Duas técnicas para criar Mice Hypoparathyroid: Paratireoidectomia Usando GFP Glândulas e Difteria-Toxin-Mediated paratireóide Ablação
14 de março de 2017
Camundongos com hipoparatireoidismo adquirido seriam úteis para estudar novas terapias medicamentosas para o hipoparatireoidismo. Dois procedimentos para criar esses camundongos são demonstrados. O camundongo GFP-PTX é gerado por paratireoidectomia cirúrgica guiada por glândulas paratireoides fluorescentes verdes. Uma segunda abordagem, não cirúrgica, baseia-se na expressão específica da paratireoide do receptor da toxina diftérica.
O objetivo geral deste procedimento é gerar dois modelos de camundongos com hipoparatireoidismo adquirido que sejam fáceis de usar, produzam um fenótipo estável e deixem a função tireoidiana intacta. A principal vantagem desses dois modelos é que eles permitem a remoção precisa das glândulas paratireoides em camundongos, seja por cirurgia guiada por fluorescência, seja pela expressão específica do PTH do receptor da toxina diftérica, permitindo que as células sejam direcionadas e destruídas seletivamente sem interferir na glândula tireoide vizinha. Esperamos que nossos modelos de camundongos sejam capazes de responder a perguntas-chave no campo do hipoparatireoidismo.
Por exemplo, as terapias análogas do PTH podem ajudar a manter os níveis normais de cálcio sérico sem aumentar a excreção urinária de cálcio? Esses modelos também podem ser usados para estudar outras questões clínicas no hipoparatireoidismo. Por exemplo, a força óssea é afetada pelo hipoparatireoidismo e isso muda com o tratamento?
Perguntas como essas são difíceis de responder em pacientes, mas esses modelos de camundongos podem ser usados para resolvê-las. Comece anestesiando camundongos de oito a 10 semanas de idade, expressando GFP especificamente em paratireoides de acordo com um protocolo aprovado. Coloque o animal em decúbito dorsal e garanta uma profundidade adequada de anestesia pela ausência de um reflexo de retirada de pinça do dedo do pé ou outros meios.
Estenda a região ventral do pescoço e prepare-se para a cirurgia raspando o pelo. Desinfete a pele raspada com uma almofada anti-séptica de iodopovidona e, em seguida, prepare o local da incisão usando uma esfoliação cirúrgica e enxágue com álcool de acordo com o protocolo aprovado. Em seguida, cubra o animal com campos cirúrgicos estéreis para reduzir a contaminação do local da cirurgia.
Depois de cortar uma incisão longitudinal de 2 centímetros com um bisturi cirúrgico, use uma pinça curva e serrilhada para dissecar a fáscia e empurre as glândulas salivares para o lado. Em seguida, ao visualizar o local da cirurgia através de um microscópio de dissecação, use as pontas de uma pinça afiada para cortar e separar os músculos paratraqueais e expor a traqueia. Identifique os lobos direito e esquerdo da glândula tireoide localizados próximos à traqueia.
Em seguida, mude a fonte de luz para luz fluorescente e visualize as duas glândulas paratireoides fluorescentes verdes. Os roedores normalmente têm apenas duas glândulas paratireoides. Se você não conseguir identificar as duas glândulas paratireoides próximas à tireoide de cada lado, deve-se suspeitar de glândulas paratireoides localizadas ectopicamente e uma busca cuidadosa delas ao longo da traqueia deve ser realizada.
Em seguida, use pinças cirúrgicas e tesouras para remover cuidadosamente as glândulas paratireoides verdes e verifique cuidadosamente ao longo da traqueia para garantir que todo o tecido verde tenha sido removido. Use gaze estéril para hemostasia. Feche os músculos paratraqueais com suturas interrompidas.
Feche a incisão da pele com suturas Halstead. Coloque o animal pós-cirúrgico em uma gaiola separada em uma almofada de aquecimento para recuperação da temperatura corporal. Quando o rato estiver acordado, coloque ração de pellets e água com um pouco de gelatina no chão da gaiola.
