Low-Density hipocampo Cultura Neuron primária

Este protocolo foi originalmente publicado pelo Dr. Gary Bunker e seus colegas, e permite o cultivo de neurônios hipocampais embrionários com alta densidade e alta pureza, suspendendo os neurônios sobre uma camada de suporte de células gliais. Esse resultado é fundamental para os demais resultados cruciais do nosso hipocampo, pois permite que os neurônios cresçam em baixas densidades com poucas células gliais contaminantes. Esse cultivo é, portanto, ideal para imagens de alta resolução e avaliação funcional da tipografia e dos neurônios maduros em cultura.

A pós-maturação deste protocolo deve acelerar a adaptação por novos pesquisadores, pois existem diversos estados-chave durante o procedimento que são difíceis de descrever, de modo que o protocolo os acompanha passo a passo. Este protocolo consiste em três populações independentes necessárias para o cultivo de neurônios primários de alta qualidade. Esses processos incluem o cultivo de células gliais, a confecção e o revestimento de lamínulas e o preparo de células nervosas do hipocampo.

Para começar, o tecido cortical de rato pós-natal precoce deve ser obtido conforme descrito no protocolo escrito. Embora não mostrado diretamente aqui, observe que os passos da dissecação exibidos posteriormente neste protocolo são quase idênticos aos utilizados para a dissecação cortical. Por esta razão, etapas relevantes serão destacadas durante o procedimento de dissecação do hipocampo mostrado mais adiante neste vídeo.

A partir do Passo Seis do protocolo escrito, remova o HBSS do tecido cortical coletado e, em seguida, pique o tecido o mais finamente possível usando tesoura. Adicione quantidade suficiente de HBSS ao tecido picado para transferir os fragmentos de tecido para um tubo cônico de 50 mililitros e, então, complete o volume até 12 mililitros adicionando HBSS. Adicione 1,5 mililitro de tripsina a 2,5% e 1,5 mililitro de solução de DNA a 10 miligramas por mililitro, inverta para homogeneizar e, em seguida, incube a mistura resultante em banho-maria a 37 graus Celsius por 12 minutos.

Pipete o tecido de 10 a 15 vezes usando uma pipeta de Pasteur de vidro e, em seguida, incube-o no banho-maria por mais três minutos. Certifique-se de que todos os fragmentos de tecido tenham sedimentado no fundo do tubo e, então, filtre o sobrenadante para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 5 mililitros de BGS. Adicione 13,5 mililitros de HBSS e 1,5 mililitro de 2,5&trypsin ao tubo contendo os fragmentos remanescentes de tecido não digerido, inverta para homogeneizar e, em seguida, incube-o no banho-maria por mais 10 minutos.

Após a incubação, triture o tecido remanescente de 10 a 15 vezes e, em seguida, filtre-o no tubo que contém o filtrado inicial. Em seguida, lave o filtro fazendo passar por ele adicionais 3 mililitros de BGS. Neste ponto, o filtrado pode ser dividido em vários tubos para facilitar tanto o balanceamento quanto a re-suspensão do pellet celular.

Centrifugue as suspensões por seis minutos a 130 G. Após a centrifugação, observe que o fundo do pellet apresenta uma coloração levemente avermelhada, devido à presença de componentes sanguíneos. Remova os sobrenadantes, então adicione 1 mililitro de meio glial a cada tubo, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Transfira as porções de cada pellet que não apresentam essa coloração avermelhada para um novo tubo cônico de 50 mililitros.

Adicione até 2 mililitros de meio glial por filhote para re-suspender o tecido combinado e transfira cada 2 mililitros da suspensão para 18 mililitros de meio glial pré-aquecido em um frasco de cultura de 75 centímetros quadrados. Incube o frasco em uma incubadora a 37 graus Celsius, 5%CO2. No dia seguinte ao semeamento das células, troque o meio em cada frasco por meio glial fresco.

Observe que, neste momento, o cultivo será uma mistura de astrócitos e outros tipos celulares não-alvo. Para remover os tipos celulares não astrócitos, os frascos devem ser agitados vigorosamente cerca de quatro dias após a semeadura. Para isso, lave os frascos com HBSS, adicione então 10 mililitros de HBSS fresco a cada frasco e agite cada um vigorosamente de cinco a dez vezes.

Aspire o HBSS e lave duas vezes mais com HBSS. Em seguida, adicione 20 mililitros de meio glial e devolva os frascos ao incubador como antes. Observe que, embora este procedimento seja vigoroso, os astrócitos desejados para o cultivo permanecerão fortemente aderidos à superfície do frasco.

