Name: Low-Density hipocampo Cultura Neuron primária (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 46 s
Description: Aprenda a cultivar neurônios hipocampais primários de baixa densidade sobre monocamada glial. Este método permite imagem óptica de alta resolução e ensaios funcionais de neurônios maduros em neurociência.

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Este trabalho foi financiado pelo CIHR MOP-142209 para TJS.

Todos os experimentos e protocolos que utilizam animais de laboratório foram aprovados pela Universidade de Manitoba comitê de ética animal e estavam em conformidade com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care. 1. Preparação de Instrumentos, Tampões e Soluções <ol><li> Esterilizar por autoclavagem de todos os equipamentos de dissecção, pipetas de Pasteur de vidro, pontas de pipetas, aparelho de filtro, e água desionizada. </li><li> Prepara-se uma a 20% (w / v; 1,1 M) uma solução de glucose estoque em água desionizada e filtra-se a esterilizar. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepara-se uma solução de piruvato de sódio 100 mM em água desionizada e filtra-se a esterilizar. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare a Solução Salina Equilibrada de cálcio e magnésio livre de Hank (CMF-HBSS) por preparação de uma solução de 10% de HBSS (10x), HEPES a 10 mM, e 100 U / mL de penicilina-estreptomicina, em água desionizada. Armazenar a 4 ° C durante não mais do que 1 a 2 meses. </li><li> Prepare a 10 mg / mL de desoxirribonuclease I (ADNase) em CMF-HBSS,e em seguida filtrar-esterilizar e armazenar a -20 ° C. </li><li> Preparar o meio da glia por preparação de uma solução de glicose a 30 mM (a partir da solução estéril), 95 U / mL de penicilina-estreptomicina, e soro de crescimento bovino de 10-15% (BGS) em Meio Essencial Mínimo (MEM). NOTA: Como indicado no protocolo, uma solução de 5% BGS pode ser usado, se necessário para retardar a proliferação das células. Soro de Cavalo pode ser usado em vez de BGS, mas notar que cada lote deve ser verificada antes da utilização, devido à variação inter-lote. Armazenar a solução preparada a 4 ° C durante não mais do que 1 a 2 meses. Embora muitos laboratórios usam FBS, observou-se consistentemente que o crescimento glial na BGS é tão robusto como em FBS. BGS é derivado a partir de soro de vitela fetal, que é suplementado com componentes quimicamente definidos. Além disso, BGS é substancialmente mais económica do que FBS. </li><li> Prepara-se o crescimento do neurónio e meio de manutenção (Neurobasal-B27, NBG) por preparação de uma solução de 1x suplemento B27 e 0,5 mM de L-glutamina em 500 ml Neurobasal Medium. Armazenar a 4 ° C durante não mais do que 1 a 2 meses. L-glutamina pode ser substituído com Glutamax, que tem sido sugerido para ser mais estável no meio de crescimento. </li><li> Prepara-se o neurónio plaqueamento médio por preparação de uma solução de glicose a 30 mM (a partir da solução estéril), piruvato de sódio 1 mM (a partir da solução estéril), e 10% BGS em MEM. Armazenar a 4 ° C durante não mais do que 1 a 2 meses. </li><li> Prepara-se uma solução de 1 mM de citarabina (Ara-C) e filtra-se a esterilizar. Aliquota em porções de 1 ml e armazenar a -20 ° C. </li><li> Prepara-se uma solução de APV 100 mM em NaOH 100 mN filtro-esterilizado. Armazenar a -20 ° C. </li><li> Dissolve-se 1 mg / mL de poli-L-lisina em tampão de borato, pH 8,5 (ácido bórico 50 mM e borato de sódio 12 mM) e filtro a esterilizar. Alíquotas e armazenar a -20 ° C. Em vez de poli-L-lisina, pode-se utilizar a poli-L-ornitina, que podem ser menos tóxicos para as células. </li></ol> 2. Preparação Cultura Glia <ol><li> Prepare a cultura de células astróglia cortical <ol><li&gt; Obter filhotes de rato dentro de 24 h após o nascimento. Coloque os filhotes no gelo para anestesiar-los. </li><li> Pulverizar as crias com 70% de etanol e decapitar-los. </li><li> Coloque as cabeças em uma placa de 100 mm no gelo contendo 15 mL de CMF-HBSS. </li><li> Dissecar cada cérebro através do corte do couro cabeludo, a abertura do crânio, cortando o tronco cerebral, e então transferindo o cérebro para 60 mm de placas de Petri em gelo contendo 3 mL de CMF-HBSS. </li><li> Separa-se os hemisférios cerebrais do hipocampo e em seguida retiram as meninges circundantes eles. Exercer as devidas precauções para garantir contaminação mínima a partir de fibroblastos meninges. fibroblastos meninges na cultura pode competir com glia para o crescimento e ser prejudicial para o neurônio saúde. Recolher todos os hemisférios cerebrais em um prato de 60 mm Petri sobre gelo contendo 5 mL de CMF-HBSS. </li><li> Remova a CMF-HBSS e depois picar o tecido cortical coletadas tão finamente quanto possível, utilizando micro-dissecando primavera-tesoura. </li><li> Adicionar suficiente CMF-HBSS para o choptecido ped. Usando uma pipeta de pasteur de vidro, transferir os pedaços de tecido para