Name: O Método ChIP-exo: Identificando Protein-DNA Interações com perto da base Pair Precision (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprenda o método ChIP-exo para mapear interações proteína-DNA com precisão de pares de bases em células vivas. Esta técnica avançada de imunoprecipitação cromatina combina tratamento com exonuclease e sequenciamento de alta vazão para estudos de regulação gênica e epigenética.

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Agradecemos ao Venters Lab e aos membros do Departamento de Fisiologia Molecular e Biofísica pelas discussões úteis. Agradecimentos especiais a Frank Pugh por sua orientação, orientação e muitas discussões perspicazes sobre as nuances do ChIP-exo enquanto eu era pós-doutorando em seu laboratório.

<ol><li>Venters, B. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+eukaryotic+genes+are+transcribed%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How eukaryotic genes are transcribed.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+dynamics+of+enhanceosome+assembly+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells.</a> Cell. 156, 1274-1285 (2014).</li>
<li>Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+MEF2+target+gene+analysis+in+cardiac+and+skeletal+muscle+reveals+novel+regulation+of+DUSP6+by+p38MAPK-MEF2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling.</a> Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).</li>
<li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+ArgR-DNA+complexes+at+the+genome-scale+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).</li>
<li>Katainen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF%2Fcohesin-binding+sites+are+frequently+mutated+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer.</a> Nat Genet. 47, 818-821 (2015).</li>
<li>Murphy, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+protein-DNA+interaction+underlying+metazoan+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination.</a> Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).</li>
<li>Zere, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Targets+and+Features+of+BarA-UvrY+%28-SirA%29+Signal+Transduction+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems.</a> PLoS One. 10, e0145035(2015).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li>
<li>Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnucleosomal+structures+and+nucleosome+asymmetry+across+a+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome.</a> Cell. , 1377-1388 (2014).</li>
<li>Pugh, B. F., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Organization+of+Human+Transcription+Initiation+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes.</a> PLoS One. 11, e0149339(2016).</li>
<li>Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneTrack--a+genomic+data+processing+and+visualization+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework.</a> Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).</li>
<li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS computational biology. 8, e1002638(2012).</li>
<li>Bardet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+transcription+factor+binding+sites+from+ChIP-seq+data+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution.</a> Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MACE%3A+model+based+analysis+of+ChIP-exo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MACE: model based analysis of ChIP-exo.</a> Nucleic Acids Res. 42, e156(2014).</li>
<li>Bentley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-exo+method+for+identifying+genomic+location+of+DNA-binding+proteins+with+near-single-nucleotide+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24(2012).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).</li>
<li>Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Illumina-based+ChIP-exonuclease+method+provides+insight+into+FoxA1-DNA+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties.</a> Genome Biol. 14, R147(2013).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

<html> Nós apresentamos um protocolo de genômica funcional para determinar a localização de ligação preciso para cromatina proteínas que interagem de uma maneira imparcial, genome-wide em perto de resolução de pares de bases. O passo mais crítico para alcançar perto da base uma resolução de mapeamento par é o tratamento exonuclease do DNA enriquecido com chip, enquanto o immunoprecipitate permanece na resina magnética. Aparentemente, complexos de proteína poderia bloquear footprinting in vivo de qualquer subunid...

