Name: Na diferenciação in vitro de células T CD4 + humano FOXP3 + Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 + usando um protocolo de TGF-β contendo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Aprenda a induzir células T reguladoras FOXP3+ a partir de células T CD4+ naíve humanas in vitro usando um protocolo com TGF-β. Este método permite a geração reprodutível e fenotipagem de iTregs para estudos de imunologia.

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Nina Nagel é grata pela assistência técnica durante a gravação do vídeo e preparação experimental. Agradecemos a Eva-Maria Weiss pela ajuda com o protocolo de coloração intracelular FOXP3 e a Elisabeth Suri-Payer e Nina Oberle por estabelecer o protocolo de isolamento nTreg. Matilda Eriksson e Peri Noori são reconhecidas pela gestão laboratorial. 
Financiamento: A.S. foi apoiado por uma bolsa Marie Curie Intra European no âmbito do 7º Programa-Quadro da Comunidade Europeia, da Fundação Dr. Åke Olsson e das fundações de pesquisa KI; A.S. e J.T. foram apoiados por uma bolsa CERIC (Centro de Excelência para Pesquisa em Inflamação e Doenças Cardiovasculares), J.T. foi apoiado por Vetenskapsrådet Medicina e Saúde (Dnr 2011-3264), Fundação Torsten Söderberg, FP7 STATegra, AFA Insurance e Conselho do Condado de Estocolmo.

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Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo descrito permite a indução de CD4 humano robusta + FOXP3 + iTregs a partir de células T CD4 + naive humanas. Ele inclui um novo protocolo que descrevemos recentemente, usando uma combinação de TGF-β, ATRA e rapamicina, para a indução de iTregs com superiores in vitro a função supressora 22. Em comparação com outros protocolos publicados, outra vantagem é a indução de diferentes populações iTreg em paralelo por diferentes protocolos, o que permite a comparação directa dos efeito...

As células T reguladoras CD25 + CD4 + FOXP3 + (Tregs) suprimir outras células do sistema imune e são mediadores críticos de tolerância periférica, prevenção da auto-imunidade e inflamação excessiva 1. A importância de Tregs é exemplificado pela doença humana síndrome immunodysregulation poliendocrinopatia enteropatia ligada ao X (IPEX), em que a perda de Tregs devido a mutações no `master&#39; Treg factor de transcrição caixa de forkhead P3 (FOXP3) leva à doença auto-imune sistémica grave, letal em idade precoce. No entanto, Tregs agir como uma espada de dois gumes no sistema imunológico como eles também podem prejudicar a imunidade anti-tumor em determinadas configurações 2. manipulação terapêutica de número e função Treg é, portanto, sujeitas a inúmeras investigações clínicas. No câncer, esgotamento de Tregs pode ser desejável e algum sucesso de abordagens clínicas incentiva novas pesquisas 3. Em doenças auto-imunes e inflamatórias, além de efeitos terapêuticos de Tregs em Sevemodelos de doenças de rato RAL, recentes primeiros ensaios em-man de transferência de Treg adotiva para evitar enxertia versus doença -host (GVHD) 4-7 e para avaliar a segurança no tratamento de diabetes tipo 1 8 mostraram resultados muito promissores. Que ocorre naturalmente Tregs (nTregs) compreendem tTregs derivado de timo e pTregs induzidas perifericamente, com funções essenciais não redundantes na manutenção da saúde 9-11. No entanto, os números nTreg são limitados, estimulando a abordagem complementar de induzir Tregs (iTregs) in vitro a partir de precursores de células T naive 12. Ainda estabilidade de iTregs, presumivelmente devido à falta de desmetilação na chamada região específica desmetilado Treg-(TSDR) no locus do gene FOXP3 13, continua a ser uma preocupação e vários estudos indicam que in vivo induzida Tregs são mais estáveis 14. Até à data, FOXP3 continua a ser a melhor proteína marker para Tregs mas não é absolutamente específico, porque as células T CD4 + CD25- humanas transientemente convencionais expressar níveis intermediários de FOXP3 após activação 15,16. Embora o progresso significativo foi feito para elucidar a regulação da expressão de FOXP3, ainda há muito a ser descoberto sobre a indução, a estabilidade ea função do FOXP3 particularmente em células humanas. Apesar das diferenças para nTregs, in vitro induzida FOXP3 + células T CD4 + pode ser usado como um sistema modelo para estudar os mecanismos moleculares da indução FOXP3 e como um ponto de partida para desenvolver protocolos no futuro, que permitem a geração de iTregs que são mais semelhantes às de vivo gerado Tregs, que pode ser aplicável para as estratégias de transferência adoptivos no futuro. Não há `protocolo standard&#39; ouro para induzir iTregs humanos, e Current Protocols foram desenvolvidos com base em condições simulando Treg indutores in vivo: interleucina 2 (IL-2) E sinalização transformando β do factor de crescimento (TGF-β) são cruciais para a indução FOXP3 in vivo 17, e o ácido trans-retinóico (ATRA) - que é produzido in vivo por células dendríticas associados ao intestino - é frequentemente usado para melhorar a indução FOXP3 in vitro 18-21. Nós desenvolvemos protocolos Treg indutores humanos adicionais utilizando butirato de 22, um ácido gordo de cadeia curta da flora intestinal derivado que foi recentemente mostrado para aumentar murino Treg indução 23,24. Nós também estabeleceu recentemente um novo protocolo para a geração de iTregs com função supressora superior em vitro, usando uma combinação de TGF-β, ATRA e rapamicina 22, sendo este último um alvo de mamífero clinicamente aprovado de rapamicina (mTOR) inibidor que é conhecido por promover manutenção FOXP3 durante humana Treg expansão 25,26. Este método descreve o reprodutível emgeração in vitro de células T CD4 + humanas FOXP3 + iTregs utilizando um conjunto de condições diferentes, e a sua fenotipagem subsequente por citometria de fluxo e a reacção inversa em cadeia da polimerase de transcrição quantitativo (qRT-PCR) para revelar os padrões específicos do protocolo de expressão de FOXP3 e outros assinatura moléculas Treg tais como CD25, CTLA-4, EOS, bem como a repressão do IFN-γ e expressão SATB1 22. As populações celulares geradas podem ser utilizadas para ensaios funcionais quanto à actividade supressora ou para estudos moleculares, quer se trate de reguladores gerais FOXP3 ou para estudar os efeitos específicos para determinados compostos, tais como o butirato ou rapamicina. Uma maior compreensão dos mecanismos moleculares de condução diferenciação Treg é altamente relevante para abordagens terapêuticas futuras em auto-imunidade ou câncer visarem especificamente moléculas envolvidas na geração e função Treg.