Após um período de observação pós-cirúrgica de duas horas, retorne o camundongo ao biotério. Três dias após a paratireoidectomia, analise 10 microlitros de sangue da cauda para cálcio ionizado usando um analisador como o sistema de gases sanguíneos, analisador de cálcio e pH. Se a paratireoidectomia for bem-sucedida, o cálcio ionizado no sangue será igual ou inferior a menos dois desvios padrão dos camundongos de controle operados de forma simulada.
Comece preparando a solução de toxina diftérica diluindo o pó de toxina diftérica com solução salina estéril a uma concentração de 0,5 microgramas por mililitro. Filtrar a solução estéril e aloquot. Injete cinco microgramas por quilograma de toxina diftérica de peso corporal em camundongos de oito a 10 semanas de idade, expressando os receptores da toxina diftérica especificamente nas paratireoides.
Três dias após uma segunda injeção de toxina diftérica, analise 10 microlitros de sangue da cauda para cálcio ionizado, como antes. A seguir estão imagens representativas das várias localizações das glândulas paratireoides em camundongos que expressam GFP especificamente na paratireoide. Os camundongos tinham duas ou três glândulas paratireoides verdes.
A maioria das glândulas paratireoides estava localizada perto da borda superior ou perto da borda inferior da glândula tireoide. Em casos raros, algumas glândulas paratireoides estavam localizadas ectopicamente. Uma das vantagens do nosso modelo de camundongo é que a glândula tireoide permanece intacta.
Esta figura mostra os níveis de TSH de camundongos GFP-PTX três meses após a paratireoidectomia. Esta figura mostra as medidas de T4. Os camundongos GFP-PTX apresentam concentrações de TSH e concentrações de T4 que não foram diferentes dos camundongos controle.
Esta imagem mostra os níveis de cálcio no sangue e os níveis de PTH em camundongos GFP-PTX. Esta imagem mostra os níveis de cálcio no sangue e os níveis de PTH em camundongos PTHcre-iDTR injetados com toxina diftérica. Tanto os camundongos GFP-PTX quanto os camundongos PTHcre-iDTR injetados com DT exibiram hipocalcemia estável e níveis reduzidos de PTH durante um período de observação de três meses.
Uma vez dominada, a paratireoidectomia guiada por GFP pode ser feita em cerca de 20 minutos durante todo o procedimento. Uma única injeção de toxina diftérica não leva mais de um minuto se for realizada corretamente. Após esse procedimento, esses camundongos desenvolvem hipoparatireoidismo e podem ser usados como modelo pré-clínico da doença.
Questões podem ser abordadas, como a eficácia de diferentes análogos do hormônio PTH no tratamento do hipoparatireoidismo. Não se esqueça de que a toxina diftérica é perigosa e que os trabalhadores devem ter as imunizações usuais contra a toxina diftérica. Equipamentos de proteção individual, como máscaras e luvas, devem sempre ser usados durante a realização desses procedimentos.
Visão Geral
Este estudo demonstra dois procedimentos para gerar modelos de camundongos de hipoparatireoidismo adquirido, essenciais para investigar terapias medicamentosas inovadoras. Os modelos permitem a remoção precisa das glândulas paratireoides mantendo a função tireoidiana, facilitando pesquisas sobre a condição.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Endocrinologia
- Modelos Animais
Antecedentes
- O hipoparatireoidismo adquirido é uma condição difícil de estudar em seres humanos.
- Modelos de camundongos oferecem um ambiente controlado para a pesquisa.
- Os métodos existentes podem não preservar eficazmente a função tireoidiana durante a remoção das paratireoides.
- Compreender o hipoparatireoidismo pode levar a opções de tratamento melhores.
Objetivo do Estudo
- Criar modelos de camundongos que imitam o hipoparatireoidismo adquirido.
- Investigar os efeitos de terapias com análogos de PTH sobre os níveis séricos de cálcio.
- Explorar o impacto do hipoparatireoidismo na resistência óssea.
Métodos Utilizados
- Paratireoidectomia cirúrgica guiada por fluorescência para identificar as glândulas paratireoides.
- Injeção de toxina diftérica para direcionar-se seletivamente às células paratireoides.
- Monitoramento dos níveis séricos de cálcio e PTH após a cirurgia.