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é um método poderoso para estudar os mecanismos de regulação de genes por enriquecer selectivamente para fragmentos de ADN que interagem com uma dada proteína em células vivas. Métodos de detecção de fragmentos de DNA enriquecido-chip evoluíram como a tecnologia melhora, desde a detecção de um único locus (standard ChIP-qPCR) para hibridação em microarranjos de oligonucleotídeos (Chip-chip) para sequenciamento de alto rendimento (ChIP-seq) 1. Embora ChIP-seq tem visto aplicação generalizada, a heterogeneidade da cromatina e interações de DNA não específicos têm dificultado a qualidade dos dados levando a falsos positivos e mapeamento impreciso. Para contornar essas limitações, o Dr. Frank Pugh desenvolveu o método ChIP-exo 2. A característica saliente do chip de exo-é que incorpora uma 5 &#39;a 3&#39; exonuclease de forma eficaz footprinting factor de transcrição locais de ligação. Como resultado, a metodologia ChIP-exo atinge mais de alta resolução, uma gama dinâmica maior de detection, e menor ruído de fundo. Embora ChIP-exo é tecnicamente mais difícil de dominar do que ChIP-seq, ele está sendo amplamente adotado como estudos como objectivo obter uma visão única de altíssima resolução usando diversos sistemas biológicos 3-8. Na verdade, Chip-exo foi aplicado com sucesso em bactérias, leveduras, rato, rato, e sistemas de células humanas. Como prova de princípio, Chip-exo foi originalmente usado para identificar o motivo de ligação preciso para um punhado de transcrição de levedura fatores 2. A técnica também foi usada em levedura para o estudo da organização do complexo de pré-iniciação da transcrição, e para decifrar a estrutura de vários subnucleosomal histonas 9,10. Mais recentemente, temos alavancado ChIP-exo para resolver TFIIB adjacente e Pol II eventos em promotores humanos vinculativo, e mostrou que a transcrição divergente generalizada surge de iniciação distintos complexos 11. O fluxo de trabalho aqui apresentado é otimizado e streamlined para Chip-exo de mamífero (Figura 1). Em primeiro lugar, que vivem células de cultura primárias ou tecidos são tratados com formol para preservar em interações proteína-ADN in vivo através de uma ligação cruzada covalente. As células são lisadas e cromatina tosquiada de ~ 100 - 500 fragmentos de tamanho de pares de bases. ChIP então enriquece selectivamente fragmentos de ADN para reticulados para a proteína de interesse. Neste ponto, as bibliotecas de chip SEQ são tipicamente preparados, o que limita inerentemente a resolução de detecção para o fragmento de tamanho médio de algumas centenas de pares de bases. No entanto, Chip-exo supera esta limitação aparando o direito 5 fronteiras de ADN do local de ligações cruzadas proteína-DNA com exonuclease lambda e esquerdo. bibliotecas de sequenciação são então construído a partir de ADN digerido com exonuclease como detalhado abaixo. As fronteiras aninhados 5 &#39;resultantes representam uma pegada in vivo da interacção ADN-proteína (Figura 1, o passo 14), e são detectados por sequenciação de elevado rendimento. AltHough a metodologia ChIP-exo é mais envolvido do que ChIP-seq, transições entre a maioria das etapas requer lavagem cordão simples, que minimiza a perda de amostra e da variabilidade experimental. Importante, uma vez que ChIP-exo é uma versão refinada do ChIP-seq, qualquer amostra que seja bem sucedido com o chip-seq também deve ser bem sucedido com o chip-exo. O footprinting in vivo de interacções proteína-ADN com resultados ChIP-exo numa estrutura de dados fundamentalmente distinto ChIP-seq. Embora chamadores comuns Chip-seq pode ser aplicada a dados do chip-exo, para obter as chamadas pico mais precisos recomendamos ferramentas de bioinformática projetados especificamente com a estrutura única de dados do chip-exo em mente. Estes incluem Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla e ExoProfiler 12-15.

<table><tbody><tr><td>37% de formaldeído, sem metanol, 10 ampolas de 10 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>Seção 3</td></tr><tr><td>Coquetel completo de inibidor de protease (CPI)</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>Seções 4, 8</td></tr><tr><td>Bioruptor sonicator</td><td>Diagenode</td><td>UCD200</td><td>Seção 5</td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno de 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352095</td><td>Seção 5</td></tr><tr><td>Contas MagSepharose Protein G Xtra</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9670-66</td><td>Seção 6</td></tr><tr><td>DynaMag-1.5 ml Rack Magnético Lateral</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Seções 6-17, 22</td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>Seções 7, 22</td></tr><tr><td>T4 DNA Polimerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0203</td><td>Seção 9</td></tr><tr><td>DNA Polimerase I, Klenow</td><td>New England BioLabs</td><td>M0210</td><td>Seção 9</td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2 (10x Tampão de Reação 2)</td> <td>New England BioLabs</td><td>B7002</td><td>Seções 9-11, 13, 15, 20</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382</td><td>Seções 9-16</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Roche Life Science</td><td>010419979001</td><td>Seções 9, 11, 13</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447</td><td>Seções 9, 12, 19, 23</td></tr><tr><td>T4 Polinucleotídeo Quinase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201</td><td>Seções 9, 13</td></tr><tr><td>dATP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0440</td><td>Seções 10, 20</td></tr><tr><td>Klenow 3'-5' Exo Minus</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212</td><td>Seções 10, 20</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202</td><td>Seções 11, 21</td></tr><tr><td>&phi;-29 DNA polimerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0269</td><td>Seções 12, 19</td></tr><tr><td>10x &phi;-29 Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0269</td><td>Seções 12, 19</td></tr><tr><td>Exonuclease Lambda</td><td>New England BioLabs</td><td>M0262</td><td>Seção 14</td></tr><tr><td>10x Lambda Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0262</td><td>Seção 14</td></tr><tr><td>RecJf Exonuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>M0264</td><td>Seção 15</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche Life Science</td><td>03115828001</td><td>Seção 16</td></tr><tr><td>Glicogênio</td><td>Roche Life Science</td><td>010901393001</td><td>Seção 18</td></tr><tr><td>10x T4 Ligase Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202</td><td>Seção 21</td></tr><tr><td>AMPure XP (limpeza) contas&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Seção 22</td></tr><tr><td>Q5 Hot Start DNA Polimerase&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0493</td><td>Seção 23</td></tr><tr><td>5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer)</td><td>New England BioLabs</td><td>B9027</td><td>Seção 23</td></tr><tr><td>QIAquick Kit de Extração de Gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Seção 25</td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Fluorômetro Invitrogen</td><td>Q33216</td><td>Seção 26</td></tr><tr><td>Tubos Qubit Ópticos Transparentes&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td>Seção 26</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Kit de ensaio de alta sensibilidade</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Seção 26</td></tr></tbody></table>