<table><tbody><tr><td>Ácido retinóico totalmente trans</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50MG&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anit-humano Foxp3-APC clone 236A/E7</td><td>eBioscience</td><td>17-4777-42</td><td></td></tr><tr><td>microesferas anti-CD25 humanas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-983</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD25-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD28 anticorpo, LEAF Purified&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>302914</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo CD3 humano, purificado por LEAF&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>CD45RA anti-humano, FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-247</td><td></td></tr><tr><td>clone PE CD45RO anti-humano UCHL1</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td></td></tr><tr><td>clone anti-CD4-PerCP humano SK3; mIgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>345770</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a</td><td>eBioscience</td><td>48-0086-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, violeta brilhante 421</td><td>BD Biosciences</td><td>562743 clone</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano IFN-g FITC 4S. B3; mIgG1k</td><td>eBioscience</td><td>11-7319-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solução contendo Brefeldin A: GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>kit de síntese de cDNA: SuperScript VILO(transcriptase reversa) Kit de síntese de cDNA</td><td>Invitrogen</td><td>11754-250</td><td></td></tr><tr><td>Meio de centrifugação de densidade: Ficoll-Paque</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 99,7%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS, Invitrogen</td><td></td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Corante de Viabilidade Fixável Inativado por Calor, eFluor 780&nbsp; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14 ou 65-0865-18&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de tampão de coloração Foxp3</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Cuidado: contém paraformaldeído. Também pode ser comprado em kit combinado com anticorpos; 77-5774-40 Conjunto de coloração anti-humana Foxp3 Clone APC: 236A/E7 Conjunto</td></tr><tr><td>GlutaMAX (200 mM L-alanil-L-glutamina)</td> <td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>kit de isolamento de células T CD4 virgens humanas II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sérica humana 50 g/L</td><td>Baxter</td><td>1501057</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina de Streptomyces conglobatus >98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Colunas MACS LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>mouse IgG1 K Controle de Isotipo APC Clone: P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td></td></tr><tr><td>mouse IgG1 K Controle de Isotipo FITC 50 &#956; g</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>controle de isotipo IgG2a de camundongo, violeta brilhante 421, clone MOPC-173</td><td>BD Biosciences</td><td>563464</td><td></td></tr><tr><td>plástico pipetado Pasteur, embalado individualmente</td><td>Sarstedt</td><td>86.1172.001&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA Phorbol 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585-1MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>EMD (Merck)</td> <td>553210-100UG</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humana recombinante, CF</td><td>R & D</td><td>202-IL-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>Humano Recombinante TGF-beta 1, CF</td><td>RnD</td><td>240-B-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>Kit de isolamento de RNA: RNAqueous-Micro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Médio&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>72400-054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Butirato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887-250MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Meio de cultura de células T: meio X-Vivo 15, com gentamicina+fenolvermelho</td> Ensaio de Expressão Gênica <td>TaqMan Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>, FOXP3 (Melhor Cobertura)&nbsp;</td>ID <td>do ensaio 4331182;</td> da <td>Applied Biosystems</td>: Hs01085834_m1 <td>Cuidado: contém paraformaldeído</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Melhor Cobertura)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351370; ID do ensaio: Hs04194366_g1&nbsp; &nbsp;</td><td>Cuidado: contém paraformaldeído</td></tr><tr><td>Mistura mestre de expressão gênica TaqMan 4369514</td><td></td><td></td> <td>Applied Biosystems</td></tr></tbody></table>

na diferenciação in vitro de células t cd4 + humano foxp3 + induzida t reguladoras (itregs) a partir de células naive t cd4 + usando um protocolo de tgf-β contendo

