Name: Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para a identificação de múltiplas fosfolarização de intrinsecamente desordenados Proteínas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Aprenda a identificar fosforilações múltiplas em proteínas intrinsecamente desordenadas usando espectroscopia de ressonância magnética nuclear com a proteína Tau como estudo de caso. Este método permite mapear modificações específicas e suas alterações estruturais.

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As instalações de RMN foram financiadas pela Région Nord, CNRS, Instituto Pasteur de Lille, Comunidade Europeia (FEDER), Ministério da Pesquisa da França e Universidade de Ciências e Tecnologias de Lille. Reconhecemos o apoio da TGE RMN THC (FR-3050, França), FRABio (FR 3688, França) e Lille NMR e RPE Health and Biology core facility. Nossa pesquisa é apoiada por bolsas do LabEx (Laboratório de Excelência), DISTALZ (Desenvolvimento de Estratégias Inovadoras para uma abordagem Transdisciplinar da Doença de Alzheimer), EU, ITN, TASPPI e ANR BinAlz.

1. Produção de 15 N, 13 C-tau (Figura 1) <ol><li> Transformar pET15b-tau recombinante de T7 expressão plasmídeo 13,14 em BL21 (DE3) competente de Escherichia coli, células bacterianas 15. NOTA: o ADNc que codifica para o mais longo (441 resíduos de aminoácidos) isoforma da tau é clonado entre os locais de restrição Ncol e Xhol no plasmídeo pET15b. <ol><li> Misturar suavemente 50 ul de células (DE3), formando 1-5 x 10 7 colónias por ug de DNA de plasmídeo, com 100 ng de DNA de plasmídeo em um tubo de plástico de 1,5 ml BL21 competente. NOTA: Codon-uso otimizado estirpes bacterianas para a expressão de cDNA eucariótica não são essenciais para a produção de Tau humana. </li><li> Coloque a mistura de células em gelo durante 30 min e em seguida choque térmico durante 10 segundos a 42 ° C. Colocar o tubo de volta em gelo durante 5 min e adicionar 1 ml de meio LB à temperatura ambiente (Luria Bertani). Incubar a suspensão bacteriana a 37 ° C durante 30 min sob suaveagitação. </li></ol></li><li> Espalhe usando uma ansa de inoculação de 100 uL de suspensão de células uniformemente sobre uma placa de agar de meio LB contendo 100 ug / ml do antibiótico ampicilina. </li><li> Incubar a placa de selecção durante 15 horas a 37 ° C. </li><li> Manter a placa de selecção, a 4 ° C até se proceder à etapa de cultura, para um máximo de cerca de 2 semanas. NOTA: um stock de glicerol de cultura bacteriana (50% de glicerol), armazenada a -80 ° C, pode ser preparado para iniciar a cultura, numa fase posterior. </li><li> Adicionar 1 ml de 1 M de MgSO4, 1 ml de CaCl 100 mM de 2, 10 ml de 100x MEM vitamina complemento, 1 ml de 100 mg / ml de ampicilina para 1 L de sais M9 autoclavados (6 g de Na 2 HPO 4, 3 g de KH 2 PO 4 , 0,5 g de NaCl). NOTA: se um precipitado branco irá formar após a adição da solução de CaCI2 para os sais M9 que se dissipa rapidamente. </li><li> Solubilizar 300 mg de N 15, média 13 C-completo, 1 g de 15De NH 4 Cl e 2 g de 13 C 6 -glucose em 10 ml de meio M9. Filtro-esterilizar a solução isótopo utilizando um filtro de 0,2 um, directamente para o meio M9. </li><li> Suspender usando um laço de inoculação uma colónia de pET15b-Tau bactérias transformadas a partir da placa de selecção em 20 ml de meio LB suplementado com 100 ug / ml de ampicilina. </li><li> Incubar o meio inoculado a 37 ° C durante cerca de 6 h. </li><li> Medir a densidade óptica a 600 nm (OD 600) em 1 ml de uma diluição de dez vezes da cultura bacteriana numa cuvete de plástico espectrómetro. NOTA: turbidez da cultura bacteriana correspondente a DO600 de 3,0-4,0 indica que a fase de crescimento de saturação é atingida. </li><li> Adicionar 20 ml da cultura LB saturado a 1 L de meio de crescimento M9 suplementado com ampicilina (100 ug / ml de concentração final), em 2 L de Erlenmeyer frasco de cultura de plástico confundido. </li><li> Colocar o frasco de cultura numa incubadora programável definido para 10 °C e 50 rpm. Programar a incubadora para mudar para 200 rpm e 37 ° C no início da manhã do dia seguinte. </li><li> Medida OD600 em 1 ml de cultura bacteriana numa cuvete de plástico espectrómetro. Adicionar 400 ul de 1 M de IPTG (β-D-1-tiogalactopiranosido de isopropilo) solução de estoque (mantido a -20 ° C) quando DO600 atinge um valor de cerca de 1,0 a induzir a expressão da proteína tau recombinante. </li><li> Continuar a incubação a 37 ° C durante mais 3 h. Recolher as células bacterianas por centrifugação a 5000 xg durante 20 min. </li><li> Congelar o sedimento bacteriano a -20 ° C. Manter congelado até que o passo de purificação, por um período prolongado, se necessário. </li></ol> 2. A purificação de 15 N, 13 C-tau (Figura 2) <ol><li> permuta catiónica autoclave (CEX) tampões de purificação a 121 ° C sob 15 psi durante 20 min. buffers armazenar a 4 ° C. </li><li> Descongelar o sedimento de células bacterianas e ressuspender completamente em 45 mlextracção de CEX num tampão (50 mM de tampão NaPi, pH 6,5, EDTA 1 mM) suplementado fresco com 1x cocktail inibidor de protease (1 comprimido) e DNAseI (2000 unidades). </li><li> Dissociação das células bacterianas, utilizando um homogeneizador de alta pressão a 20000 psi. 3-4 passagens são necessárias. Centrifuga-se a 20000 xg durante 40 min para remover o material insolúvel. </li><li> Aquecer o extracto de células bacterianas durante 15 min a 75 ° C usando um banho de água. NOTA: um precipitado branco é observada depois de alguns minutos. </li><li> Centrifugar a 15000 xg durante 20 min e manter o sobrenadante contendo a proteína tau estável ao calor. </li><li> Armazenar a -20 ° C até que o seguinte passo de purificação, se