Name: Duas técnicas para criar Mice Hypoparathyroid: Paratireoidectomia Usando GFP Glândulas e Difteria-Toxin-Mediated paratireóide Ablação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprenda duas técnicas para criar modelos de hipoparatireoidismo adquirido em camundongos usando cirurgia guiada por fluorescência e toxina diftérica. Esses métodos preservam a função tireoidiana e permitem estudar terapias com análogos de PTH.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01-DK100584 e China State chave do Laboratório de Doenças Orais Abrir SKLOD2015OF01 Financiamento (RB). Agradecemos Wenping Zhao, Tadatoshi Sato, e Kelly Lauter para obter ajuda.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) do Hospital Geral de Massachusetts. Obter a aprovação institucional adequado para este estudo em animais antes de começar. Algumas técnicas podem ter de ser ajustada de acordo com as exigências locais IACUC. 1. Os murganhos GFP-PTX <ol><li> Obter ratos PTHcre + e ratos Rosa-mTmG em 8 - 10 semanas de idade para mais de acasalamento. </li><li> Backcross os ratos PTHcre + (mistos 129; FVB fundo) com camundongos C57BL / 6 para 6 gerações para obter camundongos com C57BL / 6 background. </li><li> Camundongos inbreed PTHcre + obter PTHcre + / + ratos 17. NOTA: Para efectuar genotipagem, extrair o ADN a partir da ponta da cauda e usá-lo para a PCR. Os iniciadores de PCR para verificar quanto a heterozigocidade e homozigotia do transgene PTHcre são as seguintes: iniciador A frente, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, inverter o iniciador A &#39;, TCAGATCACACCACACAGCA, forward iniciador B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, o iniciador inverso B &#39;, GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17. </li><li> Cruz PTHcre + / + camundongos 16 com Rosa-mTmG ratos 18. Desmamar PTHcre; filhotes mTmG quando 4 semanas de idade. </li><li> Anestesiar 8 - 10 semanas de idade PTHcre; mTmG ratinhos por injecção ip de tribromoetanol (Avertin) a 0,6 mg / g de peso corporal, ou outros agentes, tais como a cetamina / xilazina. Use buprenorfina 0,1 mg / kg sc a cada 12 h, como um analgésico durante 48 horas após a cirurgia, de acordo com um protocolo aprovado. Assegurar profundidade adequada da anestesia pelo reflexo do dedo retirada aperto ou outros meios. Colocar o animal em decúbito dorsal. </li><li> Estender e preparar a região do pescoço ventral raspando a pele usando lâminas de aresta única. Desinfectar a pele raspada com uma almofada anti-séptica povidona iodo. </li><li> Cobrir o animal com campos cirúrgicos estéreis para reduzir a contaminação do sítio cirúrgico e usar microfone autoclavadoinstrumentos rosurgical para o procedimento cirúrgico. </li><li> Cortar uma incisão longitudinal de 2 cm de pele com um bisturi cirúrgico. Dissecar fascia e empurre as glândulas salivares para o lado por dissecção romba com uma pinça serrilhada curvas. </li><li> Sob o microscópio de dissecção utilizando luz halógena e um 4 - ampliação de 5X, cortar e separar os músculos paratraqueais usando uma pinça afiada dicas e expor a traqueia. </li><li> Identificar a glândula tireóide, com o lóbulo direito e esquerdo localizado ao lado da traquéia. </li><li> Mudar a fonte de luz para luz fluorescente e visualizar as duas glândulas paratireóides verde-fluorescente. NOTA: Tipicamente, as duas glândulas paratiróides estão localizados em ou perto da superfície das glândulas da tiróide, mas, ocasionalmente, que estão localizados mais longe. </li><li> Remova cuidadosamente as glândulas paratireóides verdes usando pinça cirúrgica e tesoura. Use gaze estéril para hemostasia e verifique cuidadosamente ao longo da traquéia para garantir que todo o tecido verde foi removido. </li&gt; <li> Feche os músculos paratraqueais por sutura interrompida usando 6-0 poliglactina 910 suturas. Feche a incisão na pele por Halsted sutura usando 6-0 poliglactina 910 suturas. </li><li> Opcional: Injectar 10 mL / g de peso corporal solução normal, estéril de cloreto de sódio a 0,9% para os ratos para a reposição de líquidos. </li><li> Colocar os animais pós-cirúrgicas para uma gaiola separada em uma incubadora quente (37 ° C) para a recuperação da temperatura corporal. Uma vez que os ratos estão despertos e na posição de decúbito, colocar comida pellet e água com um pouco de comida de gelatina no chão da gaiola. </li><li> Depois de um período de observação pós-cirúrgica de 2 