um tubo de 15 mL. Levar o volume total a 12 ml por adição de CMF-HBSS. </li><li> Adicionar 1,5 mL de cada vez de 2,5% de tripsina e 10 mg / mL de solução de DNase. Incubar a mistura resultante a 37 ° C num banho de água durante 12 min. </li><li> Tritura-se o tecido de 10-15 vezes utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro, e incuba-se ainda mais num banho de água a 37 ° C durante 3 min. </li><li> Filtra-se o sobrenadante através de papel de lentes, ou uma malha de filtro para um tubo de 50 mL contendo 5 mL de BGS. Isto é feito para remover pedaços de tecido não dissociado. Alternativamente, usar filtros celulares disponíveis comercialmente. </li><li> Adicionar 13,5 mL de CMF-HBSS e 1,5 mL de 2,5% de tripsina para o tubo contendo os pedas de tecido remanescentes e incubar ainda mais a 37 ° C num banho de água durante um adicional de 10 min. </li><li> Tritura-se o restante tecido mais uma vez, e depois filtra-se a suspensão outra vez para dentro do tubo de 50 mL contendo o filtrado inicial. Em seguida, enxaguar a lepapel ns com 3 mL de BGS. O volume final deve ser de aproximadamente 38 ml. </li><li> Centrifugar a suspensão contendo as células gliais dissociadas durante 6 minutos a 130 x g. Cuidadosamente descarte do sobrenadante utilizando uma pipeta Pasteur de vidro. Certifique-se que as células peletizadas na parte inferior não sejam perturbados. A parte inferior do pelete aparece ligeiramente avermelhada contendo componentes do sangue. </li><li> Transferir as células gliais em 1 ml de meio da glia para um tubo fresco, tendo o cuidado de não perturbar a porção avermelhado do pelete. </li><li> Adicionar-se a 2 mL de meio de glial por cachorro para ressuspender o combinado dissociadas de células da glia. Por exemplo, foram usadas se 10 filhotes, e, em seguida, o volume total de ressuspensão seria de 20 mL. </li><li> Preparar um frasco de cultura celular de 75 cm2 por filhote. Adicionar 18 mL de meio glial pré-aquecido a cada frasco. </li><li> Transferência de 2 ml de suspensão de células em cada balão e incubar em 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Após um dia, substituir com 20 mL glial medium. Nesta fase, a cultura é uma mistura de glial e outros tipos de células indesejadas. </li><li> Quatro dias após a semeadura das células, agitar vigorosamente os frascos para desalojar as células não-astrócitos. Para fazer isso, lavar os balões uma vez com CMF-HBSS, e, em seguida, adicionam-se 10 ml fresco CMF-HBSS a cada frasco. Agitar vigorosamente os frascos de 5-10 vezes, e em seguida, aspirar para fora da CMF-HBSS. Lavar duas vezes com CMF-HBSS, e, em seguida, adicionar 20 mL de meio de glial. NOTA: Este passo é crucial para assegurar a remoção de tipos de células não-alvo, e não deve resultar na perda dos astrócitos desejados. </li><li> Substituir com meio glial fresco duas vezes por semana até que as células estão confluentes (Figura 1). </li></ol></li><li> congelamento glia <ol><li> Uma vez que as culturas são confluentes, aspirar fora o meio e lava-se a monocamada de células com 10 mL de CMF-HBSS. </li><li> Adicionar 10 mL de 0,25% de tripsina / EDTA a cada bal e incubar a 37 ° C durante 3 min. </li><li> Toque em frascos suavemente para desalojar as células. Adicionar 1 mL BGS tO cada balão e transferir as suspensões de células em tubos de 15 mL. </li><li> Centrifugar os tubos a 130 xg durante 6 minutos. Descartar o sobrenadante resultante. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 2 ml de meio glial. </li><li> Prepara-se o meio de congelação da glia (dimetilsulfóxido 1-parte e 4 partes BGS). Adicionar 0,5 mL desta solução a cada uma de 4 frascos criogénicos por frasco. </li><li> Transferir 0,5 mL da suspensão de células de cada frasco, e, em seguida, congelar as células lentamente colocando os frascos em um recipiente isolado em um congelador a -80 ° C durante a noite. Após um dia, transferir os tubos de ensaio para um congelador de azoto líquido para o armazenamento a longo prazo. </li></ol></li><li> Chapeamento reviveu glia <ol><li> glia placa 1-2 semanas antes do dia neurónio cultura. </li><li> Preparar um tubo de 50 mL com 10 mL de meio aquecido glial. </li><li> Descongelar uma ampola congelada de células da glia em um banho de água a 37 ° C durante 2-3 min. </li><li> Transferir o conteúdo do frasco para dentro do tubo de 50 mL contendo 10 mL de meio de glial. </li><li> centrífugae o tubo durante 5 min a 130 xg e o sobrenadante aspirado fora. </li><li> Ressuspender o sedimento em 20 mL de meio de glial. </li><li> Adicionar 3 ml de meio fresco glial a cada um dos pratos de cultura (60 mm), e, em seguida, transferir 1 ml da suspensão de células a cada prato. Incubar as culturas em 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Alimentação das células duas vezes por semana. Se a densidade de células atinge% de confluência 50 bem antes do dia neurónio cultura, mudar para meio contendo 