necessário. </li><li> Executar uma cromatografia de permuta catiónica numa resina de CEX fortes embalado como uma coluna de 5 mL utilizando um leito de proteína rápida sistema de cromatografia líquida (FPLC) (Figura 3 A). <ol><li> Ajustar a taxa de fluxo de 2,5 ml / min. </li><li> Equilibrar a coluna em tampão A CEX </li><li> Carregar a 60-70 ml heated-extracto contendo tau utilizando uma bomba de amostra, ou alternativamente bomba A, dependendo do sistema. Recolhe-se o fluxo através de análise para verificar que a proteína de tau é eficiente ligação à resina (ver 2.8). </li><li> Lava-se a resina de CEX com um tampão até que a absorvância a 280 nm é de volta ao valor da linha de base. </li><li> Eluir tau a partir da coluna usando um gradiente de NaCl em três fases obtidas por aumento progressivo de tampão B CEX (CEX Um tampão com 1 M de NaCl). Programa do FPLC como se segue: primeiro passo do gradiente de 25% de tampão de CEX B em 10 volumes de coluna (CV) para chegar a 250 mM de NaCl, segundo passo de 50% de tampão de CEX B em 5 VC de alcançar NaCl 500 mM, e o terceiro passo a 100% de tampão B, em CEX 2 CV para chegar a 1 M de NaCl. Recolha fracções de 1,5 ml durante os passos de eluição. </li></ol></li><li> Analisar 10 ul das fracções recolhidas durante o passo de eluição por SDS-PAGE (12% de gel de SDS-acrilamida) e coloração com Coomassie (Figura 3 A) 16. Verificar o passo de carregamento sobre a coluna, assim por Analyzing 10 ul de fluxo de passagem. </li><li> Escolha as fracções contendo tau e agrupar as fracções para o passo seguinte. </li><li> Executar uma troca de tampão em frações Tau contendo agregados (Figura 3 B). <ol><li> Equilibrar a coluna de dessalinização de 53 ml de G25 resina de leito fixo (26 x 10 cm) em bicarbonato de amónio 50 mM (tampão volátil) utilizando um sistema de FPLC. </li><li> Ajustar a taxa de fluxo de 5 ml / min. Injectar a amostra Tau em coluna através de uma ansa de injecção de 5 ml. Recolha fracções correspondentes ao pico de absorção a 280 nm. </li><li> Repetir a injecção 3-4 vezes, dependendo do volume da piscina CEX inicial. </li></ol></li><li> Calcula-se a quantidade de proteína tau purificada usando a área do pico do cromatograma de 280 nm (1 mg de Tau corresponde a 140 mAU * mL). NOTA: O coeficiente de extinção da proteína tau a 280 nm é 7550 M -1 cm -1. O Tau não contém quaisquer resíduos de Trp. </li><li> Piscina todas as fracções Tau. </li><li> aliquot a amostra para tubos contendo o equivalente a 1 a 5 mg de Tau. Escolha estes tubos de modo que o volume da solução é pequeno comparado com o volume do tubo (por exemplo, 5 ml de solução em um tubo de 50 ml). </li><li> Faça furos nas tampas de tubos usando uma agulha. Congele as amostras Tau-se a -80 ° C. </li><li> amostras Liofilizar Tau. proteína Tau liofilizado pode ser conservado a -20 ° C durante longos períodos de tempo. </li></ol> 3. A fosforilação in vitro de 15 N-Tau <ol><li> Dissolve-se 5 mg de liofilizado da tau em 500 ul de tampão de fosforilação (Hepes 50 mM-KOH, pH 8,0, MgCl 2 12,5, EDTA 1 mM, NaCl 50 mM). </li><li> Adicionar ATP 2,5 mM (25 ul de uma solução de estoque 100 mM mantida a -20 ° C), 1 mM de DTT (1 ul de uma solução de estoque 1 M mantido a -20 ° C), 1 mM de EGTA (2 ul de um estoque 0,5 M solução), 1x cocktail inibidor de protease (25 ul de uma estoque 40x obtida por dissolução de um comprimido em tampão de fosforilação 1 ml) e 181; H activado His-ERK2 (250 ul em tampão de conservação 10 mM de Hepes, pH 7,3, DTT 1 mM, MgCl2 5 mM, NaCl 100 mM e glicerol a 10%, armazenado a -80 ° C) num volume total de amostra de 1 ml. NOTA: O activada His-ERK2 pode ser preparada in-house 5,8 por fosforilação com a quinase MEK. </li><li> Incubar 3 horas a 37 ° C. </li><li> Aquece-se a amostra a 75 ° C durante 15 minutos para inactivar a quinase ERK. </li><li> Centrifugar a 20000 xg durante 15 min. Recolher e guardar o sobrenadante. </li><li> Dessalinizar a amostra de proteína em bicarbonato de amónio 50 mM, utilizando uma coluna de 3,45 ml de G25 resina de leito empacotado (1,3 x 2,6 cm), que é apropriado para uma amostra de 1 ml. </li><li> Executar um 12% de SDS-PAGE a 16 com 2,5 mL da amostra de proteína, para verificar a sua integridade e a fosforilação eficiente (Figura 4). </li><li> Liofilizar a amostra tau fosforilada. Armazenar o pó a -20 ° C. </li></ol> 4. A aquisição de espectros (Figura 5) <ol><li> Solubiliza-se 4 mg de liofilizado de 15 N, 13 C-ERK fosforilada-tau em 400 ul de tampão RMN (NaPi 50 mM ou 50 mM de Tris-deuterados .cl D11, pH 6,5, NaCl 30 mM, EDTA 2,5 mM e DTT 1 mM). </li><li> Adicionam-se 5% de D 2 O para o bloqueio de campo do espectrómetro de RMN e TMSP 1 mM (3- (trimetilsilil) 4 sal de sódio de ácido propiónico-2,2,3,3-d)) como sinal de referência RMN interna. Adicionam-se 10 ul de uma solução de estoque de 40x cocktail completo de inibidor de protease. </li><li> Transfira a amostra num tubo de RMN de 5 milímetros usando uma seringa com uma agulha electrónico longo ou pipeta de Pasteur. Fechar o tubo de RMN utilizando o êmbolo. Remover qualquer bolha de ar presa entre êmbolo e líquidos por movimentos de êmbolo. </li><li> Coloque o tubo de RMN em um spinner. Ajustar a sua posição vertical no elemento rotativo com o calibre adequado para a cabeça da sonda de RMN utilizado, de tal modo que a maior parte da solução da amostra estará dentro da bobina de RMN. </li><li> Inicie o fluxo de ar: clique elevador in janela do sistema de controle imã. Cuidadosamente colocar o spinner com o tubo no fluxo de ar na parte superior do magneto. Parar o fluxo de ar (clique elevador) e deixar o tubo descer no lugar dentro da cabeça sonda no ímã. </li><li> Ajuste da temperatura