h, o retorno do mouse para o biotério e siga os requisitos locais para o cuidado pós-cirúrgico. </li><li> 3 dias após a paratireoidectomia, obter 10 mL de sangue da cauda e medir sangue ionizado Ca ++ utilizando um analisador, como o sistema de gás de sangue Ca ++ / analisador de pH. Paratireoidectomia bem sucedidos resultados no sangue ionizado Ca ++ igual ou inferior a -2SD de con operação simuladaratinhos trolo (1,20 mmol / L nas nossas experiências de n = 30). </li></ol> 2. PTH Cre-IDTR Ratos <ol><li> Obter PTHcre + e DTR fl / fl ratos em 8 - 10 semanas de idade para o acasalamento. </li><li> Backcross os ratos PTHcre (mistos 129; FVB fundo) com camundongos C57BL / 6 para 6 gerações para obter camundongos com C57BL / 6 background. </li><li> Inbreed o PTHcre + (C57BL / 6, fundo) para obter ratinhos PTHcre + / + 17 ratinhos. NOTA: Para efectuar genotipagem, de ADN de ratinhos pontas da cauda foi extraído e usado para PCR. Primers de genotipagem: iniciador directo A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, o iniciador inverso A &#39;, TCAGATCACACCACACAGCA, frente iniciador B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, o iniciador inverso B&#39;, GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17. </li><li> Companheiro PTHcre + / + camundongos 16 com DTR fl / fl ratos 19 para obter camundongos PTHcre-IDTR. </li><li> Preparar a solução DT diluindo diphtherium pó toxina com solução salina estéril para uma concentração de 0,5 ug / mL. alíquotas de filtro estéril e armazenar a -80 ° C. </li><li> Escolha 8 - ratos 10 semanas de idade PTHcre-IDTR para experimento de injeção. Descongelar DT aliquota à temperatura ambiente, DT administrar por via intraperitoneal no peso corporal do animal 5 ug / kg (10 mL / g). Para a eficiência máxima e menos toxicidade, a administração DT é repetido para um total de 2 injecções com um intervalo de 3 dias 17. </li><li> 3 dias após a segunda injecção, levar de 10 mL de sangue da cauda de cada PTHcre-IDTR / PTHcre-IDTR-mTmG rato e medir Ca ++ sangue usando um sistema de gás de sangue Ca ++ / analisador de pH. NOTA: Definimos ratinhos com ionizado no sangue de Ca ++ menor do que 1,18 mmol / L como ratinhos hypoparathyroid, que é igual a 2 DP abaixo da média de ratos de controlo injectados com o veículo (n = 22). </li></ol>

<ol><li>Brandi, M. L., Brown, E. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrandi%2C+ML+%22Hypoparathyroidism%22">Hypoparathyroidism</a>. , Springer. (2015).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nós demonstramos a técnica de paratireoidectomia guiada-GFP utilizando camundongos transgênicos com expressão GFP seletivamente nas glândulas paratireóides. Nos PTHcre; ratos mTmG, a fluorescência de casal (a GFP verde em células Cre-expressas e tomate vermelho na não-Cre células expressaram) nos permitiu identificar claramente, e para remover precisamente todas as glândulas paratireóides sem remover os tireóide. Enquanto nós preferimos o uso dos ratinhos mTmG dupla fluorescência para identificar a capacidade de um tecido não-paratiróide vermelho fluorescente, o nosso procedimento também deve funcionar bem com animais individuais fluorescentes tais como vermelho do tomate (B6.Cg-Ct (Rosa) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) Hze / J) mouse. O procedimento é relativamente fácil de realizar, requer cerca de 20 minutos por rato, e resulta num fenótipo hypoparathyroid grave e prolongada. Além disso, outra vantagem das glândulas paratiróides GFP-positiva é a facilidade de detecção das glândulas paratiróides aberrantes. Os nossos estudos demonstrammislocalization das paratiróides em cerca de um quarto de ratinhos B6 (Figura 1), que são facilmente detectadas no nosso modelo de ratinho pela fluorescência verde. Contrariamente ao tíreo-paratiroidectomia, a nossa técnica evita a remoção da tiróide com consequente necessidade de substituição da hormona da tiróide e o efeito desconhecido de remoção de células C da tiróide produtoras de calcitonina. glândulas paratiróides marcado por fluorescência pode também ser utilizado para outras investigações que requerem o isolamento das glândulas paratiróides. A limitação deste modelo inclui a exigência para a cirurgia. habilidades de microcirurgia básicas e um microscópio de dissecação com uma fonte de luz fluorescente são obrigatórios. Uma segunda técnica para gerar ratinhos hypoparathyroid que elimina a necessidade de