5% de células gliais BGS para retardar a taxa de crescimento da glia. A confluência desejado da monocamada de células gliais para neurónio cultura é de 50% - 70%. </li><li> Substituir o meio com meio glial BNG (6 mL / prato) 1-2 dias antes da cultura neurónio. </li></ol></li></ol> 3. Preparação Lamela <ol><li> Limpeza e preparação de parafina Beads <ol><li> Submerge lamelas em ácido nítrico concentrado (70% p / p; CUIDADO: altamente corrosivo) e sonicar-los durante 30 min à temperatura ambiente. Outros laboratórios têm found que é benéfico para incubar as lamelas em ácido nítrico a 70% em prateleiras de cerâmica durante 12-24 h à temperatura ambiente em vez disso. </li><li> Cuidadosamente descartar o ácido nítrico numa hote química, designada de acordo com as orientações institucionais. Lavam-se as lamelas 3-5 vezes com água desionizada. </li><li> Submergir as lamelas em água desionizada e sonicar-los de novo durante 30 min (saltar se a seguir o método alternativo). </li><li> Remover a água desionizada e enxaguar as lamelas mais três vezes. </li><li> Submergir as lamelas em 50 mL de água desionizada e esterilizá-los por autoclavagem. Alternativamente, esterilizar as lamelas a 225 ° C num forno durante 6 h. Se utilizar esta abordagem alternativa, pule para o passo 3.1.9. </li><li> Uma vez autoclavado, transferir as lamelas a uma câmara de fluxo laminar estéril para os passos seguintes. </li><li> Remover a água desionizada e enxaguar com 20-30 ml de etanol a 100%. </li><li> Adicionar 20-30 mL de etanol a 100% e transferir as lamelas eetanol para uma placa de Petri de 100 milímetros. </li><li> Use pinças rombas para transferir lamelas de 60 mm de placas de Petri, 4-5 lamelas por placa, e, em seguida, permitir-lhes secar ao ar, inclinando-se as lamelas de cobertura contra a borda do prato. Uma vez que o etanol se ter evaporado, colocar as lamelas sobre a superfície. </li><li> Transferir 10 g de parafina para um frasco de vidro resistente ao calor apropriado. Derreter a parafina e mantê-la a cerca de 150-200 ° C, numa placa quente durante pelo menos 1 h. A temperatura ideal para que a parafina deve ser aquecida pode demorar alguns ajustes. temperaturas não ideais pode levar à dificuldade em produzir o tamanho correto das esferas de parafina. O período de espera após fusão ajuda a garantir que a temperatura consistente em todo o líquido. </li><li> Mergulhar uma pipeta de Pasteur, em que a parafina, e, em seguida, rapidamente tocá-lo para três pontos perto da borda de cada lamela (cada local sendo de aproximadamente 120 °). As gotas irá solidificar em pérolas de cerca de 0,3-0,5 mm de altura e 1,0-2,0 mm de diameter e funcionam de modo a proporcionar um espaço entre os neurónios sobre a lamela e a monocamada de células gliais abaixo (Figura 2). </li><li> Esterilizar os pratos sob luz UV durante 30 min, e em seguida cobrindo-os com folha de alumínio e armazenar à temperatura ambiente. lamelas preparados podem ser armazenados e utilizados por até um mês. contas de parafina devem ser autorizados a aderir as lamelas por pelo menos uma semana antes do uso. Isso vai impedir que a parafina se desprendam durante os passos restantes do protocolo. </li></ol></li><li> As lamelas de revestimento com poli-L-Lisina <ol><li> Obter placas de Petri contendo lamínulas previamente preparadas com as contas de parafina. </li><li> Adicionar 200 ul de poli-L-lisina em tampão de borato para a superfície de cada lamela e deixar a solução sentar sobre as lamelas durante a noite, tapada, à temperatura ambiente. Cubra a mesma superfície que aquele em que as contas de parafina estão situados. Observe que, se devidamente limpo, a poli-L-lisina deve se espalhar facilmentepara cobrir a superfície da lamela. </li><li> Após um dia, lava-se as lamelas duas vezes por imersão em água desionizada estéril durante 2 horas de cada vez. Após a lavagem final, substituir a água com 4 ml de meio de plaqueamento neuronal por prato. Note-se que é importante que a superfície das lamelas não ser deixada secar, depois de ter sido revestido com poli-L-lisina. </li><li> Colocar as cápsulas contendo lamela em um 37 ° C, 5% de CO2. As lamelas revestidas devem ser incubadas durante pelo menos 24 h antes do neurónio cultura. Isto é feito para preparar o meio para neurônio cultura. </li></ol></li></ol> 4. Dissecção do hipocampo e chapeamento Neurônios <ol><li> Obter uma rata grávida (dia embrionário 18-19, tal como medido a partir do dia da descoberta rolhão vaginal) e eutanásia por decapitação anestesiados com isoflurano ou outro método aprovado. </li><li> Pulveriza-se a parte de baixo do rato com etanol a 70%, e, em seguida, fazer uma incisão da região púbica throurg para a extremidade da cavidade abdominal. Para evitar a contaminação, tomar cuidado para cortar apenas através da pele nesta etapa. </li><li> Enxaguar os instrumentos de dissecção novamente com etanol a 70%, e, em seguida, cortada