Name: Na diferenciação in vitro de células T CD4 + humano FOXP3 + Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 + usando um protocolo de TGF-β contendo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Aprenda a induzir células T reguladoras FOXP3+ a partir de células T CD4+ naíve humanas in vitro usando um protocolo com TGF-β. Este método permite a geração reprodutível e fenotipagem de iTregs para estudos de imunologia.

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Nina Nagel é grata pela assistência técnica durante a gravação do vídeo e preparação experimental. Agradecemos a Eva-Maria Weiss pela ajuda com o protocolo de coloração intracelular FOXP3 e a Elisabeth Suri-Payer e Nina Oberle por estabelecer o protocolo de isolamento nTreg. Matilda Eriksson e Peri Noori são reconhecidas pela gestão laboratorial. 
Financiamento: A.S. foi apoiado por uma bolsa Marie Curie Intra European no âmbito do 7º Programa-Quadro da Comunidade Europeia, da Fundação Dr. Åke Olsson e das fundações de pesquisa KI; A.S. e J.T. foram apoiados por uma bolsa CERIC (Centro de Excelência para Pesquisa em Inflamação e Doenças Cardiovasculares), J.T. foi apoiado por Vetenskapsrådet Medicina e Saúde (Dnr 2011-3264), Fundação Torsten Söderberg, FP7 STATegra, AFA Insurance e Conselho do Condado de Estocolmo.

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Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo descrito permite a indução de CD4 humano robusta + FOXP3 + iTregs a partir de células T CD4 + naive humanas. Ele inclui um novo protocolo que descrevemos recentemente, usando uma combinação de TGF-β, ATRA e rapamicina, para a indução de iTregs com superiores in vitro a função supressora 22. Em comparação com outros protocolos publicados, outra vantagem é a indução de diferentes populações iTreg em paralelo por diferentes protocolos, o que permite a comparação directa dos efeito...