Para manter as culturas de astrócitos, troque o meio por meio glial fresco duas vezes por semana até que atinjam confluência. Após atingirem confluência, as células podem ser congeladas para uso futuro, conforme descrito no protocolo escrito. Os gliócitos devem ser semeados em placas com pelo menos 14 dias de antecedência em relação ao início da cultura de neurônios, conforme descrito no protocolo escrito.

Submerja lamínulas em ácido nítrico concentrado e submeta-as à sonicação por 30 minutos à temperatura ambiente. Tenha cuidado, pois o ácido nítrico concentrado é extremamente corrosivo. Observe também que alguns laboratórios preferem deixar as lamínulas em imersão no ácido nítrico durante a noite, utilizando suportes cerâmicos para coloração.

Descarte cuidadosamente o ácido nítrico na capela química conforme as diretrizes institucionais e, em seguida, enxágue as lamínulas três vezes com água deionizada. Mergulhe as lamínulas na água e submeta-as novamente à ultrassonicação por 30 minutos. Em seguida, remova a água e enxágue as lamínulas outras três vezes.

Submergir as lamínulas em 50 mililitros de água e, em seguida, autoclavar. Em uma câmara de fluxo laminar estéril, remover a água e adicionar 20 a 30 mililitros de etanol para enxaguar. Adicionar outros 20 a 30 mililitros de etanol e, em seguida, transferir as lamínulas e o etanol para uma placa de Petri de 100 milímetros.

Usando pinças rombas, transfira as lamínulas coloridas para placas de Petri de 60 mililitros, quatro a cinco por placa, e deixe-as secar ao ar, apoiando as lamínulas na borda da placa. Após a evaporação do etanol, recoloque as lamínulas na posição horizontal. Derreta 10 gramas de parafina em um frasco de vidro resistente ao calor e mantenha-a a aproximadamente 150 a 200 graus Celsius.

A temperatura ideal pode exigir alguns ajustes, e temperaturas incorretas podem dificultar a produção do tamanho correto dos pés de parafina. Mergulhe uma pipeta de Pasteur na parafina e, em seguida, toque rapidamente em três pontos próximos à borda de cada lamínula. As gotas de parafina solidificarão em formas esféricas com aproximadamente 3 a 5 milímetros de altura e 1 a 2 milímetros de diâmetro, funcionando para criar um espaço entre os neurônios na lamínula e a camada mono de glia abaixo.

Obtenha placas contendo lamínulas previamente preparadas com "pés" de parafina. Adicione 200 microlitros de poli-l-lisina e tampão borato à superfície de cada lamínula e deixe a solução repousar sobre as lamínulas durante a noite, cobertas à temperatura ambiente. A superfície que está sendo revestida deve ser a mesma onde estão situadas as microesferas de parafina.

Se limpos corretamente, o poli-l-lisina deve espalhar-se facilmente para cobrir a superfície do lamínula. Na manhã seguinte, lave os lamínulas duas vezes, mergulhando-os em água estéril durante duas horas cada vez. Após a lavagem final, substitua a água por 4 mililitros de meio de placa por placa.

Observe que é importante que a superfície das lamínulas não seja deixada secar após ter sido revestida com poli-l-lisina. Coloque as placas com lamínulas em uma incubadora a 37 graus Celsius. A lamínula revestida deve ser incubada por pelo menos 24 horas antes do início do cultivo de neurônios.

Obtenha uma rata prenhe no 18º ou 19º dia embrionário e eutanazie-a por um método aprovado. Aspergisse a parte inferior da rata com etanol 70%, em seguida faça uma incisão mediana da região púbica até o final da cavidade abdominal. Para evitar contaminação, tenha cuidado para cortar apenas a pele nesta etapa.

Sterilize os instrumentos de dissecação utilizando etanol 70%, em seguida corte a parede abdominal para expor o útero. Remova os dois cornos uterinos e coloque-os em uma placa estéril. Em uma cabine de fluxo laminar estéril, remova as membranas uterinas que envolvem os fetos, decapite-os e coloque as cabeças em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 20 mililitros de HBSS.

Disseque os cérebros e coloque-os imediatamente em uma placa de Petri de 60 milímetros contendo 2 mililitros de HBSS sobre gelo. Colete apenas dois a três cérebros por placa para permitir espaço suficiente para a próxima etapa. Sob um microscópio estereoscópico, remova as meninges a partir da linha média dos hemisférios cerebrais.

Em seguida, dissecar os hipocampos. Observe que o hipocampo pode ser identificado como uma estrutura com formato de crescente na superfície medial do hemisfério cortical, e é fácil de remover, pois é delimitado lateralmente por um ventrículo. Após solto, colocar os hipocampos em uma placa de Petri de 60 milímetros contendo 4,5 mililitros de HBSS e manter sob gelo.