através da parede abdominal para expor o útero. Remover os dois cornos uterinos e colocá-los em uma placa de Petri de 100 milímetros estéril. </li><li> Executar os restantes passos em uma câmara de fluxo laminar. Remover a membrana uterina em torno dos fetos. Decapitar-los e colocar as cabeças em um prato de 100 mm Petri contendo 20 ml CMF-HBSS. </li><li> Dissecar os cérebros imediatamente e colocá-los em uma placa de 60 mm de Petri contendo 2 mL de CMF-HBSS em gelo. Recolhe apenas 2-3 cérebros por placa para permitir espaço suficiente para o passo seguinte. </li><li> Sob um microscópio de dissecação deformam as meninges da linha média dos hemisférios cerebrais, e em seguida, dissecar os hipocampos e colocá-los em uma placa de 60 mm de Petri contendo 4,5 mL de CMF-HBSS. Note-se que o hipocampo pode ser distinguido como uma estru em forma de crescentetura na face medial do hemisfério cortical, e é fácil de remover, uma vez que é delimitado lateralmente por um ventrículo. </li><li> Transferir o tecido do hipocampo recolhido e CMF-HBSS para um tubo de 15 mL. Adicionar 0,5 ml de 2,5% de tripsina, e, em seguida, incuba-se a 37 ° C durante 10 min. A papaína pode ser usado em vez de tripsina porque é mais suave e pode aumentar o rendimento. </li><li> Suavemente remover a solução de tripsina por uma pipeta de Pasteur, deixando o tecido do hipocampo não perturbada na parte inferior do tubo. </li><li> Lavar cuidadosamente o tecido duas vezes com 5 mL de CMF-HBSS enquanto incubando-a a 37 ° C durante 5 min. Após a segunda lavagem, levar o volume total de, pelo menos, 5 mL através da adição de um volume suficiente de CMF-HBSS para o tecido. Se existem hipocampos de mais do que 10 filhotes, até 8 mL de CMF-HBSS pode ser adicionado. </li><li> Prepare duas variantes de pipetas polido-fogo para a dissociação de tecidos. A ponta de uma variante é do diâmetro normal da pipeta mas com arestas smoothened polido ao fogo. A outra variformiga é um com o diâmetro da ponta reduzida a metade. Resumidamente expor a ponta de uma pipeta Pasteur de vidro na diagonal a uma fonte de chama, e depois examinar as pontas das pipetas. <ol><li> Repetir este passo até que a extremidade da ponta tinha sido smoothened ou o diâmetro tiver sido reduzido. É importante para a prática de encontrar o diâmetro ideal para garantir que o tecido é dissociado para produzir células individuais, sem danificar estas células. </li></ol></li><li> Tritura-se o tecido do hipocampo pela primeira vez por cerca de 10 passagens através de uma pipeta de Pasteur de vidro normal, com borda lisa, e, em seguida, mais 5 a 10 passagens através da pipeta com o diâmetro reduzido. O objectivo é a obtenção de uma solução homogénea de células sem ou com muito poucos aglomerados de tecido. </li><li> Determinar a densidade celular utilizando um hemocitetro ou um contador de células automatizado. Tipicamente, 0,8 a 1,0 milhões de células por pup são obtidos quando hipocampos dos dois hemisférios são combinados. </li><li> Transferir um volume suficiente da suspensão de células a pratoscontendo lamelas de poli-L-lisina-revestidas em 4 mL de meio de plaqueamento para obter uma densidade de revestimento de 300.000 células por milímetro prato 60. A densidade das células pode variar de 100.000 a 500.000, dependendo da experiência destinada. </li><li> Após 3-4 h, transferir as lamelas com neurónios ligados aos pratos contendo as células gliais em meio de NBG. Isto deve ser feito de tal modo que o lado no qual foram colocadas as neurónios está voltada para baixo para a camada de células da glia. Adicionar um total de 4-5 lamelas por placa de células da glia. </li><li> Dois ou três dias após o plaqueamento, adicionar a solução de Ara-C para uma concentração final de 5 uM por prato para parar o crescimento da glia. </li><li> Alimentar as células, uma vez por semana por substituindo a 2 ml do meio velho com 2,5 mL de meio fresco em cada mamada. O meio é extra adicionado para compensar a evaporação ao longo do tempo, e apenas uma porção do meio é mudado para assegurar um condicionamento consistente do meio pelas células gliais. Estas culturas são tipicamente saudável para pelo menos um mês (A Figura 3). a sobrevivência de neurónios pode ser melhorada pela adição de APV para o meio de cultura para uma concentração final de 100 uM. APV é um antagonista do receptor de NMDA e promove a sobrevivência ao reduzir a excitotoxicidade do glutamato. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Enquanto o método &quot;sanduíche&quot; de neurônios a cultura de foi bem descrita em outra parte 2, 11, há várias etapas ao longo do protocolo que são bastante difícil de descrever em texto sozinho, que pode levar à frustração para os investigadores que desejam adotá-lo. O método pode ser dividido em três grandes fluxos de trabalho: cultura da glia, preparação de lamela e de cultura de neurónios e de manutenção. Cada uma das três pr...