o método chip-exo: identificando protein-dna interações com perto da base pair precision

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma ferramenta indispensável nos campos da epigenética e regulação de genes que isola as interações proteína-ADN específicos. ChIP acoplado a sequenciação de alto rendimento (ChIP-SEQ) é normalmente usado para determinar a localização genómica de proteínas que interagem com a cromatina. No entanto, ChIP-seq é dificultada pela resolução relativamente baixa de mapeamento de várias centenas de pares de bases e alto sinal de fundo. O método ChIP-exo é uma versão refinada do ChIP-seq que melhora substancialmente com a ambas resolução e ruído. A distinção fundamental da metodologia de ChIP-exo é a incorporação de digestão com exonuclease lambda no fluxo de trabalho para a preparação da biblioteca pegada de forma eficaz a esquerda e para a direita 5 fronteiras de ADN do local de ligação cruzada do ADN-proteína. As bibliotecas Chip-exo são então sujeitas a sequenciação de alto rendimento. Os dados resultantes podem ser aproveitados para proporcionar uma visão única e ultra-alta resolução para a organização funcional of do genoma. Aqui, descrevemos o método ChIP-exo que temos otimizado e simplificado para os sistemas de mamíferos e uma plataforma de sequenciamento-by-síntese da próxima geração.

As figuras a seguir ilustram resultados representativos do protocolo ChIP-exo aqui apresentada. Em contraste com metodologias tradicionais Chip-seq com poucos passos enzimáticos, Chip-exo requer onze reações enzimáticas sequencialmente dependentes (Figura 1). Assim, deve ser tomado cuidado em cada passo para garantir que cada componente de reacção é adicionada a sua respectiva mistura principal de reacção. Recomendamos gerando uma planilha fórmulas com base nas tabelas d...

Aqui, apresentamos um protocolo para alcançar a resolução próxima do par de bases das interações proteína-DNA. Isso é obtido pelo tratamento com exonuclease de fragmentos de DNA seletivamente enriquecidos por imunoprecipitação de cromatina (ChIP-exo) seguido de sequenciamento de alto rendimento.

O Método ChIP-exo: Identificando Protein-DNA Interações com perto da base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