cirurgia é demonstrada. Difteria toxina-ratinhos tratados PTHcre-IDTR exibem um fenótipo hypoparathyroidism mais suave, mas simplesmente exigir injetar DT intraperitoneal no rato. A parte crítica for gerando este modelo foi a otimização da dose e regime de dosagem. Altas doses de DT, levou a toxicidade mas doses baixas diminuiu a eficácia da abordagem. Nós determinamos que o regimento dose de 2 injeções com 5 mg / kg, administrada 3 dias de intervalo, resultou em hipocalcemia confiável e estável sem mortalidade / mínima. Em última análise, esperamos que estas duas abordagens fornecem modelos úteis de mouse para hypoparathyroidism adquirido. Usando um romance PTH de ação prolongada, que relataram o primeiro uso de ambos os modelos para determinar a eficácia de novas drogas para o hipoparatireoidismo 17.

Desde a primeira descrição sistemática das glândulas paratireóides em humanos e em várias outras espécies por Sandström em 1880 1, a compreensão do significado deste pequeno órgão endócrino para a fisiologia humana e da doença tem melhorado continuamente. glândulas paratireóides secretam hormônio da paratireóide (PTH), o principal regulador do metabolismo do cálcio. PTH também é um hormônio importante para a homeostase de fosfato e remodelação óssea, 1, 2. Remoção acidental ou danos das paratireóides durante a cirurgia no pescoço é a causa mais comum de hipotireoidismo, uma doença caracterizada por níveis baixos de cálcio no sangue, baixa de PTH e fósforo elevados 1. Para melhor estudo adquiriu hipoparatireoidismo e testar novas terapias, fiáveis ​​e facilmente são necessários modelos de ratos acessíveis. Os ratos são amplamente utilizado em pesquisa, porque uma grande variedade de ferramentas genéticas são umvailable nesta espécie que permitem estudos sobre os mecanismos sofisticados in vivo. No entanto, enquanto paratireoidectomia cirúrgica (PTX) pode ser usado em ratos 2, 3, 4, 5 e mamíferos maiores 6, 7, 8, é tecnicamente muito desafiante em ratos por causa do pequeno tamanho das glândulas e sua distribuição anatômica variável 9. Portanto, thyro-paratireoidectomia (TPTX) é normalmente realizada em ratinhos, em que a tireóide e glândulas paratireóides são removidos em conjunto 10. No entanto, os baixos níveis de hormônio da tireóide são um fator de confusão em potencial em experimentos, o que complica este modelo. Além disso, células C da glândula tiróide, que produzem calcitonina, uma hormona importante na homeostase do cálcio em roedores, também são perdidas após a remoção dos thyroids 11. Vários modelos genéticos do rato de hipoparatireoidismo existe, que incluem o mouse PTH-nula 12, o mouse GCM2 nulo 13, eo rato Nuf com uma mutação ativadora no receptor sensível ao cálcio (CaSR) 14, 15. No entanto, estes defeitos genéticos já estão presentes durante o desenvolvimento embrionário, e a função das paratiróides é, por conseguinte, já prejudicado durante a embriogénese. Isto pode afectar o desenvolvimento dos órgãos, tais como o esqueleto. Isto contrasta com pacientes com hipoparatireoidismo pós-cirúrgico que adquirem a doença mais tarde na vida. Além disso, alguns desses modelos de ratos apresentam letalidade precoce e fertilidade reduzida, o que complica ainda mais a sua utilização 12, 13, 14. Nós desenvolvemos dois novos rato modelos para hypoparathyroidism adquiridos. Usando ratos geneticamente modificados que expressam GFP especificamente nas paratiróides permite que as glândulas paratiróides para ser facilmente identificados por remoção cirúrgica sem remover a glândula tiróide. Este ratinho foi gerado através do cruzamento do rato PTH-Cre, que expressa a recombinase Cre sob o controle do promotor de 5,5 kb de PTH 16 com o rato ROSA mTmG. Os PTHcre resultantes; ratos mTmG expressar a proteína verde fluorescente especificamente em células paratireóides. O segundo modelo de ratinho usa o mesmo PTH-Cre, desta vez para remover uma cassete STOP proveniente do rato DTR indutivel, resultando na expressão do receptor da toxina da difteria especificamente nas paratiróides. administração sistêmica de DT destrói as células paratireóides, tornando os animais hypoparathyroid sem cirurgia. Os dois modelos de mouse apresentados neste estudo demonstram um fenótipo hypocalcemic estável ao longo dos peri de observação de três mesesOD. Os procedimentos são fáceis de executar, o fenótipo é reprodutível, e os ratos hypoparathyroid exibem uma alta taxa de sobrevivência 17.