O cérebro está organizado em redes complexas de neurônios. A contribuição de neurónios individuais para a actividade de rede e função do cérebro pode ser estudada por alteração selectiva da sua composição molecular e perturbação das suas propriedades fisiológicas. A manipulação genética e química de neurónios individuais é sem dúvida mais fácil em neurónios cultivados do que em tecido cerebral intacto, livre de heterogeneidade celular deste último e complexidade. Os neurónios em cultura desenvolver axonal bem definida e mandris dendríticas e formar muitas ligações sinápticas uns com os outros. Enquanto neurónio cultura de animais adultos ou de outras regiões do sistema nervoso é possível, culturas do hipocampo de embriões são frequentemente preferidos devido à sua população de células piramidais definida e relativamente baixa densidade glial 1, 2. neurónios do hipocampo cultivados a baixa densidade em cultura são particularmente amenable para o estudo da localização sub-celular, o tráfico de proteína, polaridade e desenvolvimento neuronal sinapse. Os neurónios em cultura também têm sido extensivamente empregues no estudo dos processos moleculares na plasticidade sináptica 3, 4, 5, 6. Preparações de cultura Neuron de ratinhos com deleções genéticas globais que não sobrevivem após o parto têm sido especialmente útil no estudo de funções celulares e sinápticos de certos genes 7. Tal como no cérebro, os neurónios do hipocampo em cultura são dependentes do suporte trófico de células gliais. Isso complica a sua cultura, e tem levado ao desenvolvimento de vários métodos diferentes por que este apoio é fornecido. Um método vulgarmente utilizado envolve plaqueamento neurónios directamente numa monocamada de células gliais 8, ou que permitam que as células gliais de contaminantes a partir do Hipp adquiridatecido ocampal para proliferar e formar uma monocamada por baixo dos neurónios 9. Enquanto este método tem encontrado algum sucesso, a impureza da cultura neuronal resultante é desvantajoso para experiências de imagiologia. Outro método vulgarmente utilizado de neurónio cultura é deixar-fora do alimentador glial camada completamente, e em vez disso proporcionam suporte trófico sob a forma de um meio de crescimento definido 10. Aqui, descrevemos o &quot;sanduíche&quot; ou método &quot;Banker&quot; do neurônio cultura 2, 11. Este método envolve o plaqueamento os neurónios do hipocampo em lamelas de vidro, que depois são suspensas sobre uma monocamada de células gliais separados por contas de cera de parafina. Isto facilita a cultura de longo prazo de uma população homogénea de neurónios sem contaminar as células da glia, permitindo simultaneamente para suporte trófico da monocamada subjacente glia. Quando são neurónios de idade suficiente ou nível de maturidade,as lamelas dos neurónios pode ser virado para fora-do prato da glia e utilizado em imagiologia ou ensaios funcionais.