O objetivo geral dessa tecnologia genômica funcional é identificar os locais genômicos precisos que uma determinada proteína ocupa nas células vivas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da regulação gênica e epigenética, como a forma como a maquinaria de transcrição se monta e opera no contexto da cromatina. A principal vantagem dessa técnica é que ela revela a localização genômica exata para interações de DNA de proteína em pré-resolução próxima à base com fundo excepcionalmente baixo.Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o protocolo é complexo e requer atenção aos detalhes por toda parte. Para sonicar lisados nucleares, comece colocando adaptadores de resina em tubos de poliestireno de 15 mililitros contendo extratos nucleares. Sonicar os lisados em banho-maria gelada em potência média por 30 segundos ligado e 30 segundos desligado por um total de duas sessões de 15 minutos.Para verificar os resultados da sonicação, transfira duas amostras de 10 microlitros de cada tubo para tubos de 1,5 mililitro. Em seguida, inverta as reticulações combinando a primeira amostra de 10 microlitros com 10 microlitros de TE-RNase A e 0,2 microlitros de proteinase K. Incube o tubo a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, adicione quatro microlitros de corante de DNA de xileno 6X.Para a segunda amostra de 10 microlitros, preserve as ligações cruzadas adicionando dois microlitros de corante de DNA de xileno 6X. Execute ambas as amostras em um gel de 1,5% de agarose a 140 volts por aproximadamente 30 a 45 minutos até que o corante bromofenol neste último esteja três quartos do gel. Se a sonicação for bem-sucedida, transfira os lisados sonicados para dois tubos de mililitros contendo 150 microlitros de Triton X-100 a 10% e vórtice para misturar.Pulverizar a cromatina insolúvel e os detritos centrifugando os lisados sonicados a 20 000 vezes g a quatro graus Celsius durante 10 minutos. Em seguida, transfira os sobrenadantes para novos tubos de dois mililitros. Armazene as amostras a 80 graus Celsius negativos indefinidamente.Para cada imunoprecipitação de cromatina ou reação ChIP, combine 1,5 mililitros de extratos sonicados com conjugados de esferas de anticorpos em tubos de 1,5 mililitro. Incube os tubos em um mini rotador de tubos a uma velocidade de nove a quatro graus Celsius durante a noite. Verifique após alguns minutos para garantir que as amostras não estejam vazando e estejam se misturando corretamente.No dia seguinte, gire brevemente os tubos para coletar o líquido nas tampas e coloque os tubos em um rack magnético por um minuto. Em seguida, aspirar o extracto. Adicione 0,75 mililitros de tampão RIPA a cada tubo.Em seguida, remova os tubos do rack magnético e inverta-os várias vezes para misturar. Após uma breve rotação, coloque os tubos de volta no ímã e aspire o sobrenadante. Após a última lavagem, adicione 0,75 mililitros de Tris HCL 10 milimolares a cada tubo.Remova os tubos do rack magnético e inverta as amostras várias vezes para misturar. Após uma breve rotação, coloque os tubos de volta no rack e aspire o sobrenadante. Depois de realizar as reações de polimento e detalhamento de acordo com o protocolo de texto, preencha os cálculos do master mix de ligação.Em seguida, faça a mistura de ligadura em um tubo de 1,5 mililitro no gelo e pipete para misturar a solução. Com os tubos de amostra no rack magnético, adicione 48 microlitros de mistura mestre de ligação P7 e dois microlitros de um índice de adaptador diferente a cada uma das resinas de amostra. Incube as amostras em um ThermoMixer três vezes g em 25 graus Celsius por duas horas.Depois de lavar as amostras e realizar o reparo de corte Phy 29 e as reações de quinase de acordo com o protocolo de texto, preencha os cálculos da mistura principal de exonuclease lambda e faça a mistura de exonuclease lambda em um tubo de 1,5 mililitro no gelo. Adicione 50 microlitros de mistura de exonuclease lambda a cada amostra de resina enquanto ainda estiver no rack magnético. Em seguida, incube as amostras em um ThermoMixer três vezes g em 37 graus Celsius por 30 minutos.Depois de aspirar a última lavagem conforme descrito no protocolo de texto, realize a reação de nuclease RecJf preenchendo os cálculos da mistura mestre RecJf e fazendo a mistura RecJf no gelo. Adicione 50 microlitros da mistura RecJf a cada amostra de resina no rack magnético. Em seguida, incube as amostras em um ThermoMixer três vezes g em 37 graus Celsius por 30 minutos.Após aspirar a última lavagem, prepare o tampão de eluição ChIP e a mistura principal de proteinase K e adicione 200 microlitros da solução a cada resina de amostra. Incube as amostras em um ThermoMixer três vezes g em 65 graus Celsius durante a noite com uma tampa aquecida para evitar condensação. No dia seguinte, gire brevemente as amostras e coloque os tubos no rack magnético por um minuto.Em seguida, transfira 200 microlitros de sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro contendo 200 microlitros de tampão TE. Após a extração de DNA, extensão primária P7 e reações ATL, preencha os cálculos de mistura mestre da tabela de ligação do adaptador P5 e faça a mistura mestre de ligação no gelo. Adicione 20 microlitros da mistura de ligadura a cada amostra e pipeta para misturar.Em seguida, incube as amostras em um termociclador a 25 graus Celsius por duas horas. Realize a purificação e quantificação do DNA de acordo com o protocolo de texto. Como mostrado aqui, vale a pena gastar tempo para otimizar as condições de sonicação para obter extratos de cromatina de alta qualidade que produzem fragmentos de DNA entre 100 a 500 pares de bases.E o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética é usado para verificar se os extratos sonicados contêm ligações cruzadas de DNA de proteína intactas, evidentes como um super deslocamento de fragmentos de DNA. Para avaliar o sinal de fundo, um ChIP simulado é rotineiramente realizado sem anticorpos na reação. Uma exobiblioteca ChIP de alta qualidade produzirá muito pouco histórico na amostra simulada em comparação com uma preparação de biblioteca ChIP-seq.Aqui é mostrada uma avaliação do bioanalisador de uma biblioteca ChIP-exo. A análise garante com precisão a distribuição do tamanho da biblioteca e detecta dímeros de adaptador contaminantes que são executados em 125 pares de bases. Este painel ilustra a distribuição suave de cinco Ns primos da marca ChIP-exo separados por fita para polimerase II, TFIIB e TBP no gene RPS12 humano em células K562 em proliferação.Nesta figura são mostrados os padrões médios de ChIP-exo em relação aos locais de início da transcrição dos genes codificadores de proteínas. As principais localizações de pico para TBP, TFIIB e polimerase II na parcela composta refletem a organização genômica dos complexos de iniciação da transcrição humana. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro dias se executada corretamente.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da regulação gênica explorarem detalhes moleculares da estrutura subnuclear na assimetria em leveduras. Seguindo este procedimento, outros métodos, como o perfil de expressão de busca de RNase, podem ser realizados para abordar questões como se um determinado fator influencia a expressão de um gene próximo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preencher cuidadosamente as tabelas de mixagem principal para todas as etapas enzimáticas.Não se esqueça, trabalhar com agentes cancerígenos e outros agentes cáusticos pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento. Depois deste vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar uma biblioteca ChIP-exo de alta qualidade.