Observe que os passos realizados até este ponto também valem para a dissecção do córtex, exceto pelo fato de que os córtices são mantidos ao invés dos hipocampos. Para a dissecção do córtex, o próximo passo seria separar o córtex do restante do cérebro, como mostrado aqui, e então coletar os córtices e o HBSS conforme demonstrado anteriormente. Após todo o tecido hipocampal ter sido coletado no HBSS, transfira-o para um tubo cônico de 15 mililitros.

Adicione 5 mililitros de tripsina a 2,5%, em seguida incube a 37 graus Celsius por 10 minutos. Remova cuidadosamente a solução de tripsina com pipeta de Pasteur, deixando o tecido hipocampal intacto no fundo do tubo. Lave o tecido duas vezes adicionando suavemente 5 mililitros de HBSS, incubando a 37 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, removendo novamente com pipeta de Pasteur, certificando-se de não perturbar o tecido no fundo.

Enquanto aguarda o passo de incubação anteriormente mostrado, prepare duas variantes de pipetas polidas com chama para dissociação do tecido. Para isso, exponha brevemente a ponta da pipeta de vidro de Pasteur à chama e, em seguida, examine a ponta da pipeta. Para a primeira variante, repita este passo até que as bordas da ponta da pipeta estejam lisas, mas o diâmetro permaneça inalterado.

Para o segundo, repita até que as bordas estejam lisas e o diâmetro da ponta tenha sido reduzido aproximadamente pela metade. É importante praticar para encontrar o diâmetro ideal, garantindo que o tecido seja dissociado para obter células isoladas sem danificar essas células no processo. Após a segunda lavagem, complete o volume total para 5 mililitros adicionando um volume suficiente de HBSS ao tecido.

Triture o tecido hipocampal primeiro com cerca de 10 passagens através da pipeta normal de bordas lisas, depois com mais cinco a 10 passagens através da pipeta com diâmetro reduzido da ponta. O objetivo aqui é obter uma solução homogênea de células sem, ou com muito poucos, agregados de tecido. Determine a densidade celular utilizando um hemocitômetro.

Os rendimentos típicos são de cerca de 800.000 a um milhão de células por filhote. Transfira um volume suficiente da suspensão celular para placas contendo lamínulas revestidas com poli-l-lisina em 4 mililitros de meio de plaqueamento, para obter uma densidade de plaqueamento entre 100.000 e 500.000 células por placa de 60 milímetros, dependendo do experimento pretendido. Coloque as placas em um incubador a 37 graus Celsius com 5% de CO2.

Após três a quatro horas, transfira as lamínulas com neurônios aderidos para placas contendo células gliais e meio NBG. Isso deve ser feito de modo que a face na qual os neurônios foram semeados fique voltada para baixo, em direção à camada de células gliais. Adicione um total de quatro ou cinco lamínulas por placa de glia.

Dois ou três dias após o plaqueamento, adicione a solução de aerocele a uma concentração final de cinco micromolar por placa para interromper o crescimento das células gliais. Alimente as células uma vez por semana substituindo 2 mililitros do meio antigo por 2,5 mililitros de meio fresco a cada alimentação. O meio adicional acrescentado tem a finalidade de compensar a evaporação ao longo do tempo.

E apenas uma porção do meio é trocada para garantir o condicionamento consistente do meio pelas células gliais. Essas culturas geralmente permanecem saudáveis por pelo menos um mês. Os neurônios foram fixados com paraformaldeído 4%, seguidos de incubação com anticorpos primários para imagem de fluorescência.

Como observado pelas imunomarcacoes de Tau e MAP2, esses neurônios desenvolvem uma extensa arborização com axônios e dendritos bem desenvolvidos. Neurônios maduros também desenvolvem espinhos sinápticos, identificados pela localização seletiva da Drebrina Um, que estão estreitamente opostos às especializações pré-sinápticas, identificadas pela imunomarcacao de sinapse em um. Esses neurônios primários são muito adequados para estudos funcionais e estruturais de neurônios e sinapses, incluindo estudos de transdução de sinal, polaridade neuronal, tráfego subcelular e desenvolvimento e plasticidade sináptica, entre outros.

Este vídeo deve auxiliar na compreensão e na execução precisa de várias etapas fundamentais deste protocolo. O estrito cumprimento do método descrito deve resultar em uma cultura de neurônios saudáveis, com alta densidade, extensa arborização e sinapses bem desenvolvidas morfológica e funcionalmente.