a 25 ° C (298 K). </li><li> Executar o ajuste semi-automático e correspondência da cabeça da sonda para otimizar a transmissão de energia. Digite ATMM na linha de comando. </li><li> Bloquear a frequência espectrómetro usando o sinal D 2 O, a amostra gravada no canal de deutério. Clique cadeado na janela do sistema de controle imã. </li><li> Iniciar o procedimento de calços para optimizar a homogeneidade do campo magnético na posição da amostra. Digite topshim gui na linha de comando para abrir a janela calço. Clique em Iniciar na janela de calço. Verifique o valor da variação padrão B0 residual para verificar se os calços são ideais (menos de 2 Hz é bom). </li><li> Calibrar o parâmetro P1 (comprimento de um protãoimpulso de radiofrequência em ms), o que é necessário para se obter uma rotação de 90 ° de protão rotações. Alvo para o pulso de 360 ° usando um espectro 1D dos protões da água (Figura 6). </li><li> Ajustar o deslocamento definindo o parâmetro o1 (em Hz) para a freqüência de água de prótons no espectro de 1D (Figura 6) frequência. </li><li> Comece a aquisição de um espectro de protão 1D (sequência de impulsos com a sequência comporta para a supressão do sinal da água, por exemplo zggpw5) para verificar os sinais a partir da amostra (Figura 7). Adaptar o número de varreduras com a concentração relativa de proteína. Digite zg na linha de comando para iniciar a aquisição. </li><li> Configurar parâmetros adicionais para a aquisição de um 2D [1 H, 15 N] HSQC espectro (pulso sequência hsqcetfpf3gpsi, as Figuras 8-9). <ol><li> Para a 15 N, 13 C rotulado de exemplo, dissociar 13 C durante a evolução indireta 15 N. </li><li&gt; Definir o número de pontos ea largura espectral (ppm) na 1 H (F2) e 15 N dimensões (F1). NOTA: Adaptar o número de pontos de dados de aquisição para o campo espectrômetro para manter um número semelhante de Hz por ponto e para limitar tempos de dissociação: use 3.072 pontos em 900 MHz e 2.048 pontos em 600 MHz, na dimensão 1H. </li><li> Otimizar os parâmetros adicionais nas sequências de pulso, correspondente a atrasos, comprimentos de onda, a compensação frequências, níveis de potência. Tipo ased na linha de comando para exibir todos os parâmetros relevantes para o experimento. </li></ol></li><li> Definir parâmetros para a aquisição de um 3D [1 H, 15 N, 13 C] espectro HNCACB (hncacbgpwg3d sequência de impulsos, Figura 10A) a 600 MHz. </li><li> Definir parâmetros para um 3D [1 H, 15N, 15N] experimento HNCANNH (pulso sequência hncannhgpwg3d) a 600 MHz. Defina o número de pontos de 2048 no 1 H e, 64e 128 pontos nas duas dimensões de 15 N. Definir as larguras espectrais como 14, 25, 25 partes por milhão (ppm) centrado no 4.7, 119, 119 ppm no 1 H, 15 N e 15 N dimensões. Duração da aquisição, com 16 exames é de 1 dia e 22 horas. </li></ol> 5. Identificação de sítios de fosforilação <ol><li> Os espectros de processo utilizando software de aquisição e processamento de RMN. <ol><li> Executar uma transformação de Fourier dos dados (Figura 7). Tipo ft para um espectro de 1D, XFB para um espectro 2D ou ft3d para um espectro 3D, na linha de comando. </li><li> Fase e todos os espectros de referência (Figura 7C) utilizando as janelas interactivas. </li></ol></li><li> Identificar ressonâncias de interesse na HSQC 2D potencialmente correspondente aos resíduos fosforilados Ser e Thr (Figura 9, caixa vermelha). </li><li> Planos de extracção (isto é, 2D 1 H- 13 C espectros) deo espectro de C 3D 1 H- 15 N- 13 usando os desvios químicos de 15N de ressonâncias de interesse no 2D. Usar o cursor de dimensão dois (W2) para escolher a frequência de 15 N correspondente ao plano (W1-W3) para ser visualizado (Figura 10B). </li><li> Escolha as frequências de ressonância de &#39;CA&#39; e &#39;CB&#39; 13 C núcleos do &#39;i&#39; e resíduos &#39;i-1&#39; (set mais fraca de sinais em comparação com aqueles do resíduo i) para cada [1 H, 15 N] ressonância de interesse no espectro HNCACB 3D clicando na ressonância, no menu do modo de ponteiro encontrar / adicionar pico, para adicionar o valor de desvio químico em um arquivo de lista de pico. <ol><li> Identificar o tipo i resíduo, pSer ou Pthr, comparando-se os deslocamentos químicos na lista de pico para valores conhecidos de CA e mudanças CB químicos de pSer e Pthr 17. </li><li> Identificar a presença de um resíduo Pro na posição i + 1 por uma característica adicional 2 ppm O deslocamentof o valor da deslocação CA química 18. </li><li> Comparar os valores dos desvios químicos das ressonâncias Ca e Cb correspondentes ao resíduo i-1 a uma tabela de desvios químicos previstos para os resíduos de aminoácidos da tau 19 para identificar a natureza do resíduo na posição i-1. </li></ol></li><li> Escolha as frequências de ressonância de 15 N núcleos do &#39;i&#39; e &#39;i-1&#39; resíduos para cada ressonância [1 H, 15 N] de interesse no espectro HNCANNH. </li><li> Comparar os valores dos desvios químicos de 15N para a atribuição de desvio químico da proteína Tau 20-23. </li><li> Compare as dipï¿½tidos identificados com a sequência de Tau para definir a atribuição específica de sequência. </li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Temos usado espectroscopia de RMN para caracterizar amostras Tau enzimaticamente modificados. A expressão recombinante e purificação descritos aqui para a proteína tau humana de comprimento completo podem ser igualmente utilizados para produzir domínios tau ou mutantes Tau. Isotopicamente enriquecido proteína é necessária para a espectroscopia de RMN, necessitando de expressão recombinante. Identificação dos locais de fosforilação exige atribuição de ressonância e uma proteína duplamente marcada de 15 N, <sup...