<table><tbody><tr><td>Camundongos ROSAmT/mG</td><td>Camundongos PTH-Cre do Laboratório Jackson</td><td>7676</td><td></td></tr> Camundongos <tr><td>iDTRmice</td><td>do Laboratório Jackson</td><td>5989</td> Camundongos iDTRmice O Laboratório Jackson 7900 <td></td></tr><tr><td>6-0 sutura de poliglactina 910 com agulha</td><td>Ethicon, Inc</td><td>J510G</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Lâminas de barbear de borda única de segurança American Safety Razor Company <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>66-0089</td><td></td></tr><tr>Navalha de segurança de penas de<td>bisturi descartável</td><td>Co., LTD</td><td>72042-11</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de preparação de iodo-povidona</td><td>Dynarex Corporation</td><td>1108</td><td></td></tr><tr><td>Gaze de lona</td><td>Busse. Inc</td><td>BHD707</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloreto de sódio a 0,9%</td><td>HOSPIRA Worldwide, Inc</td><td>07983-09</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina de 1 mL 29 G</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>329622</td><td></td></tr><tr><td>Cortinas de incisão cirúrgica</td><td>3M</td><td>6640EZ</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de biologia Dumstar</td><td>Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td><td>RS-4984</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola micro dissecante</td><td>Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td><td>RS-5605</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de agulha</td><td>MILTEX., Inc</td><td>V98-42</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>2-Metil-2-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>Para dissolver o pó de toxina diftérica 2,2,2-Tribromethanol</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0564</td><td>Dissolva em solução de cloreto de sódio a 0,9% a 1 mg / mL como solução estoque em -80 &# 176; C</td></tr><tr><td>Multicap Coleta de Sangue Tubos capilares</td><td>Siemens Healthcare Diagnostics Ltd</td><td>855578</td><td>Para coleta de sangue em análise iCa2+ usando o analisador RapidLab 348 Ca2+/pH</td></tr><tr><td>Analisador RapidLab 348 Ca2+/pH</td><td>Siemens Healthcare</td><td></td><td>Para análise iCa2+</td></tr></tbody></table>

duas técnicas para criar mice hypoparathyroid: paratireoidectomia usando gfp glândulas e difteria-toxin-mediated paratireóide ablação

Two Techniques to Create Hypoparathyroid Mice: Parathyroidectomy Using GFP Glands and Diphtheria-Toxin-Mediated Parathyroid Ablation

O hipoparatireoidismo (HP) é um distúrbio caracterizado por baixos níveis de PTH que levam à hipocalcemia, hiperfosfatemia e baixa renovação óssea. A causa mais comum da doença é a remoção acidental das glândulas paratireoides durante a cirurgia da tireoide. Novas terapias para HP são necessárias, mas testá-las requer modelos animais confiáveis de HP adquirido. 
