Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para a identificação de múltiplas fosfolarização de intrinsecamente desordenados Proteínas

O objetivo geral desta metodologia é identificar a fosforilação múltipla de uma proteína intrinsecamente desordenada por espectroscopia de ressonância magnética nuclear usando a proteína tau como estudo de caso. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na regulação molecular relacionadas à doença, como o impacto da fosforilação na interação da proteína com seu parceiro molecular. A principal vantagem dessa técnica é que podemos identificar a fosforilação específica do local em uma proteína desordenada e relacioná-la com alterações estruturais e funcionais.

Esse método pode fornecer informações sobre a função. Também pode ser aplicado a outras proteínas, como os restos desordenados da proteína de DNA do vírus aPtc As aplicações desta técnica se estendem à terapia pelo desenvolvimento de proteínas, inibidores de interação proteica. Este método será demonstrado por Clement Danis, Clement Despres, Luiza Bessa e Hamida Merzougui, os alunos de doutorado do nosso grupo.

Para começar, misture suavemente 50 microlitros de células BL21 competentes com 100 nanogramas de DNA de plasmídeo, formando de 10 a 15 milhões de colônias por micrograma de DNA plasmático em um tubo de plástico de 1,5 mililitro. Depois de colocar a mistura de células no gelo por 30 minutos, choque térmico por 10 segundos a 42 graus Celsius. Em seguida, coloque o tubo de volta no gelo por cinco minutos antes de adicionar um mililitro de Luria Bertani ou LB médio em temperatura ambiente.

Incubar a suspensão bacteriana a 37 graus Celsius durante 30 minutos sob agitação suave. Usando um espalhador, espalhe 100 microlitros da suspensão celular uniformemente em uma placa de ágar de meio LB contendo 100 microgramas por mililitro de antibiótico ampicilina. Incubar a placa de seleção durante 15 horas a 37 graus Celsius.

Em seguida, solubilize 300 miligramas de meio enriquecido com nitrogênio 15 e carbono 13, um grama de cloreto de amônio nitrogênio 15 e dois gramas de glicose marcada com carbono 13 em 10 mililitros de meio M9. Esterilizar o filtro da solução isotópica directamente no meio M9 utilizando um filtro de 0,2 mícron. Usando uma pipeta pasteur, suspender uma colônia da bactéria transformada em plasma recombinante da placa de seleção em 20 mililitros de meio LB, suplementado com 100 microgramas por mililitro de ampicilina.

Incubar o meio inoculado a 37 graus Celsius durante cerca de seis horas. Meça a densidade óptica em 600 nanômetros ou OD600 usando um mililitro de uma diluição de dez vezes da cultura bacteriana em uma cubeta de espectrômetro de plástico. Em seguida, adicione 20 mililitros da cultura LB saturada a um litro de meio de crescimento M9 suplementado com ampicilina em um frasco de cultura com defletor de vidro Erlenmeyer de dois litros.

Colocar o balão de cultura numa incubadora programável regulada para 10 graus Celsius e 50 RPM. Programe a incubadora para mudar para 200 RPM e 37 graus Celsius no início da manhã do dia seguinte. Meça o OD600 em um mililitro de cultura bacteriana em uma cubeta de espectrômetro de plástico.

Adicione 400 microlitros de uma solução estoque molar de IPTG quando o OD600 atingir um valor de cerca de 1,0 para induzir a expressão da proteína tau recombinante. Depois de incubar as células bacterianas a 37 graus Celsius por mais três horas, colete-as por centrifugação a 5.000 vezes g por 20 minutos. Descongele o pellet de células bacterianas e ressuspenda-o completamente em 45 mililitros de tampão de troca catiônica A, recém-suplementado com 1x coquetel inibidor de protease DNasel 1.

Interrompa as células bacterianas usando um homogeneizador de alta pressão a 20.000 PSI, três a quatro passagens são necessárias para interromper adequadamente as células. Centrifugar as células descontínuas a 20 000 vezes g durante 40 minutos para remover o material insolúvel. Aqueça o extrato de células bacterianas por 15 minutos a 75 graus Celsius usando um banho-maria.

Um precipitado branco será observado após alguns minutos. Em seguida, centrifugue o extracto aquecido a 15 000 vezes g durante 20 minutos e mantenha o sobrenadante contendo a proteína tau estável ao calor. Em seguida, execute a cromatografia de troca catiônica em uma resina CEX forte embalada como uma coluna de leito de 5 mililitros usando um sistema rápido de cromatografia líquida de proteína.

Defina a vazão em 2.5 mililitros por minuto e equilibre a coluna no buffer CEX A. Em seguida, carregue o extrato de tau aquecido de 60 a 70 mililitros usando uma bomba de amostra, colete o fluxo para análise para verificar se a proteína tau está se ligando eficientemente à resina. Lave a resina com tampão CEX A até que a absorbância a 280 nanômetros volte ao valor inicial.

Programe o FPLC com um gradiente de até 25% de tampão CEX B em 10 volumes de coluna para atingir 250 milimolares de cloreto de sódio. Siga isso com tampão 50% CEX B em cinco volumes de coluna para atingir 500 milimolares de cloreto de sódio. Finalmente, aumente o gradiente para 100% de tampão CEX B em dois volumes de coluna para atingir um molar de cloreto de sódio.