Um dos principais desafios da saúde no século 21 são as doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (DA). Tau é uma proteína associada a microtúbulos que estimula a formação de microtúbulos (MT). Tau está igualmente envolvido em várias doenças neurodegenerativas, os chamados tauopatias, dos quais o mais conhecido é AD. Nestes distúrbios, Tau auto-agregados em filamentos helicoidais emparelhados (PHFs) e é encontrado modificado em muitos resíduos por modificações pós-translacionais (PTMS), tais como fosforilação 1. A fosforilação da proteína tau está implicado tanto na regulação da sua função fisiológica de estabilização de MT e da perda da função patológica que caracteriza neurónios AD. Além disso, a proteína Tau, quando integrado no PHF em neurónios doentes, é invariavelmente hiperfosforilada 2. Ao contrário Tau normal que contém 2-3 grupos fosfato, o Tau hiperfosforilada em PHF contém 5-9 phosphate os grupos 3. Hiperfosforilação de Tau corresponde tanto a um aumento da estequiometria em alguns locais e a fosforilação de sítios adicionais que são chamados locais de fosforilação patológicas. No entanto, existe sobreposição entre AD e padrões adultos normais de fosforilação, apesar das diferenças quantitativas no nível 4. Como eventos de fosforilação função de influência e disfunção de Tau específica permanece em grande parte desconhecido. Nosso objetivo é decifrar regulação Tau por PTMs no nível molecular. Para aprofundar a compreensão dos aspectos moleculares de Tau, temos de enfrentar os desafios técnicos. Em primeiro lugar, uma proteína tau é intrinsecamente desordenados (PDI), quando isolados em solução. Estas proteínas não têm estrutura tridimensional bem definida em condições fisiológicas e requerem determinados métodos biofísicos para estudar a sua função (s) e as propriedades estruturais. Tau é um paradigma para a crescente classe dos deslocados internos, muitas vezes encontrados associadospatologias como doenças neurodegenerativas, aumentando assim o interesse para compreender os parâmetros moleculares subjacentes suas funções. Em segundo lugar, a caracterização de Tau fosforilação é um desafio analítico, com 80 potenciais locais de fosforilação ao longo da sequência da tau isoforma mais longa 441 amino-ácido. Um certo número de anticorpos têm sido desenvolvidos contra epítopos de tau fosforilados e são utilizados para a detecção de tau patológica em neurónios ou tecido cerebral. eventos de fosforilação pode ter lugar em, pelo menos 20 locais visados ​​pelas cinases dirigidas-prolina, a maioria deles em estreita proximidade no interior da região rica em prolina. O qualitativa (que sites?) E caracterização quantitativa (o que estequiometria?) É difícil, mesmo pelas mais recentes técnicas de MS 5. espectroscopia de RMN pode ser utilizada para investigar as proteínas desordenados que são altamente dinâmicos sistemas constituídos por conjuntos de confórmeros. espectroscopia de RMN de alta resolução foi apliEd para investigar a estrutura e função da proteína tau. Além disso, a complexidade do perfil a fosforilação da tau, levou ao desenvolvimento de ferramentas moleculares e novos métodos de análise utilizando RMN para a identificação de sítios de fosforilação 6 - 8. RMN como um método analítico permite a identificação de locais de fosforilação da tau de um modo global, a visualização de todas as modificações de sítio único numa única experiência, e a quantificação da extensão da incorporação de fosfato. Este ponto é essencial, pois embora os estudos de fosforilação sobre Tau abundam na literatura, a maioria deles têm sido realizados com anticorpos, deixando um grande grau de incerteza sobre o perfil completo de fosforilação e, assim, o verdadeiro impacto de eventos de fosforilação individuais. cinases recombinantes incluindo PKA, 3β glicogênio sintase-quinase (Gsk3β), ciclina dependente de quinase 2 / ciclina A (CDK2 / CycA), quinase ciclina-dependentes 5 (CDK5) / p25 actproteína ivator,-extracelular sinal-quinase regulada 2 (ERK2) e microtúbulos-quinase regula-afinidade (MARK), que apresentam uma actividade no sentido de fosforilação da tau, pode ser preparada numa forma activa. Além disso, os mutantes Tau que permitem a geração de isoformas da proteína tau específicas com padrões de fosforilação bem caracterizados são usadas para decifrar o código de fosforilação de tau. Espectroscopia de RMN é então usado para caracterizar amostras Tau enzimaticamente modificados 6 - 8. Embora a fosforilação in vitro de tau é mais difícil do que o pseudo-fosforilação tal como por mutação da seleccionados Ser / Thr em resíduos de ácido glutâmico (Glu), esta abordagem tem as suas vantagens. De facto, nem os parâmetros de impacto nem interacção estruturais de fosforilação pode sempre ser mimetizado por ácidos glutâmicos. Um exemplo é o motivo por sua vez observada em torno fosfoserina 202 (pSer202) / fosfotreonina 205 (pThr205), que não é reproduzida com Glu mutações 9. <p claSS = &quot;jove_content&quot;&gt; Aqui, a preparação de Tau marcado isotopicamente para investigações de RMN serão descritos em primeiro lugar. proteína tau fosforilada por ERK2 é modificado em vários sites descritos como locais patológicos de fosforilação, e, portanto, representa um interessante modelo de Tau hiperfosforilada. Um protocolo detalhado de Tau na fosforilação in vitro pela quinase ERK-2 recombinante é apresentada. ERK2 é activada por fosforilação de proteína quinase activada mitogénio / ERK-cinase (MEK) 10-12. Além disso para a preparação de proteína Tau modificado, marcado isotopicamente, a estratégia de RMN utilizado para a identificação do PTMs é descrito.