Aqui, demonstramos a geração de dois modelos de camundongos de HP adquirido. No modelo GFP-PTX, camundongos com proteína fluorescente verde (GFP) expressa especificamente nas paratireoides (PTHcre-mTmG) foram criados pelo cruzamento de camundongos PTHcre+ com camundongos Rosa-mTmGfl/fl. As glândulas paratireoides fluorescentes verdes são facilmente identificadas em um microscópio de dissecação por fluorescência e a paratireoidectomia é realizada em menos de 20 minutos. Após a cirurgia guiada por fluorescência, os camundongos ficam profundamente hipocalcêmicos. Ao contrário da tireoparatireoidectomia tradicional, essa abordagem cirúrgica precisa deixa as glândulas tireoides e a função tireoidiana intactas. O segundo modelo, que não requer cirurgia, é baseado em uma abordagem de toxina diftérica. Camundongos PTHcre-iDTR, que expressam o receptor da toxina diftérica (DT) especificamente nas paratireoides, foram gerados pelo cruzamento do camundongo DTR induzível com o camundongo PTHcre. As células da paratireoide são, portanto, sensíveis à toxina diftérica (DT) e podem ser destruídas seletivamente pela injeção sistêmica de camundongos com DT. O fenótipo hipocalcêmico resultante é estável.

Localização do Glândulas Paratireóides Em primeiro lugar, que registaram a distribuição das glândulas paratiróides de 54 ratinhos PTHcre-mTmG como observadas ao microscópio de dissecção fluorescente. 74% (40/54) ratinhos tinham duas glândulas paratiróides verde (Figura 1A, C, E), 26% (14/54) ratinhos tinham um terceiro glândula paratiróide adicional (Figura 1B, D, F). Não foram observadas rato com um único glândula ou mais do que três glândulas. Normalmente, as glândulas paratireóides foram localizados perto da fronteira superior da glândula tireóide (58%, 71/122; Figura 1A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3)). 27% (33/122) glândulas foram localizados perto da borda inferior da glândula tireóide (Figura 1C (1), D (3), F (1)) e 13% (16/122) foram localizados longe do tglândula hyroid (Figura 1B (3), E (1), F (2)). Os nossos resultados são consistentes com e estender descobertas anteriores de diferentes localizações das glândulas paratireóides 20. Os murganhos GFP-PTX Toda a cirurgia da anestesia para fechar a incisão na pele levou cerca de 20 min por mouse. A taxa de sobrevivência de ratos pós-cirúrgicas ao longo de um período de observação de 3 meses foi de 96,3% (53/55). 92,4% (49/53) camundongos GFP-PTX apresentaram níveis de cálcio ionizado que eram 2 DP abaixo da média dos ratos de controle operados por simulação ou inferior. O fenótipo hypoparathyroid nos murganhos GFP-PTX (hipocalcemia, baixo de PTH e fosfato no soro elevado) permaneceu estável durante todo o tempo de observação de 3 meses. Importante, a função da tiróide não foi diferente de animais operados de forma simulada os 3 meses após a cirurgia (TSH = 42 ± 24 vs 30 ± 15 mU / L, P = 0,171; T4 = 30,0 ± 0,6 vs. 3,1 ± 0,9 ug / dl, p = 0,707 (Figura 2). PTH-CRE-IDTR Ratos DT injetaram em ratos PTH-Cre-IDTR hypoparathyroidism desenvolvido (cálcio no sangue baixo ionizado, fósforo no sangue elevados, e níveis de PTH inadequadamente baixa normais). Descrevemos previamente que as células positivas alguns PTH escapar da ablação por toxina da difteria, explicando o mensurável circulante PTH e, por conseguinte, o fenótipo pouco mais suave de 17 destes ratinhos. Hipoparatireoidismo em camundongos GFP-PTX e PTH-cre-IDTR Mice Reduções significativas de Ca ++ no sangue e os níveis de PTH no soro foram observadas em GFP-PTX ratos 3 dias após a cirurgia, em comparação aos níveis observados em ratos operados por simulação (Ca ++ = 1,05 ± 0,40 vs. </em&gt; 1,30 ± 0,03 mmol / L, p &lt;0,05; PTH = 32 ± 22 vs 580 ± 137 pg / ml, p &lt;0,05). O fenótipo hypoparathyroidism era estável ao longo do período de observação de 3 meses (Figura 3A, reimpresso com permissão de (referência # 17)). Após 2 injecções de 5 ug / kg de DT e 3 intervalo de dias, a dose e regime optimizado para usar a menor quantidade de DT para dar o fenótipo hypoparathyroid máxima, o DT ratinhos injectados-IDTR Cre-PTH mostrou hipocalcemia significativa e PTH reduzida em comparação com ratos de controlo do veículo, que persistiram durante o período de observação de 90 dias (Ca ++ = 1,10 ± 0,07 mmol / L vs 1,26 ± 0,05 mmol / L, p &lt;0,05; PTH = 218 ± 156 pg / ml vs. 572 ± 164 pg / mL, p &lt;0,05) (Figura 3B, reimpresso com permissão de (referência # 17)). