Teste da capacidade Vascular invasiva das células cancerosas no peixe-zebra (

O objetivo geral deste procedimento é avaliar o comportamento maligno e invasivo das células cancerígenas em um modelo de embrião de peixe-zebra. Este método ajuda os pesquisadores a determinar se as células cancerígenas podem invadir um sistema circulatório funcional, modelando assim uma etapa fundamental na cascata metastática. A principal vantagem dessa técnica é que o modelo de embrião de peixe-zebra fornece essa avaliação e um tempo de resposta mais curto do que experimentos semelhantes frequentemente conduzidos em camundongos.

Demonstrando o procedimento estará o Dr. Eric Glasgow, que administra a instalação central do peixe-zebra na Universidade de Georgetown. Depois de preparar células cancerígenas, reagentes e embriões de peixe-zebra de acordo com o protocolo de texto, conecte o sistema de distribuição de microinjeção a uma fonte de ar pressurizada e ligue a fonte de alimentação. Teste a pressão pressionando o pedal.

Um breve pulso de ar deve ser emitido do porta-agulha. Adicione 20 mililitros de solução de tricaína 2X a uma placa de injeção e coloque a placa em um shaker para equilibrá-la. Em seguida, repita o equilíbrio com uma segunda alíquota de 2X Tricaine.

Em seguida, use uma pipeta de plástico para transferir um grupo de embriões para um pequeno prato, contendo 2X Solução de Tricaína. Usando uma ponta de carregamento de gel, preencha a agulha de microinjeção com células cancerígenas. Coloque a agulha em um frasco de armazenamento de eletrodos com a extremidade pontiaguda voltada para baixo para que as células se acomodem perto da ponta.

Transfira de 20 a 30 embriões anestesiados para uma placa de injeção, coletando embriões com bastante 2X Tricaine em uma pipeta de plástico. Deixe os embriões assentarem na ponta da pipeta e, em seguida, expulse suavemente os embriões para a calha da placa de injeção, espalhando os embriões ao longo do comprimento da calha. Alinhe os embriões com as cabeças voltadas para cima e as barrigas voltadas para a parede íngreme do cocho.

Encaixe a agulha no porta-agulha do micro manipulador. Em seguida, posicione a placa de injeção sob o estereoscópio com a parede de 60 graus à esquerda e concentre-se no embrião superior com ampliação de 25X. Posicione o micro manipulador de forma que, quando estendida, a agulha perfure o embrião.

Em seguida, estenda a agulha a olho nu até que ela esteja quase tocando o embrião. Agora, enquanto olha ao microscópio, alinhe a agulha contra o embrião. Para injetar as células, perfure o embrião através do saco vitelino.

Pressione o pedal, colocando a ponta apenas no seio pré-cardíaco, mas não nele. A força da injeção expelirá as células para o seio cardíaco. Alternativamente, a injeção de células no saco vitelino permite o estudo de diferentes facetas da invasão vascular, conforme descrito no manuscrito.

Com a mão direita, estenda e retraia a agulha de injeção. Com a mão esquerda, faça ajustes finos para posicionar o próximo embrião. Quando toda a placa for injetada, retorne a agulha ao frasco de armazenamento de eletrodos.

Para transferir os embriões para o prato de recuperação, incline a placa de injeção para puxar os embriões na parte inferior, lavando os embriões para fora do cocho e usando a pipeta de plástico para coletá-los. Deixe os embriões assentarem no fundo da pipeta e, em seguida, transfira os embriões para o prato de recuperação em uma quantidade mínima de Tricaína. Incube o prato de recuperação a 28 graus Celsius por uma hora, antes de separar os embriões viáveis dos embriões mortos e detritos.

Incube o prato a 33 graus Celsius até que esteja pronto para pontuar. Após anestesiar um lote de embriões a serem pontuados, de acordo com o protocolo de texto, colocar uma larva anestesiada em uma lâmina de microscópio de depressão em uma gota de Tricaína. Oriente as larvas lateralmente para obter imagens ideais da região caudal.

Coloque a lâmina em um microscópio de fluorescência composto com uma lente objetiva de 10X. Marque as larvas contando o número de células cancerígenas que invadiram com sucesso a vasculatura, concentrando-se para cima e para baixo na região da cauda para discernir claramente as células intactas. Derreta a solução de tricaína de agarose 1,5% e leve a 37 graus Celsius.

Depois de anestesiar os embriões como antes, transfira um embrião em uma gota de solução de tricaína para a superfície de imagem. Use uma pipeta de vidro para remover o excesso de solução de tricaína que retém o embrião na superfície de imagem. Em seguida, sobreponha uma gota de solução de agarose derretida sobre o embrião.

Trabalhando rapidamente, antes que a agarose polimerize, use uma ferramenta delicada como uma escova de cílios para orientar o embrião lateralmente para a imagem, tomando cuidado extra para garantir que o embrião seja achatado ao longo da superfície de imagem. Quando a gota de agarose estiver polimerizada, mergulhe-a em solução de tricaína. Finalmente, submeta o embrião vivo de peixe-zebra a imagens microscópicas.

Das sete linhagens celulares de câncer de mama testadas quanto à sua capacidade vascular invasiva em embriões de peixe-zebra, a linhagem MDA-MB-231 exibiu o maior número de células cancerígenas extravasadas por embrião quando avaliadas, 96 horas após a injeção. Também foi observado que as células BT-474 invadiram prontamente a região caudal dos embriões, enquanto outras linhagens celulares, como as células MCF-7, SK-BR-3 e T-47D, foram minimamente invasivas. Em um ensaio modificado que utiliza um local de injeção diferente, foi realizado um experimento de competição onde duas populações de células MDA-MB-231, que diferem em sua capacidade vascular invasiva, foram injetadas simultaneamente no saco vitelino de embriões em desenvolvimento.

Após a pontuação, foi determinado que as células MDA-MB-231 propagadas em condições de cultura confluente antes da injeção, exibiram uma redução no intravasamento na circulação e, portanto, tiveram uma presença reduzida na região caudal dos embriões. Uma vez dominadas, as injeções de embriões de peixe-zebra podem ser feitas em quatro horas, se realizadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de empregar critérios rigorosos e consistentes ao pontuar o extravasamento de células cancerígenas.

Seguindo este procedimento, os resultados podem ser validados em um modelo murino. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar as injeções e pontuar o extravasamento, permitindo testar a capacidade vascular invasiva das células cancerígenas em embriões de peixe-zebra.