Na diferenciação in vitro de células T CD4 ⁺ humano FOXP3 ⁺ Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 ⁺ usando um protocolo de TGF-β contendo

Os objetivos gerais deste experimento são induzir células T reguladoras humanas positivas para FOXP3 a partir de células T CD4 virgens in vitro e analisar seu fenótipo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia de células T, como como ocorre a diferenciação regulatória de células T no nível molecular? A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a geração e fenotipagem reprodutíveis de células T reguladoras FOXP3 positivas para humanos.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a diferenciação de células T reguladoras, ele também pode ser modificado para estudar outros subconjuntos de células T CD4 e outras células imunes de interesse. A demonstração visual desse método é crucial porque as etapas de isolamento de bits magnéticos e PBMC são fáceis de entender quando mostradas em vez de descritas. Para isolar as células T do sangue periférico, comece adicionando 15 mililitros de gradiente de densidade de temperatura ambiente em cinco tubos de 50 mililitros por camada leucocitária e aumente o volume final da camada leucocitária para 180 mililitros com PBS à temperatura ambiente.

Em seguida, incline um tubo de meio de gradiente de densidade para o lado e coloque lentamente aproximadamente 35 mililitros de sangue diluído no meio de gradiente de densidade sem misturar as soluções. Separe as células por centrifugação. Em seguida, transfira as camadas brancas de PBMC entre o gradiente de densidade e as fases de plasma de cada tubo para novos tubos cônicos de 50 mililitros.

Lave o PBMC com 200 mililitros de PBS fresco e ressuspenda os pellets em meio completo para depleção dos monócitos do sangue periférico por aderência plástica. Depois de coletar as células flutuantes, lave o PBMC três vezes em até 50 mililitros de PBS fresco, ressuspendendo o pellet final em 40 microlitros de tampão de isolamento de quatro graus Celsius e 10 microlitros de coquetel de anticorpos de biotina de células T CD4-positivas virgens por um vezes 10 para as sétimas células com mistura completa. Incube as células por 10 minutos a quatro graus Celsius, depois lave as células com 40 mililitros de PBS de quatro graus Celsius e ressuspenda o pellet em 80 microlitros de tampão de isolamento e 20 microlitros de microesferas anti-biotina por uma vez 10 elevado às sétimas células para uma incubação de 15 minutos a quatro graus Celsius.

Enquanto as células estão incubando, coloque uma coluna LS em um ímã e equilibre com três mililitros de tampão de isolamento, depois lave as células em 50 mililitros de PBS e ressuspenda o pellet em três mililitros de tampão de isolamento fresco. Agora adicione as células à coluna, coletando o fluxo ingênuo contendo células T CD4-positivas em um tubo de 15 mililitros. Quando a coluna parar de pingar, enxágue o tubo com dois mililitros de tampão de isolamento e transfira a lavagem para a coluna.

Após a última lavagem, pulverize as células T classificadas magneticamente por centrifugação, seguidas de duas lavagens em 15 mililitros de meio, resultando em uma população de células T CD4-positivas virgens superiores a 94% puras. Para induzir células T reguladoras, adicione 50 microlitros dos estímulos apropriados aos poços correspondentes de uma placa de 96 poços revestida com anti-CD3. Em seguida, encha os poços vazios, incluindo os poços de margem, com 200 microlitros de PBS e pré-aqueça as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Ajuste a concentração das células T virgens em repouso para uma densidade de 2,2 a 2,6 vezes 10 elevado à sexta células por mililitro em meio de 37 graus Celsius e adicione 50 microlitros de células a cada poço. Quando todas as células tiverem sido semeadas, embrulhe a placa em papel alumínio para proteção contra a luz e devolva a placa à incubadora de cultura de células. Após dois a três dias, pequenos aglomerados de células em proliferação que emergem em aglomerados maiores em momentos posteriores devem se tornar visíveis por microscopia de luz.

Após quatro a seis dias, o meio muda de ligeiramente laranja para amarelado, e as pelotas de células agrupadas são visíveis a olho nu. Para avaliar a expressão do marcador de superfície celular, use uma pipeta para ressuspender as células em cada poço e transfira as células para uma nova placa de fundo em U de 96 poços, deixando um poço livre ao redor de cada poço para evitar contaminação por transbordamento durante o processo de permanência. Quando todas as células tiverem sido transferidas, centrifugue a placa e descarte o sobrenadante.

Deixando o prato de cabeça para baixo em um papel absorvente, bata no prato uma vez e imediatamente vire-o para cima. Vórtice para ressuspender as células no líquido restante. Em seguida, adicione 25 microlitros de pré-mistura de superfície a cada poço e incube a placa por 30 minutos a quatro graus Celsius no escuro.

No final da incubação, lave os poços duas vezes em 200 microlitros de PBS, removendo o sobrenadante e ressuspendendo as células após cada lavagem, como acabamos de demonstrar. Em seguida, realize a viabilidade e a coloração intracelular para FOXP3 e outros marcadores de interesse. Nesses gráficos, é mostrada a estratégia de gating por citometria de fluxo para células T reguladoras CD25-positivas para CD4-positivas para FOXP3.

Após estimulação in vitro, a maioria das células regula o CD25, cuja expressão é reduzida na presença de rapamicina. Somente sob a adição de fatores Tregs induzíveis uma população clara de células positivas para FOXP3 com níveis de expressão de proteína intracelular tão altos quanto Tregs de ocorrência natural se torna aparente. De fato, cada condição de Treg induzida demonstra um padrão específico e reprodutível de proliferação celular.

Com o TGF beta induzindo um ligeiro aumento na proliferação e o ácido all-trans retinóico aumentando drasticamente a proliferação de células T, enquanto a adição de rapamicina às culturas reduz fortemente o tamanho do aglomerado de células. A análise de QRT-PCR de Tregs induzidas indica que a expressão de mRNA de FOXP3 é maior em todas as culturas de Treg induzidas em comparação com células estimuladas por controle, com Tregs induzidas tratadas com rapamicina exibindo os níveis mais baixos de mRNA de FOXP3 das culturas de Treg induzidas. Além disso, observa-se que a expressão de mRNA de FOXP3 em Tregs de ocorrência natural é maior do que a exibida por qualquer uma das populações de células T reguladoras induzíveis.

Essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da imunologia de células T explorarem os mecanismos moleculares de geração e função de Treg em doadores saudáveis ou em pacientes com doença autoimune ou câncer. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células T CD4-positivas virgens humanas e como diferenciar e fenotipar as NUs resultantes em células T reguladoras. Por favor, não se esqueça de que trabalhar com sangue humano ou paraformaldeído pode ser extremamente perigoso.

Portanto, precauções como pré-processamento, fazer todas as vacinas, usar roupas de proteção e usar o descarte adequado de resíduos devem ser levadas em consideração ao realizar esses procedimentos.