As células T reguladoras CD25 + CD4 + FOXP3 + (Tregs) suprimir outras células do sistema imune e são mediadores críticos de tolerância periférica, prevenção da auto-imunidade e inflamação excessiva 1. A importância de Tregs é exemplificado pela doença humana síndrome immunodysregulation poliendocrinopatia enteropatia ligada ao X (IPEX), em que a perda de Tregs devido a mutações no `master&#39; Treg factor de transcrição caixa de forkhead P3 (FOXP3) leva à doença auto-imune sistémica grave, letal em idade precoce. No entanto, Tregs agir como uma espada de dois gumes no sistema imunológico como eles também podem prejudicar a imunidade anti-tumor em determinadas configurações 2. manipulação terapêutica de número e função Treg é, portanto, sujeitas a inúmeras investigações clínicas. No câncer, esgotamento de Tregs pode ser desejável e algum sucesso de abordagens clínicas incentiva novas pesquisas 3. Em doenças auto-imunes e inflamatórias, além de efeitos terapêuticos de Tregs em Sevemodelos de doenças de rato RAL, recentes primeiros ensaios em-man de transferência de Treg adotiva para evitar enxertia versus doença -host (GVHD) 4-7 e para avaliar a segurança no tratamento de diabetes tipo 1 8 mostraram resultados muito promissores. Que ocorre naturalmente Tregs (nTregs) compreendem tTregs derivado de timo e pTregs induzidas perifericamente, com funções essenciais não redundantes na manutenção da saúde 9-11. No entanto, os números nTreg são limitados, estimulando a abordagem complementar de induzir Tregs (iTregs) in vitro a partir de precursores de células T naive 12. Ainda estabilidade de iTregs, presumivelmente devido à falta de desmetilação na chamada região específica desmetilado Treg-(TSDR) no locus do gene FOXP3 13, continua a ser uma preocupação e vários estudos indicam que in vivo induzida Tregs são mais estáveis 14. Até à data, FOXP3 continua a ser a melhor proteína marker para Tregs mas não é absolutamente específico, porque as células T CD4 + CD25- humanas transientemente convencionais expressar níveis intermediários de FOXP3 após activação 15,16. Embora o progresso significativo foi feito para elucidar a regulação da expressão de FOXP3, ainda há muito a ser descoberto sobre a indução, a estabilidade ea função do FOXP3 particularmente em células humanas. Apesar das diferenças para nTregs, in vitro induzida FOXP3 + células T CD4 + pode ser usado como um sistema modelo para estudar os mecanismos moleculares da indução FOXP3 e como um ponto de partida para desenvolver protocolos no futuro, que permitem a geração de iTregs que são mais semelhantes às de vivo gerado Tregs, que pode ser aplicável para as estratégias de transferência adoptivos no futuro. Não há `protocolo standard&#39; ouro para induzir iTregs humanos, e Current Protocols foram desenvolvidos com base em condições simulando Treg indutores in vivo: interleucina 2 (IL-2) E sinalização transformando β do factor de crescimento (TGF-β) são cruciais para a indução FOXP3 in vivo 17, e o ácido trans-retinóico (ATRA) - que é produzido in vivo por células dendríticas associados ao intestino - é frequentemente usado para melhorar a indução FOXP3 in vitro 18-21. Nós desenvolvemos protocolos Treg indutores humanos adicionais utilizando butirato de 22, um ácido gordo de cadeia curta da flora intestinal derivado que foi recentemente mostrado para aumentar murino Treg indução 23,24. Nós também estabeleceu recentemente um novo protocolo para a geração de iTregs com função supressora superior em vitro, usando uma combinação de TGF-β, ATRA e rapamicina 22, sendo este último um alvo de mamífero clinicamente aprovado de rapamicina (mTOR) inibidor que é conhecido por promover manutenção FOXP3 durante humana Treg expansão 25,26. Este método descreve o reprodutível emgeração in vitro de células T CD4 + humanas FOXP3 + iTregs utilizando um conjunto de condições diferentes, e a sua fenotipagem subsequente por citometria de fluxo e a reacção inversa em cadeia da polimerase de transcrição quantitativo (qRT-PCR) para revelar os padrões específicos do protocolo de expressão de FOXP3 e outros assinatura moléculas Treg tais como CD25, CTLA-4, EOS, bem como a repressão do IFN-γ e expressão SATB1 22. As populações celulares geradas podem ser utilizadas para ensaios funcionais quanto à actividade supressora ou para estudos moleculares, quer se trate de reguladores gerais FOXP3 ou para estudar os efeitos específicos para determinados compostos, tais como o butirato ou rapamicina. Uma maior compreensão dos mecanismos moleculares de condução diferenciação Treg é altamente relevante para abordagens terapêuticas futuras em auto-imunidade ou câncer visarem especificamente moléculas envolvidas na geração e função Treg.