<table><tbody><tr><td>Instrumentos de dissecação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Tesoura de Dissecação</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>Micro Tesoura de Mola de Dissecação</td><td>Roboz</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>Micro Tesoura de Mola de Dissecação</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Fórceps</td> <td>7Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Fórceps (#PP)</td><td>Roboz</td><td>RS-4950</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Preparação do tecido</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (2,5%)</td><td>Gibco</td><td>15-090-046</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td>Suporte de Filtro <td>Gibco</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Swinnex, 25&nbsp; mm</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0002500</td><td>Usado como filtro de células. Monte primeiro com filtro e autoclave</td></tr><tr><td>Isoflorane</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td></td><td></td>CP0406V2</tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Grau 105 Tecido de Limpeza de Lentes</td><td>GE Healthcare</td><td>2105-841</td><td>Usado como filtro de células. Monte primeiro no porta-filtro e na autoclave</td></tr><tr><td>Pipetas Glass Pasteur com filtro de algodão</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution sem cálcio, magnésio, fenol vermelho (HBSS, 10x)</td><td>Gibco</td><td>14-185-052</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Glass Pasteur</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino (Dnase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Butano bunsen burner</td><td>Wall-Lenk Mfg. Co.</td><td>Centrífuga Modelo 65</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Cultura de tecidos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (100 mm)</td>Placa de Petri <td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>(60 mm)</td><td>Soro</td><td>de Cavalo FB0875713A</td><td></td>Fisher</tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Pode ser usado no lugar do BGS, mas cada lote deve ser testado devido à variação entre lotes. Recomenda-se a inativação do soro pelo calor.</td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Meio Essencial Mínimo (MEM)</td><td>Gibco</td><td>11-095-080</td><td></td></tr><tr><td>Meio Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21-103-049</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25-030-081</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Pode ser usado no lugar da L-Glutamina no meio NBG</td></tr><tr><td>Prato de Cultura (60 mm)</td><td>Corning, Inc</td><td>Frascos de Cultura 353002</td><td></td></tr><tr><td>(75 cm^2)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Citarabina (Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3350000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Crescimento Bovino (BGS)</td><td>HyClone</td><td>SH3054103</td><td>Recomenda-se a inativação por calor antes do uso.</td></tr><tr><td>Suplemento B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17-504-044</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td>Frascos criogênicos <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ml</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>89094-806</td><td></td></tr><tr><td>Ácido DL-2-amino-5-fosfonopentonóico (APV)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Preparação de lamínula</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato de sódio decahidratado (bórax)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Bromidrato de poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Histoplast Cera de parafina</td><td>Fisher</td><td>22-900-700</td><td></td></tr><tr><td>Forno de convecção por gravidade</td><td>VWR</td><td>89511-404</td><td>Usado para método alternativo de limpeza de lamínula discutido no protocolo</td></tr><tr><td>Banho ultrassônico (Sonicator)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15337400</td><td></td></tr><tr><td>Anachemia</td> de<td>ácido nítrico</td><td>62786-460</td><td></td></tr><tr><td>Racks de coloração de cerâmica</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td>Usado para método alternativo de limpeza de lamínula discutido no protocolo</td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht&nbsp; O fabricante GmbH</td><td>1001/18</td><td>é muito importante, pois os neurônios não aderem bem ao vidro de qualidade inferior&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Diversos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtros de seringa estéreis</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>Usado com seringa BD para seringa de esterilização por filtro</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD</td><td>302832</td><td>Usado com filtros de seringa estéril VWR para esterilização por fliter-esterilização</td></tr> Microscópio invertido <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>15-460-16Q</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga estéril cônicos de 15 mL</td><td>ThermoScientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga estéril cônicos de 50 mL</td><td>ThermoScientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