<table><tbody><tr><td>plasmídeo de expressão T7 recombinante pET15B</td><td>Novagen</td><td>69257</td><td>Mantenha em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>BL21 (DE3) transformação competente E. coli bactérias</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td>Manter em -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Caldo LB Autoclavado, Lennox&nbsp;</td><td>DIFCO</td><td>240210</td><td>Meio de Crescimento Bacteriano</td></tr><tr><td>Suplementos vitamínicos MEM 100x</td><td>Sigma</td><td>58970C</td><td>Suplemento de Meio de Crescimento Bacteriano</td></tr><tr><td>15N, 13C-ISOGRO pó de meio completo</td><td>Sigma</td><td>608297</td><td>Suplemento de Meio de Crescimento Bacteriano</td></tr><tr><td>15NH4Cl</td><td>Isótopo Sigma</td><td>299251</td><td></td></tr><tr><td>13C6-glicose</td><td>Sigma</td><td>389374</td><td>comprimidos inibidores de protease isotópica</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td>Manter em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>1 comprimido em 1 ml é uma solução 40x que pode ser mantida a -20 &graus; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>EUROMEDEX</td><td>1307</td><td>Manter a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>Homogeneizador (EmulsiFlex-C3)</td><td>AVESTIN</td><td></td><td>Lysis é realizado a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Marcador MW de proteína não corada</td><td>Pierce</td><td>266109</td><td></td></tr><tr><td>quinase MEK1 humana ativa, GST Tagged</td><td>Sigma</td><td>M8822</td><td>Mantenha em -80 &deg; C</td></tr><tr><td>AKT&Auml; Sistema de cromatografia pura</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>HiTrap SP Sepharose FF (coluna de 5 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5156-01</td><td>Colunas de cromatografia de troca catiônica</td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 GE</td><td>Healthcare</td><td>17-5087-01</td><td>Coluna de dessalinização de proteínas</td></tr><tr><td>PD MidiTrap G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9180-08</td><td>Coluna de dessalinização de proteínas</td></tr><tr><td>Tris D11, 97% D</td><td>Cortecnet</td><td>CD4035P5</td><td>Tampão de RMN deuterado</td></tr><tr><td>Microtubo simétrico SHIGEMI D2O (conjunto de 5 tubos internos e externos)&nbsp;</td><td>Euriso-top</td><td>BMS-005B</td><td>NMR Shigemi Tubes</td></tr><tr><td>eVol kit-kit inicial de seringa eletrônica</td><td>Cortecnet</td><td>2910000</td><td>Pipetagem</td></tr><tr><td>Bruker 900 MHz AvanceIII com uma cabeça de sonda criogênica de ressonância tripla</td><td>Espectrômetro de RMN</td><td>Bruker</td><td></td> para aquisição de dados</tr><tr><td>Bruker 600 MHz Avance com uma cabeça de sonda criogênica de ressonância tripla</td><td>Espectrômetro de RMN</td> <td>Bruker</td><td></td> para aquisição de dados</tr><tr><td>TopSpin 3.1</td><td>Bruker</td><td></td><td>Software de aquisição e processamento para experimentos de RMN</td></tr><tr><td>Sparky 3.114</td><td>UCSF (T. D. Goddard e D. G. Kneller)</td><td></td><td>Software de análise de dados de RMN</td></tr></tbody></table>