<table><tbody><tr><td>Ácido retinóico totalmente trans</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50MG&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anit-humano Foxp3-APC clone 236A/E7</td><td>eBioscience</td><td>17-4777-42</td><td></td></tr><tr><td>microesferas anti-CD25 humanas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-983</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD25-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD28 anticorpo, LEAF Purified&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>302914</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo CD3 humano, purificado por LEAF&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>CD45RA anti-humano, FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-247</td><td></td></tr><tr><td>clone PE CD45RO anti-humano UCHL1</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td></td></tr><tr><td>clone anti-CD4-PerCP humano SK3; mIgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>345770</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a</td><td>eBioscience</td><td>48-0086-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, violeta brilhante 421</td><td>BD Biosciences</td><td>562743 clone</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano IFN-g FITC 4S. B3; mIgG1k</td><td>eBioscience</td><td>11-7319-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solução contendo Brefeldin A: GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>kit de síntese de cDNA: SuperScript VILO(transcriptase reversa) Kit de síntese de cDNA</td><td>Invitrogen</td><td>11754-250</td><td></td></tr><tr><td>Meio de centrifugação de densidade: Ficoll-Paque</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 99,7%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS, Invitrogen</td><td></td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Corante de Viabilidade Fixável Inativado por Calor, eFluor 780&nbsp; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14 ou 65-0865-18&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de tampão de coloração Foxp3</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Cuidado: contém paraformaldeído. Também pode ser comprado em kit combinado com anticorpos; 77-5774-40 Conjunto de coloração anti-humana Foxp3 Clone APC: 236A/E7 Conjunto</td></tr><tr><td>GlutaMAX (200 mM L-alanil-L-glutamina)</td> <td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>kit de isolamento de células T CD4 virgens humanas II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sérica humana 50 g/L</td><td>Baxter</td><td>1501057</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina de Streptomyces conglobatus >98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Colunas MACS LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>mouse IgG1 K Controle de Isotipo APC Clone: P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td></td></tr><tr><td>mouse IgG1 K Controle de Isotipo FITC 50 &#956; g</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>controle de isotipo IgG2a de camundongo, violeta brilhante 421, clone MOPC-173</td><td>BD Biosciences</td><td>563464</td><td></td></tr><tr><td>plástico pipetado Pasteur, embalado individualmente</td><td>Sarstedt</td><td>86.1172.001&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA Phorbol 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585-1MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>EMD (Merck)</td> <td>553210-100UG</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humana recombinante, CF</td><td>R & D</td><td>202-IL-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>Humano Recombinante TGF-beta 1, CF</td><td>RnD</td><td>240-B-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>Kit de isolamento de RNA: RNAqueous-Micro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Médio&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>72400-054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Butirato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887-250MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Meio de cultura de células T: meio X-Vivo 15, com gentamicina+fenolvermelho</td> Ensaio de Expressão Gênica <td>TaqMan Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>, FOXP3 (Melhor Cobertura)&nbsp;</td>ID <td>do ensaio 4331182;</td> da <td>Applied Biosystems</td>: Hs01085834_m1 <td>Cuidado: contém paraformaldeído</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Melhor Cobertura)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351370; ID do ensaio: Hs04194366_g1&nbsp; &nbsp;</td><td>Cuidado: contém paraformaldeído</td></tr><tr><td>Mistura mestre de expressão gênica TaqMan 4369514</td><td></td><td></td> <td>Applied Biosystems</td></tr></tbody></table>

na diferenciação in vitro de células t cd4 + humano foxp3 + induzida t reguladoras (itregs) a partir de células naive t cd4 + usando um protocolo de tgf-β contendo

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

As células T reguladoras (Tregs) são parte integrante da tolerância periférica, suprimindo reações imunes contra autoestruturas e, assim, prevenindo doenças autoimunes. Abordagens clínicas para transferir Tregs adotivamente, ou para esgotar Tregs no câncer, estão em andamento com primeiros resultados promissores. 
Como o número de Tregs de ocorrência natural (nTregs) é muito limitado, estudar certas características de Treg usando Tregs induzidas in vitro (iTregs) pode ser vantajoso. Até o momento, o melhor, embora não absolutamente específico, marcador de proteína para delinear Tregs é o fator de transcrição FOXP3. Apesar da importância das Tregs incluírem papéis não redundantes das Tregs induzidas perifericamente, os protocolos para gerar iTregs são atualmente controversos, particularmente para células humanas. Este protocolo, portanto, descreve a diferenciação in vitro de iTregs CD4 + FOXP3 + humanos de células T virgens humanas usando uma variedade de fatores indutores de Treg (TGF-β mais IL-2 apenas, ou sua combinação com ácido retinóico, rapamicina ou butirato) em paralelo. Também descreve a fenotipagem dessas células por citometria de fluxo e qRT-PCR. 
Esses protocolos resultam na expressão reprodutível de FOXP3 e outros genes de assinatura de Treg e permitem o estudo de mecanismos regulatórios gerais de FOXP3, bem como efeitos específicos do protocolo para delinear o impacto de certos fatores. Os iTregs podem ser utilizados para estudar vários aspectos fenotípicos, bem como mecanismos moleculares de indução de Treg. Estudos moleculares detalhados são facilitados por números de células relativamente grandes que podem ser obtidos. 
Uma limitação para a aplicação de iTregs é a relativa instabilidade da expressão de FOXP3 nessas células em comparação com nTregs. As iTregs geradas por esses protocolos também podem ser usadas para ensaios funcionais, como o estudo de sua função supressora, na qual as iTregs induzidas por TGF-β mais ácido retinóico e rapamicina exibem atividade supressora superior. No entanto, a capacidade supressiva dos iTregs pode diferir dos nTregs e o uso de controles apropriados é crucial.