low-density hipocampo cultura neuron primária

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

A capacidade para sondar a estrutura e fisiologia das células nervosas individuais na cultura é crucial para o estudo da neurobiologia, e permite flexibilidade na manipulação genética e química de células individuais ou redes definidos. Tal facilidade de manipulação mais simples no sistema de cultura reduzida quando comparada com o tecido cerebral intacto. Enquanto existem muitos métodos para o isolamento e o crescimento destes neurónios primárias, cada uma tem as suas próprias limitações. Este protocolo descreve um método para a cultura de baixa densidade e de alta pureza de roedores neurónios do hipocampo embrionárias em lamelas de vidro, que depois são suspensas sobre uma monocamada de culas gliais. Esta &#39;cultura sanduíche&#39; permite o crescimento exclusivo de longo prazo de uma população de neurônios, permitindo simultaneamente para suporte trófico da monocamada glial subjacente. Quando são neurónios de idade suficiente ou nível de maturidade, as lamelas de neurónios pode ser virado para fora-do prato da glia e utilizado em imagiologia ou ensaios funcionais. g neuróniosrown por este método normalmente sobreviver por várias semanas e desenvolver mandris extensos, as conexões sinápticas, e propriedades de rede.

Neste método de &quot;sanduíche&quot; de cultura de células nervosas primárias, neurónios do hipocampo (Figura 3) crescem sobre uma camada de células da glia (Figura 1), separados por grânulos de parafina (Figura 2). Isto assegura que os neurónios selectivamente crescer em lamelas de vidro com a contaminação de células da glia mínima, mas receber suporte trófico adequada a partir de células da glia que crescem no prato de cultura de teci...

Este artigo descreve o protocolo para a cultura de baixa densidade neurónios do hipocampo primárias que crescem em lamelas de vidro invertida sobre uma monocamada de células gliais. As camadas neuronais e gliais são separados por contas de cera de parafina. Os neurónios cultivados por este método são adequados para imagiologia óptica de alta resolução e ensaios funcionais.

Low-Density hipocampo Cultura Neuron primária

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Este protocolo foi originalmente publicado pelo Dr. Gary Bunker e seus colegas, e permite o cultivo de neurônios hipocampais embrionários com alta densidade e alta pureza, suspendendo os neurônios sobre uma camada de suporte de células gliais. Esse resultado é fundamental para os demais resultados cruciais do nosso hipocampo, pois permite que os neurônios cresçam em baixas densidades com poucas células gliais contaminantes. Esse cultivo é, portanto, ideal para imagens de alta resolução e avaliação funcional da tipografia e dos neurônios maduros em cultura.A pós-maturação deste protocolo deve acelerar a adaptação por novos pesquisadores, pois existem diversos estados-chave durante o procedimento que são difíceis de descrever, de modo que o protocolo os acompanha passo a passo. Este protocolo consiste em três populações independentes necessárias para o cultivo de neurônios primários de alta qualidade. Esses processos incluem o cultivo de células gliais, a confecção e o revestimento de lamínulas e o preparo de células nervosas do hipocampo.Para começar, o tecido cortical de rato pós-natal precoce deve ser obtido conforme descrito no protocolo escrito. Embora não mostrado diretamente a

low-density-primary-hippocampal-neuron-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A dissecção e crescimento de células de uma área do cérebro individuais facilita investigação de parâmetros celulares e fisiológicos. Nós descrevemos um método para cultivo de células primárias, que produz neurônios enriquecido culturas em um ambiente sem soro.

