Duas técnicas para criar Mice Hypoparathyroid: Paratireoidectomia Usando GFP Glândulas e Difteria-Toxin-Mediated paratireóide Ablação

O objetivo geral deste procedimento é gerar dois modelos de camundongos com hipoparatireoidismo adquirido que sejam fáceis de usar, produzam um fenótipo estável e deixem a função tireoidiana intacta. A principal vantagem desses dois modelos é que eles permitem a remoção precisa das glândulas paratireoides em camundongos, seja por cirurgia guiada por fluorescência, seja pela expressão específica do PTH do receptor da toxina diftérica, permitindo que as células sejam direcionadas e destruídas seletivamente sem interferir na glândula tireoide vizinha. Esperamos que nossos modelos de camundongos sejam capazes de responder a perguntas-chave no campo do hipoparatireoidismo.

Por exemplo, as terapias análogas do PTH podem ajudar a manter os níveis normais de cálcio sérico sem aumentar a excreção urinária de cálcio? Esses modelos também podem ser usados para estudar outras questões clínicas no hipoparatireoidismo. Por exemplo, a força óssea é afetada pelo hipoparatireoidismo e isso muda com o tratamento?

Perguntas como essas são difíceis de responder em pacientes, mas esses modelos de camundongos podem ser usados para resolvê-las. Comece anestesiando camundongos de oito a 10 semanas de idade, expressando GFP especificamente em paratireoides de acordo com um protocolo aprovado. Coloque o animal em decúbito dorsal e garanta uma profundidade adequada de anestesia pela ausência de um reflexo de retirada de pinça do dedo do pé ou outros meios.

Estenda a região ventral do pescoço e prepare-se para a cirurgia raspando o pelo. Desinfete a pele raspada com uma almofada anti-séptica de iodopovidona e, em seguida, prepare o local da incisão usando uma esfoliação cirúrgica e enxágue com álcool de acordo com o protocolo aprovado. Em seguida, cubra o animal com campos cirúrgicos estéreis para reduzir a contaminação do local da cirurgia.

Depois de cortar uma incisão longitudinal de 2 centímetros com um bisturi cirúrgico, use uma pinça curva e serrilhada para dissecar a fáscia e empurre as glândulas salivares para o lado. Em seguida, ao visualizar o local da cirurgia através de um microscópio de dissecação, use as pontas de uma pinça afiada para cortar e separar os músculos paratraqueais e expor a traqueia. Identifique os lobos direito e esquerdo da glândula tireoide localizados próximos à traqueia.

Em seguida, mude a fonte de luz para luz fluorescente e visualize as duas glândulas paratireoides fluorescentes verdes. Os roedores normalmente têm apenas duas glândulas paratireoides. Se você não conseguir identificar as duas glândulas paratireoides próximas à tireoide de cada lado, deve-se suspeitar de glândulas paratireoides localizadas ectopicamente e uma busca cuidadosa delas ao longo da traqueia deve ser realizada.

Em seguida, use pinças cirúrgicas e tesouras para remover cuidadosamente as glândulas paratireoides verdes e verifique cuidadosamente ao longo da traqueia para garantir que todo o tecido verde tenha sido removido. Use gaze estéril para hemostasia. Feche os músculos paratraqueais com suturas interrompidas.

Feche a incisão da pele com suturas Halstead. Coloque o animal pós-cirúrgico em uma gaiola separada em uma almofada de aquecimento para recuperação da temperatura corporal. Quando o rato estiver acordado, coloque ração de pellets e água com um pouco de gelatina no chão da gaiola.

Após um período de observação pós-cirúrgica de duas horas, retorne o camundongo ao biotério. Três dias após a paratireoidectomia, analise 10 microlitros de sangue da cauda para cálcio ionizado usando um analisador como o sistema de gases sanguíneos, analisador de cálcio e pH. Se a paratireoidectomia for bem-sucedida, o cálcio ionizado no sangue será igual ou inferior a menos dois desvios padrão dos camundongos de controle operados de forma simulada.

Comece preparando a solução de toxina diftérica diluindo o pó de toxina diftérica com solução salina estéril a uma concentração de 0,5 microgramas por mililitro. Filtrar a solução estéril e aloquot. Injete cinco microgramas por quilograma de toxina diftérica de peso corporal em camundongos de oito a 10 semanas de idade, expressando os receptores da toxina diftérica especificamente nas paratireoides.

Três dias após uma segunda injeção de toxina diftérica, analise 10 microlitros de sangue da cauda para cálcio ionizado, como antes. A seguir estão imagens representativas das várias localizações das glândulas paratireoides em camundongos que expressam GFP especificamente na paratireoide. Os camundongos tinham duas ou três glândulas paratireoides verdes.

A maioria das glândulas paratireoides estava localizada perto da borda superior ou perto da borda inferior da glândula tireoide. Em casos raros, algumas glândulas paratireoides estavam localizadas ectopicamente. Uma das vantagens do nosso modelo de camundongo é que a glândula tireoide permanece intacta.

Esta figura mostra os níveis de TSH de camundongos GFP-PTX três meses após a paratireoidectomia. Esta figura mostra as medidas de T4. Os camundongos GFP-PTX apresentam concentrações de TSH e concentrações de T4 que não foram diferentes dos camundongos controle.

Esta imagem mostra os níveis de cálcio no sangue e os níveis de PTH em camundongos GFP-PTX. Esta imagem mostra os níveis de cálcio no sangue e os níveis de PTH em camundongos PTHcre-iDTR injetados com toxina diftérica. Tanto os camundongos GFP-PTX quanto os camundongos PTHcre-iDTR injetados com DT exibiram hipocalcemia estável e níveis reduzidos de PTH durante um período de observação de três meses.

Uma vez dominada, a paratireoidectomia guiada por GFP pode ser feita em cerca de 20 minutos durante todo o procedimento. Uma única injeção de toxina diftérica não leva mais de um minuto se for realizada corretamente. Após esse procedimento, esses camundongos desenvolvem hipoparatireoidismo e podem ser usados como modelo pré-clínico da doença.

Questões podem ser abordadas, como a eficácia de diferentes análogos do hormônio PTH no tratamento do hipoparatireoidismo. Não se esqueça de que a toxina diftérica é perigosa e que os trabalhadores devem ter as imunizações usuais contra a toxina diftérica. Equipamentos de proteção individual, como máscaras e luvas, devem sempre ser usados durante a realização desses procedimentos.