A Figura 1 mostra um esquema da montagem experimental. A Figura 2 mostra uma coloração controle de pureza representante para as células T CD4 + naïve magneticamente isoladas e nTregs. F igura 3A mostra a citometria de fluxo estratégia de propagação e Figura 3B mostra FOXP3 representativa e CD25 citometria de fluxo colorações no dia 6 da cultura nas ...

Este protocolo descreve a geração reprodutível e fenotipagem de células T reguladoras humanas induzida (iTregs) a partir de células naive T CD4 + in vitro. Diferentes protocolos de indução de FOXP3 permitem o estudo de fenótipos específicos iTreg obtidos com os respectivos protocolos.

Na diferenciação in vitro de células T CD4 + humano FOXP3 + Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 + usando um protocolo de TGF-β contendo

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Os objetivos gerais deste experimento são induzir células T reguladoras humanas positivas para FOXP3 a partir de células T CD4 virgens in vitro e analisar seu fenótipo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia de células T, como como ocorre a diferenciação regulatória de células T no nível molecular? A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a geração e fenotipagem reprodutíveis de células T reguladoras FOXP3 positivas para humanos.Embora esse método possa fornecer informações sobre a diferenciação de células T reguladoras, ele também pode ser modificado para estudar outros subconjuntos de células T CD4 e outras células imunes de interesse. A demonstração visual desse método é crucial porque as etapas de isolamento de bits magnéticos e PBMC são fáceis de entender quando mostradas em vez de descritas. Para isolar as células T do sangue periférico, comece adicionando 15 mililitros de gradiente de densidade de temperatura ambiente em cinco tubos de 50 mililitros por camada leucocitária e aumente o volume final da camada leucocitária para 180 mililitros com PBS à temperatura ambiente.Em seguida, incline um tubo de meio de gradiente de densidade para o lado e coloque lentamente aproximadamente 35 mililitros de sangue diluído no meio de gradiente de densidade sem misturar as soluções. Separe as células por centrifugação. Em seguida, transfira as camadas brancas de PBMC entre o gradiente de densidade e as fases de plasma de cada tubo para novos tubos cônicos de 50 mililitros.Lave o PBMC com 200 mililitros de PBS fresco e ressuspenda os pellets em meio completo para depleção dos monócitos do sangue periférico por aderência plástica. Depois de coletar as células flutuantes, lave o PBMC três vezes em até 50 mililitros de PBS fresco, ressuspendendo o pellet final em 40 microlitros de tampão de isolamento de quatro graus Celsius e 10 microlitros de coquetel de anticorpos de biotina de células T CD4-positivas virgens por um vezes 10 para as sétimas células com mistura completa. Incube as células por 10 minutos a quatro graus Celsius, depois lave as células com 40 mililitros de PBS de quatro graus Celsius e ressuspenda o pellet em 80 microlitros de tampão de isolamento e 20 microlitros de microesferas anti-biotina por uma vez 10 elevado às sétimas células para uma incubação de 15 minutos a quatro graus Celsius.Enquanto as células estão incubando, coloque uma coluna LS em um ímã e equilibre com três mililitros de tampão de isolamento, depois lave as células em 50 mililitros de PBS e ressuspenda o pellet em três mililitros de tampão de isolamento fresco. Agora adicione as células à coluna, coletando o fluxo ingênuo contendo células T CD4-positivas em um tubo de 15 mililitros. Quando a coluna parar de pingar, enxágue o tubo com dois mililitros de tampão de isolamento e transfira a lavagem para a coluna.Após a última lavagem, pulverize as células T classificadas magneticamente por centrifugação, seguidas de duas lavagens em 15 mililitros de meio, resultando em uma população de células T CD4-positivas virgens superiores a 94% puras. Para induzir células T reguladoras, adicione 50 microlitros dos estímulos apropriados aos poços