espectroscopia de ressonância magnética nuclear para a identificação de múltiplas fosfolarização de intrinsecamente desordenados proteínas

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Agregados da proteína neuronal Tau são encontrados dentro dos neurônios de pacientes com doença de Alzheimer. O desenvolvimento da doença é acompanhado por aumento da fosforilação anormal de Tau. No decorrer da investigação molecular das funções e disfunções da Tau na doença, a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) é usada para identificar as múltiplas fosforilações da Tau. Apresentamos aqui protocolos detalhados de produção recombinante de Tau em bactérias, com enriquecimento isotópico para estudos de RMN. São descritas as etapas de purificação que aproveitam a estabilidade térmica e o alto ponto isoelétrico da Tau. O protocolo de fosforilação in vitro de Tau por ERK2 ativado recombinante permite a geração de múltiplas fosforilações. A amostra de proteína está pronta para aquisição de dados na emissão dessas etapas. A configuração do parâmetro para iniciar a gravação no espectrômetro é considerada a seguir. Finalmente, a estratégia para identificar sítios de fosforilação de Tau modificado, com base em dados de RMN, é explicada. O benefício dessa metodologia em comparação com outras técnicas usadas para identificar locais de fosforilação, como imunodetecção ou espectrometria de massa (MS), é discutido.

A Figura 3A mostra um pico principal de absorção a 280 nm observados durante o gradiente de eluio. Este pico corresponde à proteína Tau purificada como visto no gel de acrilamida sobre o cromatograma. A Figura 3B mostra um pico de absorção bem separadas a 280 nm e o pico de condutividade, assegurando que a dessalinização da proteína é eficiente. A Figura 4 mostra a proteína de desvio em gel observada por análise de SDS-PAGE a 16 característica de fosforilação de proteínas múltipl...

Descrevemos aqui um método para identificar fosforilações múltiplas de uma proteína intrinsecamente desordenada por Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), usando a proteína Tau como estudo de caso. A Tau recombinante é isotopicamente enriquecida e modificada in vitro por uma quinase antes da aquisição e análise dos dados.

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para a identificação de múltiplas fosfolarização de intrinsecamente desordenados Proteínas