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig1.jpg" /> Figura 1: <strong&gt; Imagens representativas dos diferentes locais da paratireóide glândulas em 54 Mice PTHcre-mTmG sob fluorescente dissecção microscópica. Os ratinhos tinham dois (A, C, E) ou três (B, D, F), as glândulas paratiróides verdes. Glândulas paratireóides maioria estavam localizados perto da borda superior (A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3) ou perto da borda inferior da glândula tiróide (C (1), D (3), F (1)). Em casos raros, alguns foram localizados ectopicamente (B (3), E (1), F (2)). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig1large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig2.jpg" /> Figura 2: TSH e T4 Nível de Mice GFP-PTX. 3 meses depois de GFP-PTX, o soro foi obtido por TSH e T4 measurem<html> entos. GFP-PTX ratinhos apresentaram concentrações de TSH concentrações (42 ± 24 mU / L) (A) e T4 (3,0 ± 0,6 mg / dL) (B) que não eram diferentes dos ratinhos de controlo (TSH = 30 ± 15 mU / L, P = 0,171, n = 11, T4 = 3,1 ± 0,9, p = 0,707, n = 11). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig3.jpg" /> Figura 3: Blood Ca ++ e os níveis de PTH em camundongos GFP-PTX e DT injetaram em ratos-IDTR CRE-PTH. Ambos os camundongos GFP-PTX (A) e DT injetaram em ratos (B) exibiram hipocalcemia estável CRE-IDTR-PTH e reduziu os níveis de PTH acima de 3 período de observação mês (N = 6-8, *** p &lt;0,001) (re-impressa com a permissão de referência # 17).es / ftp_upload / 55010 / 55010fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Camundongos com hipoparatireoidismo adquirido seriam úteis para estudar novas terapias medicamentosas para o hipoparatireoidismo. Dois procedimentos para criar esses camundongos são demonstrados. O camundongo GFP-PTX é gerado por paratireoidectomia cirúrgica guiada por glândulas paratireoides fluorescentes verdes. Uma segunda abordagem, não cirúrgica, baseia-se na expressão específica da paratireoide do receptor da toxina diftérica.

Duas técnicas para criar Mice Hypoparathyroid: Paratireoidectomia Usando GFP Glândulas e Difteria-Toxin-Mediated paratireóide Ablação

Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar dois modelos de camundongos para hipoparatireoidismo adquirido que sejam fáceis de usar, produzam um fenótipo estável e mantenham a função tireoidiana intacta. A principal vantagem desses dois modelos é que eles permitem a remoção precisa das glândulas paratireoides em camundongos, seja por cirurgia guiada por fluorescência, seja pela expressão específica de paratormônio (PTH) do receptor da toxina da difteria, permitindo que as células sejam direcionadas e destruídas seletivamente sem interferir na glândula tireoide vizinha. Esperamos que nossos modelos de camundongos possam responder perguntas fundamentais na área do hipoparatireoidismo.Por exemplo, as terapias com análogos da PTH podem ajudar a manter níveis normais de cálcio sérico sem aumentar a excreção urinária de cálcio? Esses modelos também podem ser utilizados para estudar outras questões clínicas na hipoparatireoidismo. Por exemplo, a resistência óssea é afetada pelo hipoparatireoidismo e ela muda com o tratamento?Perguntas como essas são difíceis de responder em pacientes, mas esses modelos de camundongos podem ser usados para abordá-las. Comece anestesiando camundongos com idade entre oito e dez semanas, que expressam GFP especificamente nas paratireoides, de acordo com um protocolo aprovado. Coloque o animal em posição supina e certifique-se de que a profundidade da anestesia seja adequada pela ausência do reflexo de retirada do dedo do pé ou por outros meios.Estenda a região ventral do pescoço e prepare-se para a cirurgia raspando o pêlo. Desinfete a pele depilada com um disco antisséptico de iodopovidona e, em seguida, prepare o local da incisão utilizando uma solução cirúrgica e enxágue com álcool, conforme o seu protocolo aprovado. Em seguida, cubra o animal com campos cirúrgicos estéreis para reduzir a contaminação do local cirúrgico.Após fazer uma incisão longitudinal de 2 centímetros com um bisturi cirúrgico, use pinças curvas e serrilhadas para dissecar a fáscia e afastar as glândulas salivares para o lado. Em seguida, observando o local