correspondentes de uma placa de 96 poços revestida com anti-CD3. Em seguida, encha os poços vazios, incluindo os poços de margem, com 200 microlitros de PBS e pré-aqueça as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Ajuste a concentração das células T virgens em repouso para uma densidade de 2,2 a 2,6 vezes 10 elevado à sexta células por mililitro em meio de 37 graus Celsius e adicione 50 microlitros de células a cada poço. Quando todas as células tiverem sido semeadas, embrulhe a placa em papel alumínio para proteção contra a luz e devolva a placa à incubadora de cultura de células. Após dois a três dias, pequenos aglomerados de células em proliferação que emergem em aglomerados maiores em momentos posteriores devem se tornar visíveis por microscopia de luz.Após quatro a seis dias, o meio muda de ligeiramente laranja para amarelado, e as pelotas de células agrupadas são visíveis a olho nu. Para avaliar a expressão do marcador de superfície celular, use uma pipeta para ressuspender as células em cada poço e transfira as células para uma nova placa de fundo em U de 96 poços, deixando um poço livre ao redor de cada poço para evitar contaminação por transbordamento durante o processo de permanência. Quando todas as células tiverem sido transferidas, centrifugue a placa e descarte o sobrenadante.Deixando o prato de cabeça para baixo em um papel absorvente, bata no prato uma vez e imediatamente vire-o para cima. Vórtice para ressuspender as células no líquido restante. Em seguida, adicione 25 microlitros de pré-mistura de superfície a cada poço e incube a placa por 30 minutos a quatro graus Celsius no escuro.No final da incubação, lave os poços duas vezes em 200 microlitros de PBS, removendo o sobrenadante e ressuspendendo as células após cada lavagem, como acabamos de demonstrar. Em seguida, realize a viabilidade e a coloração intracelular para FOXP3 e outros marcadores de interesse. Nesses gráficos, é mostrada a estratégia de gating por citometria de fluxo para células T reguladoras CD25-positivas para CD4-positivas para FOXP3.Após estimulação in vitro, a maioria das células regula o CD25, cuja expressão é reduzida na presença de rapamicina. Somente sob a adição de fatores Tregs induzíveis uma população clara de células positivas para FOXP3 com níveis de expressão de proteína intracelular tão altos quanto Tregs de ocorrência natural se torna aparente. De fato, cada condição de Treg induzida demonstra um padrão específico e reprodutível de proliferação celular.Com o TGF beta induzindo um ligeiro aumento na proliferação e o ácido all-trans retinóico aumentando drasticamente a proliferação de células T, enquanto a adição de rapamicina às culturas reduz fortemente o tamanho do aglomerado de células. A análise de QRT-PCR de Tregs induzidas indica que a expressão de mRNA de FOXP3 é maior em todas as culturas de Treg induzidas em comparação com células estimuladas por controle, com Tregs induzidas tratadas com rapamicina exibindo os níveis mais baixos de mRNA de FOXP3 das culturas de Treg induzidas. Além disso, observa-se que a expressão de mRNA de FOXP3 em Tregs de ocorrência natural é maior do que a exibida por qualquer uma das populações de células T reguladoras induzíveis.Essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da imunologia de células T explorarem os mecanismos moleculares de geração e função de Treg em doadores saudáveis ou em pacientes com doença autoimune ou câncer. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células T CD4-positivas virgens humanas e como diferenciar e fenotipar as NUs resultantes em células T reguladoras. Por favor, não se esqueça de que trabalhar com sangue humano ou paraformaldeído pode ser extremamente perigoso.Portanto, precauções como pré-processamento, fazer todas as vacinas, usar roupas de proteção e usar o descarte adequado de resíduos devem ser levadas em consideração ao realizar esses procedimentos.

in-vitro-differentiation-human-cd4-foxp3-induced-regulatory-t-cells

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