- Uso de técnicas de imagem para visualizar a localização das glândulas paratireoides.
Resultados Principais
- Criação bem-sucedida de modelos estáveis de camundongos com hipoparatireoidismo.
- Preservação da função tireoidiana durante a remoção das paratireoides.
- Hipocalcemia demonstrada e níveis reduzidos de PTH nos modelos.
- Os modelos podem ser utilizados para avaliar a eficácia de análogos do hormônio PTH.
Conclusões
- Os modelos de camundongos desenvolvidos são valiosos para o estudo do hipoparatireoidismo.
- Eles permitem pesquisas sobre tratamentos potenciais sem afetar a função tireoidiana.
- Estudos futuros podem aproveitar esses modelos para responder perguntas clínicas essenciais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Modelos pré-clínicos confiáveis de hipoparatireoidismo adquirido são essenciais para avaliar terapias com análogos do PTH e compreender a homeostase do cálcio sem interferência de disfunção tireoidiana. Esses modelos duplos permitem a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas, fornecendo fenótipos estáveis e reprodutíveis que preservam a função tireoidiana, apoiando decisões informadas de avanço ou interrupção no estágio inicial de descoberta. A capacidade de modelar a fisiopatologia da doença humana em camundongos aumenta a continuidade translacional e a relevância da carteira para terapêuticas endócrinas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias dependentes de PTH e a verificação de hipóteses terapêuticas em um sistema geneticamente manipulável.
- Valor Operacional: Fornece um fenótipo hipocalcêmico estável para leituras farmacológicas consistentes entre diferentes grupos de estudo.
- Valor Preditivo: Possibilita a avaliação do engajamento do alvo e da fidelidade da sinalização downstream para moduladores do receptor de PTH.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera sistemas biológicos validados com pontos finais quantificáveis de cálcio sérico e PTH para padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Oferece ablação reprodutível, guiada por fluorescência ou induzida por toxina, pronta para triagem em alta escala de compostos.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em múltiplas modalidades terapêuticas direcionadas à regulação do cálcio.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Os modelos refletem a fisiopatologia do hipoparatireoidismo humano, permitindo testes em sistemas relevantes à doença.
- Valor Operacional: Facilita o monitoramento longitudinal de indicadores de remodelação óssea e regulação do cálcio.
- Confiabilidade Preditiva: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco com base na estabilidade fenotípica sustentada ao longo de três meses.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Os modelos integram-se ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e os testes de eficácia pré-clínica, fornecendo um sistema relevante para a avaliação de fármacos endócrinos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a eficácia de análogos de PTH sobre o cálcio sérico sem interferência da tireoide.
- Triagem: Permite a preparação do ensaio por meio de fenótipos hipocalcêmicos estáveis e quantificáveis, adequados para avaliação de bibliotecas de compostos.
- Análises: Fornece leituras de cálcio ionizado e níveis de PTH que ajudam as equipes a comparar os efeitos do tratamento e a modulação do alvo.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio da manutenção de fenótipos estáveis e da capacidade de avaliação da resistência óssea.
- Reutilização Corporativa: Representa uma capacidade reutilizável para múltiplos projetos que investigam agonistas do receptor sensível ao cálcio, análogos de PTH ou agentes anabólicos ósseos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da redução de riscos mecanicistas em intervenções na via do PTH.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio de cirurgia guiada por fluorescência ou ablação com toxina induzível.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre avançar ou não avançar, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados em programas de homeostase do cálcio.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco com base na fidelidade fenotípica transponível e no design que poupa a tireoide.
Considerações de Implementação
- Expertise necessária em cirurgia de camundongo, microscopia de fluorescência e manipulação de toxinas.
- Os equipamentos necessários incluem microscópios estereoscópicos com capacidade de fluorescência e analisadores de cálcio.
- A padronização entre equipes exige protocolos consistentes de anestesia, monitoramento pós-operatório e medição de cálcio ionizado.
- As considerações para adaptação incluem a variabilidade da glândula ectópica e as doses de toxina específicas para cada espécie.
- As limitações práticas incluem os requisitos de biossegurança para a toxina da difteria e a dependência da habilidade cirúrgica para a ablação guiada por GFP.
