glicemia normal dentro de 24 horas, confirmando a função endócrina do enxerto. O transplante de enxertos expostos a 16 horas de isquemia a frio não restaurou a glicemia normal nos receptores.Além disso, neste grupo, todos os camundongos precisaram ser sacrificados em até 48 horas devido a lesão precoce do enxerto associada à lesão por isquemia e reperfusão. Neste vídeo, apresentamos um método para transplante de pâncreas em camundongos utilizando uma técnica de luva sem sutura. Este procedimento é tecnicamente viável e microcirurgicamente factível, com taxas de sucesso excelentes.No entanto, considerando a fibrose progressiva do pâncreas, devido à obstrução do ducto, é nossa opinião que este modelo é mais adequado para áreas de pesquisa focadas nos danos precoces do enxerto associados à lesão por isquemia e reperfusão.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Nosso protocolo foi desenvolvido para fornecer precisão e facilidade ilhotas ou células sob a cápsula renal de camundongos. Células estão concentradas em pelotas na tubulação final utilizada para o transplante de células sob a cápsula renal. A facilidade desta técnica reduz o estresse nas células e mouse.

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Transplante de ilhotas isoladas foi proposto para ser um potencial tratamento para diabetes tipo 1. Aqui nós descrevemos um método para isolar ilhotas de rato pancreata e transplantá-las para o espaço subcapsular do rim.

Um método para isolamento de ilhotas murino e transplante renal subcapsular

Este vídeo descreve o protocolo de enxerto de ilhotas pancreáticas humanas na câmara anterior do olho do camundongo para monitorar a revascularização de enxertos de ilhotas humanas in vivo. Também ajuda a entender a contribuição das células receptoras versus doadoras na promoção do encapsulamento e vascularização do enxerto.

Enxertia de ilhotas pancreáticas: um método para implantar ilhotas pancreáticas na câmara anterior do olho do camundongo para imagens in vivo

O vídeo explica um método cirúrgico passo a passo para implantação ortotópica de um fragmento tumoral de um doador canceroso para o pâncreas de um camundongo receptor não canceroso para o desenvolvimento de câncer de pâncreas. O PDAC implantado ortotopicamente pode recapturar o microambiente tecidual de cânceres pancreáticos humanos do que os modelos subcutâneos (SC) convencionais com mais precisão.

Transplante de tumor ortotópico de homoenxerto: uma técnica para gerar modelos de camundongos com tumor pancreático

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para infundir células das ilhotas pancreáticas na veia porta hepática, seguido pela aplicação de espuma de gel para prevenir o sangramento com sucesso. O sangramento pós-operatório é uma causa comum de alta mortalidade durante o transplante de ilhotas.

Modelo Murino de Transplante de Ilhotas: Um Método Cirúrgico para Infundir Ilhotas Pancreáticas na Veia Portal e Prevenção de Sangramento Pós-Operatório

Este protocolo descreve um modelo de lesão envolvendo a ligadura cirúrgica do ducto pancreático no pâncreas de camundongos adultos, resultando em lesão grave que estabelece um ambiente que permite a neogênese e proliferação de células beta. Este modelo pode ser usado como uma ferramenta para estudar os mecanismos envolvidos na formação de células beta.

Lesão cirúrgica para o mouse Pâncreas através da ligadura da pâncreas Duct como um modelo para endócrina e exócrina Reprogramação e Proliferação

Este protocolo demonstra isolamento de manchas murinas e semeadura em um andaime decelularizado. As ilhotas suportadas em andaimes foram transplantadas para a almofada de gordura epididimática de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ). As ilhotas sobreviveram no local do transplante e revertearam a condição hiperglicêmica.

Transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos

Transplante de ilhotas pancreáticas é uma maneira de conseguir normoglycemia no diabetes tipo 1. Este artigo centra-se na técnica de transplante através da rota intraportal para manter os níveis normais de glicose em ratos diabéticos.

Intraportal transplante de ilhotas pancreáticas no modelo de Mouse

No contexto clínico, pacientes com câncer pancreático localizado serão submetidos à pancreatectomia seguida de tratamento adjuvante. Este protocolo aqui relatado visa estabelecer um método seguro e eficaz de modelagem deste cenário clínico em camundongos nus, através da implantação ortotópica de câncer pancreático seguido de pancreatectomia distal e esplenectomia.

Um modelo de rato resemcional ortotópico de câncer pancreático

No presente protocolo, um modelo de transplante cardíaco em camundongos é utilizado para investigar o mecanismo de rejeição do enxerto cardíaco. Neste modelo heterotópico de transplante cardíaco, a eficiência da operação é melhorada, e a sobrevida dos enxertos cardíacos é garantida por uma anastomose cervical término-terminal do implante cardíaco usando uma técnica de Cuff modificada.

Técnica de Cuff Modificada para Modelo de Transplante Cardíaco Heterotópico Cervical:

Aloenxertos ortotópicos singênicos de adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) de camundongos recapitulam a biologia, os fenótipos e as respostas terapêuticas dos subtipos da doença. Devido à sua rápida e reprodutível progressão tumoral, são amplamente utilizados em estudos pré-clínicos. Aqui, mostramos práticas comuns para gerar esses modelos, injetando culturas de PDAC murino singênico no pâncreas.

Aloenxertos Ortotópicos Singênicos de Camundongos para Modelo de Câncer de Pâncreas

Aprenda o modelo de transplante de pâncreas em camundongos usando técnica de manguito sem sutura. Este método permite estudar lesões por isquemia-reperfusão e viabilidade do enxerto em pesquisa de biologia de transplantes.

Modelo do rato para transplante de pâncreas, usando uma técnica modificada do manguito

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