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Cromatina Análise de Interação por Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) é um método...

Cromatina Análise de Interação com Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) para mapeamento Interações cromatina e Compreensão regulação da transcrição

Neste vídeo, demonstramos a técnica de imunoprecipitação da cromatina para identificar locais de ligação a proteínas em regiões específicas do DNA genômico de células precursoras de oligodendrócitos por meio da imunoprecipitação seletiva de fragmentos de cromatina ligados a proteínas. Este método ajuda a estudar a interação de várias proteínas reguladoras, incluindo fatores de transcrição envolvidos na regulação gênica.

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Ao combinar nativa e reticulação da cromatina imunoprecipitação com alta resolução de Espectrometria de Massa, ChroP abordagem permite a dissecar a arquitectura proteómica composto de histonas modificações, variantes e proteínas não-histonic sinergia na cromatina domínios funcionalmente distintos.

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Extração de sal sequencial das proteínas da cromatina vinculada é uma ferramenta útil para determinar as propriedades de vinculação de grandes complexos de proteínas. Esse método pode ser empregado para avaliar o papel das subunidades individuais ou domínios na afinidade total de uma proteína complexa em massa de cromatina.

Extrações de sal sequenciais para a análise da cromatina em massa vincular propriedades de cromatina modificando complexos

Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase).

Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

A determinação precisa de locais de ligação de proteínas em todo o genoma é importante para entender a regulação genética. Aqui descrevemos um método de mapeamento genômico que trata DNA cromatina-imunoprecipitado com digestão exonuclease (ChIP-exo) seguido de sequenciamento de alta produtividade. Este método detecta interações proteína-DNA com resolução de mapeamento quase par de bases e alta relação sinal-ruído em neurônios mamíferos.

Mapeamento de alta resolução de interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco do rato usando Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Este artigo introduz passos essenciais de imunoprecipitação de imunossuagem e cromatina. Esses protocolos são comumente usados para estudar processos celulares relacionados ao dano de DNA e para visualizar e quantificar o recrutamento de proteínas implicadas na reparação do DNA.

Visualizando e quantificando danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease

A interação de um remodelador de cromatina dependente de ATP com um ligante de DNA é descrita usando espectroscopia de CD. As alterações conformais induzidas em um promotor genético analisado pelos picos gerados podem ser usadas para entender o mecanismo de regulação transcricional.

Espectroscopia de CD para estudar interações DNA-proteína

CUT&amp;RUN e suas variantes podem ser usadas para determinar a ocupação de proteínas na cromatina. Este protocolo descreve como determinar a localização da proteína na cromatina usando uliCUT&amp;RUN unicelular.

Localização de fator unicelular em Chromatina usando decote de entrada ultra-baixa sob alvos e liberação usando nuclease

Um método ChIRP baseado em UV para identificar interações diretas entre lncRNA e proteína.

Um método de ChIRP Baseado em UV para a Identificação Verificável de Proteínas que Interagem Diretamente com LncRNA: De Células Cultivadas a Testículos de Camundongos

Aprenda o método ChIP-exo para mapear interações proteína-DNA com precisão de pares de bases em células vivas. Esta técnica avançada de imunoprecipitação cromatina combina tratamento com exonuclease e sequenciamento de alta vazão para estudos de regulação gênica e epigenética.

O Método ChIP-exo: Identificando Protein-DNA Interações com perto da base Pair Precision

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