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

O objetivo geral desta metodologia é identificar a fosforilação múltipla de uma proteína intrinsecamente desordenada por espectroscopia de ressonância magnética nuclear usando a proteína tau como estudo de caso. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na regulação molecular relacionadas à doença, como o impacto da fosforilação na interação da proteína com seu parceiro molecular. A principal vantagem dessa técnica é que podemos identificar a fosforilação específica do local em uma proteína desordenada e relacioná-la com alterações estruturais e funcionais.Esse método pode fornecer informações sobre a função. Também pode ser aplicado a outras proteínas, como os restos desordenados da proteína de DNA do vírus aPtc As aplicações desta técnica se estendem à terapia pelo desenvolvimento de proteínas, inibidores de interação proteica. Este método será demonstrado por Clement Danis, Clement Despres, Luiza Bessa e Hamida Merzougui, os alunos de doutorado do nosso grupo.Para começar, misture suavemente 50 microlitros de células BL21 competentes com 100 nanogramas de DNA de plasmídeo, formando de 10 a 15 milhões de colônias por micrograma de DNA plasmático em um tubo de plástico de 1,5 mililitro. Depois de colocar a mistura de células no gelo por 30 minutos, choque térmico por 10 segundos a 42 graus Celsius. Em seguida, coloque o tubo de volta no gelo por cinco minutos antes de adicionar um mililitro de Luria Bertani ou LB médio em temperatura ambiente.Incubar a suspensão bacteriana a 37 graus Celsius durante 30 minutos sob agitação suave. Usando um espalhador, espalhe 100 microlitros da suspensão celular uniformemente em uma placa de ágar de meio LB contendo 100 microgramas por mililitro de antibiótico ampicilina. Incubar a placa de seleção durante 15 horas a 37 graus Celsius.Em seguida, solubilize 300 miligramas de meio enriquecido com nitrogênio 15 e carbono 13, um grama de cloreto de amônio nitrogênio 15 e dois gramas de glicose marcada com carbono 13 em 10 mililitros de meio M9. Esterilizar o filtro da solução isotópica directamente no meio M9 utilizando um filtro de 0,2 mícron. Usando uma pipeta pasteur, suspender uma colônia da bactéria transformada em plasma recombinante da placa de seleção em 20 mililitros de meio LB, suplementado com 100 microgramas por mililitro de ampicilina.Incubar o meio inoculado a 37 graus Celsius durante cerca de seis horas. Meça a densidade óptica em 600 nanômetros ou OD600 usando um mililitro de uma diluição de dez vezes da cultura bacteriana em uma cubeta de espectrômetro de plástico. Em seguida, adicione 20 mililitros da cultura LB saturada a um litro de meio de crescimento M9 suplementado com ampicilina em um frasco de cultura com defletor de vidro Erlenmeyer de dois litros.Colocar o balão de cultura numa incubadora programável regulada para 10 graus Celsius e 50 RPM. Programe a incubadora para mudar para 200 RPM e 37 graus Celsius no início da manhã do dia seguinte. Meça o OD600 em um mililitro de cultura bacteriana em uma cubeta de espectrômetro de plástico.Adicione 400 microlitros de uma solução estoque molar de IPTG quando o OD600 atingir um valor de cerca de 1,0 para induzir a expressão da proteína tau recombinante. Depois de incubar as células bacterianas a 37 graus Celsius por mais três horas, colete-as por centrifugação a 5.000 vezes g por 20 minutos. Descongele o pellet de células bacterianas e ressuspenda-o completamente em 45 mililitros de tampão de troca catiônica A, recém-suplementado com 1x coquetel inibidor de protease DNasel 1.Interrompa as células bacterianas usando um homogeneizador de alta pressão a 20.000 PSI, três a quatro passagens são necessárias para interromper adequadamente as células. Centrifugar as células descontínuas a 20 000 vezes g durante 40 minutos para remover o material insolúvel. Aqueça o extrato de células bacterianas por 15 minutos a 75 graus Celsius usando um banho-maria.Um precipitado branco será observado após alguns minutos. Em seguida, centrifugue o extracto aquecido a 15 000 vezes g durante 20 minutos e mantenha o sobrenadante contendo a proteína tau estável ao calor. Em seguida, execute a cromatografia de troca catiônica em uma resina CEX forte embalada como uma coluna de leito de 5 mililitros usando um sistema rápido de cromatografia líquida de proteína.Defina a vazão em 2.5 mililitros por minuto e equilibre a coluna no buffer CEX A. Em seguida, carregue o extrato de tau aquecido de 60 a 70 mililitros usando uma bomba de amostra, colete o fluxo para análise para verificar se a proteína tau está se ligando eficientemente à resina. Lave a resina com tampão CEX A até que a absorbância a 280 nanômetros volte ao valor inicial.Programe o FPLC com um gradiente de até 25% de tampão CEX B em 10 volumes de coluna para atingir 250 milimolares de cloreto de sódio. Siga isso com tampão 50% CEX B em cinco volumes de coluna para atingir 500 milimolares de cloreto de sódio. Finalmente, aumente o gradiente para 100% de tampão CEX B em dois volumes de coluna para atingir um molar de cloreto de sódio.Colete frações de 1,5 mililitro durante as etapas de eluição. Em seguida, execute uma troca de buffer no tau contendo frações agrupadas. Equilibre uma coluna de dessalinização com um leito de resina G25 de 53 mililitros em tampão de bicarbonato de amônio de 15 milimolares usando um sistema FPLC.Defina a taxa de fluxo para cinco mililitros por minuto e injete a amostra de tau na coluna por meio de um loop de injeção de cinco mililitros. Coletar as frações correspondentes ao pico de absorção a 280 nanômetros. Agrupe todas as frações de tau antes de alocar a amostra nos tubos.Escolha esses tubos de forma que o volume da solução seja pequeno em comparação com o volume do tubo. Em seguida, faça furos nas tampas dos tubos usando uma agulha antes de congelar as amostras de tau a 80 graus Celsius negativos para liofilização posterior. Solubilizar quatro miligramas de tau fosforilada enriquecida com nitrogênio 15 liofilizado e carbono 13 em 400 microlitros de tampão NMR.Adicione cinco por cento de óxido de deutério para bloqueio de campo do espectrômetro de RMN e um TMSP milimolar como referência de sinal de RMN interna. Além disso, adicione 10 microlitros de uma solução estoque de 40 EK de um coquetel completo de inibidores de protease. Transferir a amostra para um tubo de RMN de cinco mililitros utilizando uma seringa electrónica com agulha longa ou utilizando uma pipeta pasteur.Feche o tubo de RMN usando o êmbolo. Remova quaisquer bolhas de ar presas entre o êmbolo e o líquido movendo o êmbolo. Coloque o tubo de RMN em um spinner.Use o medidor apropriado para ajustar sua posição vertical no spinner de modo que a maior parte da solução de amostra fique dentro da bobina de RMN. Em seguida, inicie o fluxo de ar no instrumento de RMN clicando em levantar na janela Sistema de controle magnético. Coloque cuidadosamente o spinner com o tubo no fluxo de ar na parte superior do orifício do ímã.Em seguida, pare o fluxo de ar e deixe o tubo descer no lugar dentro da cabeça da sonda dentro do ímã. Depois de permitir que a amostra se equilibre a 25 graus Celsius, digite ATMM na linha de comando para realizar o ajuste semiautomático e a correspondência do cabeçote da sonda para otimizar a transmissão de energia. Em seguida, clique no cadeado na janela do Sistema de Controle Magnético para ativar o bloqueio de frequência de campo do espectrômetro.Inicie o procedimento de calço para otimizar a homogeneidade do campo magnético na posição da amostra digitando primeiro TopShim GUI na linha de comando para abrir a janela de calço. Em seguida, clique em iniciar na janela de correção. Verifique o desvio padrão residual B0 para verificar se os calços são ideais.Em seguida, calibre o parâmetro P1, que é o comprimento de um pulso de radiofrequência de prótons em microssegundos. Este parâmetro é necessário para obter uma rotação de 90 graus da magnetização do spin do próton. Aponte para o pulso de 360 graus usando um espectro unidimensional de prótons de água.Ajuste o deslocamento de frequência definindo o parâmetro O1 para a frequência da água de prótons no espectro unidimensional. Por fim, inicie a aquisição do espectro de prótons unidimensional digitando ZG na linha de comando. Um resultado representativo da purificação da tau recombinante mostra um grande pico de absorção em 280 nanômetros observado durante o gradiente de eluição.Este pico corresponde à proteína tau purificada, conforme visto no gel de acrilamida acima do cromatograma. O cromatograma para dessalinização da tau purificada recombinante mostra que o pico de absorção em 280 nanômetros e o pico de condutividade estão bem separados, garantindo que a dessalinização da proteína seja eficiente para a etapa de liofilização. O espectro de RMN unidimensional de nitrogênio recombinante 15 tau a 900 megahertz confirma que um sinal de RMN da amostra de proteína pode ser detectado.Uma boa relação sinal-ruído indica que os parâmetros básicos de aquisição foram definidos corretamente. O espectro bidimensional da proteína fosforilada mostra boa resolução, as ressonâncias são estreitas e bem separadas. As ressonâncias na região do espectro encaixotadas em vermelho correspondem aos resíduos fosforilados.Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de produzir uma proteína recombinante com rotulagem fácil de escolher, purificar essa proteína e configurar o parâmetro básico para aquisição de dados de espectro. Uma vez dominado, este protocolo pode ser feito em duas semanas se estiver organizado adequadamente. Não se esqueça de que a espectroscopia de RMN usa ímãs muito fortes que não devem ser abordados com objetos metálicos.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que essas outras proteínas são sensíveis à lise da protease e uma série de precauções devem ser tomadas para evitar a degradação da amostra. Após este procedimento, outros métodos, como RMN em estado sólido, podem ser aplicados para investigar os agregados semelhantes a amilóide que geralmente são formados por proteínas desordenadas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores da área de biologia química explorassem compostos ativos com potencial serapático em sistemas modelo in vitro.