cirúrgico por meio de um microscópio de dissecação, use as pontas de pinças finas para cortar e separar os músculos paratraqueais e expor a traqueia. Identifique os lobos direito e esquerdo da glândula tireoide localizados ao lado da traqueia.Em seguida, troque a fonte de luz por luz fluorescente e visualize as duas glândulas paratireoides verdes fluorescentes. Os roedores normalmente possuem apenas duas glândulas paratireoides. Se não for possível identificar as duas glândulas paratireoides adjacentes à tireoide em cada lado, deve-se suspeitar da presença de glândulas paratireoides ectópicas, devendo-se realizar uma busca cuidadosa por elas ao longo da traqueia.Em seguida, utilize pinças e tesouras cirúrgicas para remover cuidadosamente as glândulas paratireoides verdes e verifique cuidadosamente ao longo da traqueia para garantir que todo o tecido verde tenha sido removido. Utilize gaze estéril para a hemostasia. Feche os músculos paratraqueais com pontos separados.Fecher a incisão cutânea com pontos de Halstead. Colocar o animal no pós-operatório em uma gaiola separada sobre uma placa aquecida para recuperação da temperatura corporal. Assim que o camundongo acordar, colocar ração em pellets, água e alimento com gelatina no piso da gaiola.Após um período de observação pós-cirúrgica de duas horas, devolva o camundongo à instalação animal. Três dias após a paratireoidectomia, analise 10 microlitros de sangue da cauda para cálcio ionizado utilizando um analisador como o sistema de gases sanguíneos, analisador de cálcio e pH. Se a paratireoidectomia for bem-sucedida, o cálcio ionizado no sangue será igual ou inferior a menos dois desvios-padrão em relação ao de camundongos controles submetidos a cirurgia simulada.Prepare inicialmente a solução de toxina da difteria diluindo o pó da toxina da difteria em solução salina estéril até uma concentração de 0,5 microgramas por mililitro. Filtre esterilmente a solução e distribua em alíquotas. Injete cinco microgramas por quilograma de peso corporal da toxina da difteria em camundongos de oito a dez semanas de idade, que expressam os receptores da toxina da difteria especificamente nas paratireoides.Três dias após uma segunda injeção de toxina da difteria, analise 10 microlitros de sangue da cauda para cálcio ionizado, como antes. A seguir estão imagens representativas das várias localizações das glândulas paratireoides em camundongos que expressam GFP especificamente na paratireoide. Os camundongos tinham duas ou três glândulas paratireoides verdes.A maioria das glândulas paratireoides estava localizada próxima à borda superior ou à borda inferior da glândula tireoide. Em casos raros, algumas glândulas paratireoides estavam localizadas ectopicamente. Uma das vantagens do nosso modelo de camundongo é que a glândula tireoide permanece intacta.Esta figura mostra os níveis de TSH em camundongos GFP-PTX três meses após a paratireoidectomia. Esta figura mostra as medidas de T4. Os camundongos GFP-PTX apresentam concentrações de TSH e concentrações de T4 que não diferiram dos camundongos controle.Esta imagem mostra os níveis sanguíneos de cálcio e os níveis de PTH em camundongos GFP-PTX. Esta imagem mostra os níveis sanguíneos de cálcio e os níveis de PTH em camundongos PTHcre-iDTR injetados com toxina diftérica. Tanto os camundongos GFP-PTX quanto os camundongos PTHcre-iDTR injetados com DT exibiram hipocalcemia estável e níveis reduzidos de PTH durante um período de observação de três meses.Uma vez dominada, a paratireoidectomia guiada por GFP pode ser realizada em cerca de 20 minutos para todo o procedimento. Uma única injeção de toxina da difteria leva não mais que um minuto, se realizada corretamente. Após este procedimento, esses camundongos desenvolvem hipoparatireoidismo e podem ser usados como modelo pré-clínico da doença.Pode-se abordar questões como a eficácia de diferentes análogos do hormônio PTH no tratamento da hipoparatireoidismo. Não se esqueça de que a toxina diftérica é perigosa e de que os trabalhadores devem estar com as imunizações usuais contra a toxina diftérica em dia. Equipamentos de proteção individual, como máscaras e luvas, devem ser sempre utilizados durante a realização desses procedimentos.

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Medicine

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