Colete frações de 1,5 mililitro durante as etapas de eluição. Em seguida, execute uma troca de buffer no tau contendo frações agrupadas. Equilibre uma coluna de dessalinização com um leito de resina G25 de 53 mililitros em tampão de bicarbonato de amônio de 15 milimolares usando um sistema FPLC.

Defina a taxa de fluxo para cinco mililitros por minuto e injete a amostra de tau na coluna por meio de um loop de injeção de cinco mililitros. Coletar as frações correspondentes ao pico de absorção a 280 nanômetros. Agrupe todas as frações de tau antes de alocar a amostra nos tubos.

Escolha esses tubos de forma que o volume da solução seja pequeno em comparação com o volume do tubo. Em seguida, faça furos nas tampas dos tubos usando uma agulha antes de congelar as amostras de tau a 80 graus Celsius negativos para liofilização posterior. Solubilizar quatro miligramas de tau fosforilada enriquecida com nitrogênio 15 liofilizado e carbono 13 em 400 microlitros de tampão NMR.

Adicione cinco por cento de óxido de deutério para bloqueio de campo do espectrômetro de RMN e um TMSP milimolar como referência de sinal de RMN interna. Além disso, adicione 10 microlitros de uma solução estoque de 40 EK de um coquetel completo de inibidores de protease. Transferir a amostra para um tubo de RMN de cinco mililitros utilizando uma seringa electrónica com agulha longa ou utilizando uma pipeta pasteur.

Feche o tubo de RMN usando o êmbolo. Remova quaisquer bolhas de ar presas entre o êmbolo e o líquido movendo o êmbolo. Coloque o tubo de RMN em um spinner.

Use o medidor apropriado para ajustar sua posição vertical no spinner de modo que a maior parte da solução de amostra fique dentro da bobina de RMN. Em seguida, inicie o fluxo de ar no instrumento de RMN clicando em levantar na janela Sistema de controle magnético. Coloque cuidadosamente o spinner com o tubo no fluxo de ar na parte superior do orifício do ímã.

Em seguida, pare o fluxo de ar e deixe o tubo descer no lugar dentro da cabeça da sonda dentro do ímã. Depois de permitir que a amostra se equilibre a 25 graus Celsius, digite ATMM na linha de comando para realizar o ajuste semiautomático e a correspondência do cabeçote da sonda para otimizar a transmissão de energia. Em seguida, clique no cadeado na janela do Sistema de Controle Magnético para ativar o bloqueio de frequência de campo do espectrômetro.

Inicie o procedimento de calço para otimizar a homogeneidade do campo magnético na posição da amostra digitando primeiro TopShim GUI na linha de comando para abrir a janela de calço. Em seguida, clique em iniciar na janela de correção. Verifique o desvio padrão residual B0 para verificar se os calços são ideais.

Em seguida, calibre o parâmetro P1, que é o comprimento de um pulso de radiofrequência de prótons em microssegundos. Este parâmetro é necessário para obter uma rotação de 90 graus da magnetização do spin do próton. Aponte para o pulso de 360 graus usando um espectro unidimensional de prótons de água.

Ajuste o deslocamento de frequência definindo o parâmetro O1 para a frequência da água de prótons no espectro unidimensional. Por fim, inicie a aquisição do espectro de prótons unidimensional digitando ZG na linha de comando. Um resultado representativo da purificação da tau recombinante mostra um grande pico de absorção em 280 nanômetros observado durante o gradiente de eluição.

Este pico corresponde à proteína tau purificada, conforme visto no gel de acrilamida acima do cromatograma. O cromatograma para dessalinização da tau purificada recombinante mostra que o pico de absorção em 280 nanômetros e o pico de condutividade estão bem separados, garantindo que a dessalinização da proteína seja eficiente para a etapa de liofilização. O espectro de RMN unidimensional de nitrogênio recombinante 15 tau a 900 megahertz confirma que um sinal de RMN da amostra de proteína pode ser detectado.

Uma boa relação sinal-ruído indica que os parâmetros básicos de aquisição foram definidos corretamente. O espectro bidimensional da proteína fosforilada mostra boa resolução, as ressonâncias são estreitas e bem separadas. As ressonâncias na região do espectro encaixotadas em vermelho correspondem aos resíduos fosforilados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de produzir uma proteína recombinante com rotulagem fácil de escolher, purificar essa proteína e configurar o parâmetro básico para aquisição de dados de espectro. Uma vez dominado, este protocolo pode ser feito em duas semanas se estiver organizado adequadamente. Não se esqueça de que a espectroscopia de RMN usa ímãs muito fortes que não devem ser abordados com objetos metálicos.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que essas outras proteínas são sensíveis à lise da protease e uma série de precauções devem ser tomadas para evitar a degradação da amostra. Após este procedimento, outros métodos, como RMN em estado sólido, podem ser aplicados para investigar os agregados semelhantes a amilóide que geralmente são formados por proteínas desordenadas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores da área de biologia química explorassem compostos ativos com potencial serapático em sistemas modelo in vitro.