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

As células T reguladoras (Tregs) são parte integrante da tolerância periférica, suprimindo reações imunes contra autoestruturas e, assim, prevenindo doenças autoimunes. Abordagens clínicas para transferir Tregs adotivamente, ou para esgotar Tregs no câncer, estão em andamento com primeiros resultados promissores. 
Como o número de Tregs de ocorrência natural (nTregs) é muito limitado, estudar certas características de Treg usando Tregs induzidas in vitro (iTregs) pode ser vantajoso. Até o momento, o melhor, embora não absolutamente específico, marcador de proteína para delinear Tregs é o fator de transcrição FOXP3. Apesar da importância das Tregs incluírem papéis não redundantes das Tregs induzidas perifericamente, os protocolos para gerar iTregs são atualmente controversos, particularmente para células humanas. Este protocolo, portanto, descreve a diferenciação in vitro de iTregs CD4 + FOXP3 + humanos de células T virgens humanas usando uma variedade de fatores indutores de Treg (TGF-β mais IL-2 apenas, ou sua combinação com ácido retinóico, rapamicina ou butirato) em paralelo. Também descreve a fenotipagem dessas células por citometria de fluxo e qRT-PCR. 
Esses protocolos resultam na expressão reprodutível de FOXP3 e outros genes de assinatura de Treg e permitem o estudo de mecanismos regulatórios gerais de FOXP3, bem como efeitos específicos do protocolo para delinear o impacto de certos fatores. Os iTregs podem ser utilizados para estudar vários aspectos fenotípicos, bem como mecanismos moleculares de indução de Treg. Estudos moleculares detalhados são facilitados por números de células relativamente grandes que podem ser obtidos. 
Uma limitação para a aplicação de iTregs é a relativa instabilidade da expressão de FOXP3 nessas células em comparação com nTregs. As iTregs geradas por esses protocolos também podem ser usadas para ensaios funcionais, como o estudo de sua função supressora, na qual as iTregs induzidas por TGF-β mais ácido retinóico e rapamicina exibem atividade supressora superior. No entanto, a capacidade supressiva dos iTregs pode diferir dos nTregs e o uso de controles apropriados é crucial.

A Figura 1 mostra um esquema da montagem experimental. A Figura 2 mostra uma coloração controle de pureza representante para as células T CD4 + naïve magneticamente isoladas e nTregs. F igura 3A mostra a citometria de fluxo estratégia de propagação e Figura 3B mostra FOXP3 representativa e CD25 citometria de fluxo colorações no dia 6 da cultura nas ...

Este protocolo descreve a geração reprodutível e fenotipagem de células T reguladoras humanas induzida (iTregs) a partir de células naive T CD4 + in vitro. Diferentes protocolos de indução de FOXP3 permitem o estudo de fenótipos específicos iTreg obtidos com os respectivos protocolos.

Na diferenciação in vitro de células T CD4 + humano FOXP3 + Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 + usando um protocolo de TGF-β contendo

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Os objetivos gerais deste experimento são induzir células T reguladoras humanas positivas para FOXP3 a partir de células T CD4 virgens in vitro e analisar seu fenótipo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia de células T, como como ocorre a diferenciação regulatória de células T no nível molecular? A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a geração e fenotipagem reprodutíveis de células T reguladoras FOXP3 positivas para humanos.Embora esse método possa fornecer informações sobre a diferenciação de células T reguladoras, ele também pode ser modificado para estudar outros subconjuntos de células T CD4 e outras células imunes de interesse. A demonstração visual desse método é crucial porque as etapas de isolamento de bits magnéticos e PBMC são fáceis de entender quando mostradas em vez de descritas. Para isolar as células T do sangue periférico, comece adicionando 15 mililitros de gradiente de densidade de temperatura ambiente em cinco tubos de 50 mililitros por camada leucocitária e aumente o volume final da camada leucocitária para 180 mililitros com PBS à temperatura ambiente.Em seguida, incline um tubo de meio de gradiente de densi

in-vitro-differentiation-human-cd4-foxp3-induced-regulatory-t-cells

Research

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Na diferenciação in vitro de células T CD4 + humano FOXP3 + Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 + usando um protocolo de TGF-β contendo (Vídeo) | JoVE Journal

Na diferenciação in vitro de células T CD4 ⁺ humano FOXP3 ⁺ Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 ⁺ usando um protocolo de TGF-β contendo

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