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Research

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Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo demonstra o uso de técnicas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) para identificar múltiplas fosforilações em uma proteína. A fosforilação de uma proteína em aminoácido específico causa a desblindagem do hidrogênio amida vizinho, que gera a diferença espectral.

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para Identificar Múltiplas Fosforilações em Proteínas

Descrevemos aqui um protocolo para a purificação e caracterização de complexos de proteínas de plantas. Nós demonstramos que por imunoprecipitando uma única proteína dentro de um complexo, para que possamos identificar as suas modificações pós-traducionais e seus parceiros que interagem.

Identificação de modificações pós-translacionais de Complexos de proteína vegetal

flexibilidade conformacional desempenha um papel crucial na função da proteína. Aqui, nós descrevemos o uso de espectrometria de massa por ionização por electropulverização resolvida no tempo acoplado a troca de hidrogénio-deutério para sondar as rápidas mudanças estruturais que conduzem a função de proteínas ordenadas e desordenadas.

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Os ensaios de competição de péptidos são amplamente utilizados numa variedade de experiências moleculares e imunológicas. Este artigo descreve um método detalhado para um ensaio de quinase competitiva com oligopéptido in vitro e os procedimentos de validação associados, que podem ser úteis para encontrar locais de fosforilação específicos.

Ensaio de Competição Oligopeptídica para Determinação de Sítio de Fosforilação

Estruturas de conjuntos supramoleculares proteína em resolução atômica são de alta relevância, por causa de seus papéis cruciais em uma variedade de fenômenos biológicos. Neste documento, apresentamos um protocolo para realizar estudos estruturais de alta resolução em assemblies de proteína macromolecular insolúvel e não cristalina por magia-ângulo girando espectroscopia da ressonância magnética nuclear Solid-State (MAS SSNMR).

Escala atômica estudos estruturais de conjuntos macromoleculares por espectroscopia de estado sólido da ressonância magnética Nuclear

Quinase cyclin-dependente 1 (Cdk1) é ativada na fase G2 do ciclo celular e regula muitos caminhos celulares. Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio da quinase em vitro Cdk1, que permite a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1-específicos para o estabelecimento de alvos celulares deste importante quinase.

Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

Um protocolo para a aplicação de espectroscopia de RMN de realce por relaxação paramagnética para detectar interações inter e intramoleculares fracas e transitórias em proteínas intrinsecamente desordenadas é apresentado.

Aprimoramento do relaxamento paramagnético para detecção e caracterização de auto-associações de proteínas intrinsecamente desordenadas

O presente protocolo descreve a preparação da amostra e a análise de dados para quantificar a fosforilação proteica usando um ensaio de recuo de molécula única (SiMPull).

Um ensaio de recuo de molécula única otimizado para quantificação da fosforilação de proteínas

Aqui, apresentamos um protocolo para o enriquecimento de fosfatrofames fosfoproteínas e suas proteínas interativas a partir de células e tecidos e sua identificação e quantificação por proteômica baseada em espectrometria de massa.

Uma abordagem baseada em espectrometria de massa para identificar fosfofamina fosfates e seus interacttores

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Experimentos de relaxamento de RMN 15N para a investigação da dinâmica estrutural de proteínas de picossegundos a nanossegundos

Aprenda a identificar fosforilações múltiplas em proteínas intrinsecamente desordenadas usando espectroscopia de ressonância magnética nuclear com a proteína Tau como estudo de caso. Este método permite mapear modificações específicas e suas alterações estruturais.

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para a identificação de múltiplas fosfolarização de intrinsecamente desordenados Proteínas (Vídeo) | JoVE Journal

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para a identificação de múltiplas fosfolarização de intrinsecamente desordenados Proteínas

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