Cultura primária de neurônios do hipocampo de ratos recém-nascidos P0

Este protocolo descreve os passos necessários para dissecar, transfectar via de eletroporação e neurônios do hipocampo e da cultura do mouse cortical. Curto prazo, as culturas podem ser utilizados para estudos sobre crescimento do axônio e orientação, enquanto culturas a longo prazo podem ser usados ​​para estudos de sinaptogênese e análise espinha dendrítica.

Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical

Nós fornecer um protocolo para a cultura de neurónios do hipocampo altamente purificado a partir de cérebros de rato pré-natal, sem a utilização de uma camada de células alimentador glial.

Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal

O vídeo demonstra um método para cultivar neurônios de hipocampos murinos. Inicialmente, os hipocampos passam por digestão enzimática para quebrar a matriz do tecido extracelular. Posteriormente, o tecido digerido é mecanicamente interrompido para isolar neurônios individuais. Finalmente, esses neurônios são cultivados em células alimentadoras da glia.

Uma técnica para cultivar neurônios do hipocampo de camundongos

Este vídeo demonstra o método de cultura de neurônios embrionários criopreservados, envolvendo descongelamento controlado, diluição com meio neurobasal e semeadura em uma placa revestida de poli-L-lisina. A incubação subsequente suporta o crescimento e a manutenção das conexões neuronais.

Gerando uma cultura de neurônios primários de baixa densidade a partir de neurônios embrionários congelados

Este vídeo demonstra o método para cultivar neurônios de densidade ultrabaixa na presença de uma camada alimentadora neuronal de alta densidade. Ele estabelece uma co-cultura de neurônios de densidade variável, garantindo proximidade física. Os fatores de crescimento secretados pelos neurônios de alta densidade ajudam na sobrevivência e no crescimento neuronal, mantendo os neurônios de densidade ultrabaixa por um período de tempo mais longo.

Gerando uma cultura neuronal de densidade ultrabaixa usando uma camada alimentadora neuronal de alta densidade

Culturas neuronais embrionárias primárias dissociadas do hipocampo são úteis para investigar os mecanismos de sinalização envolvidos na morte dos neurônios. A sexagem dos embriões antes do isolamento e dissociação do hipocampo permite a preparação de culturas masculinas e femininas separadas, o que permite ao pesquisador identificar e investigar a sinalização celular específica do sexo.

Culturas neuronais estratificadas por sexo para estudar vias de morte celular isquêmica

Nós descrevemos os procedimentos de rotulagem e genotipagem de ratos recém-nascidos e gerando culturas neuronais primárias a partir deles. A genotipagem é rápido, eficiente e fiável e permite a extracção de ácido nucleico automatizado. Isto é especialmente útil para os ratos neonatally letais e suas culturas que exigem a conclusão prévia de genotipagem.

Rápido genotipagem dos animais Seguido por Estabelecer culturas primárias de neurônios do cérebro

Culturas de baixa densidade de neurônios primários do hipocampo geralmente requerem camada alimentadora da glia para suprir fatores neurotróficos e sustentar a longevidade. Descrevemos aqui um método simplificado para cultivar neurônios de densidade ultrabaixa em lamínulas de vidro na presença de uma camada alimentadora neuronal de alta densidade, o que facilita a investigação de mecanismos neuronais autônomos específicos.

Um método simplificado para Ultra-Baixa Densidade, Long-Term Primária do hipocampo Neuron Cultura

Este protocolo mostra como empregar microscopia de super-resolução para estudar a co-localização de proteínas em culturas neuronais primárias.

Imagem de super-resolução para estudar co-localização de proteínas e marcadores sinápticos em neurônios primários

Um estoque congelado pronto para uso de neurônios é uma ferramenta poderosa para avaliar as funções sinápticas. Aqui, apresentamos uma cultura primária fácil de baixa densidade a partir de estoque congelado usando uma placa de 96 poços.

Cultura Primária de Baixa Densidade Fácil e Reprodutível usando Estoque Congelado de Neurônios Embrionários do Hipocampo

Aprenda a cultivar neurônios hipocampais primários de baixa densidade sobre monocamada glial. Este método permite imagem óptica de alta resolução e ensaios funcionais de neurônios maduros em neurociência.

Low-Density hipocampo Cultura Neuron primária

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