O Método ChIP-exo: Identificando Protein-DNA Interações com perto da base Pair Precision

O objetivo geral dessa tecnologia genômica funcional é identificar os locais genômicos precisos que uma determinada proteína ocupa nas células vivas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da regulação gênica e epigenética, como a forma como a maquinaria de transcrição se monta e opera no contexto da cromatina. A principal vantagem dessa técnica é que ela revela a localização genômica exata para interações de DNA de proteína em pré-resolução próxima à base com fundo excepcionalmente baixo.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o protocolo é complexo e requer atenção aos detalhes por toda parte. Para sonicar lisados nucleares, comece colocando adaptadores de resina em tubos de poliestireno de 15 mililitros contendo extratos nucleares. Sonicar os lisados em banho-maria gelada em potência média por 30 segundos ligado e 30 segundos desligado por um total de duas sessões de 15 minutos.

Para verificar os resultados da sonicação, transfira duas amostras de 10 microlitros de cada tubo para tubos de 1,5 mililitro. Em seguida, inverta as reticulações combinando a primeira amostra de 10 microlitros com 10 microlitros de TE-RNase A e 0,2 microlitros de proteinase K. Incube o tubo a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, adicione quatro microlitros de corante de DNA de xileno 6X.

Para a segunda amostra de 10 microlitros, preserve as ligações cruzadas adicionando dois microlitros de corante de DNA de xileno 6X. Execute ambas as amostras em um gel de 1,5% de agarose a 140 volts por aproximadamente 30 a 45 minutos até que o corante bromofenol neste último esteja três quartos do gel. Se a sonicação for bem-sucedida, transfira os lisados sonicados para dois tubos de mililitros contendo 150 microlitros de Triton X-100 a 10% e vórtice para misturar.

Pulverizar a cromatina insolúvel e os detritos centrifugando os lisados sonicados a 20 000 vezes g a quatro graus Celsius durante 10 minutos. Em seguida, transfira os sobrenadantes para novos tubos de dois mililitros. Armazene as amostras a 80 graus Celsius negativos indefinidamente.

Para cada imunoprecipitação de cromatina ou reação ChIP, combine 1,5 mililitros de extratos sonicados com conjugados de esferas de anticorpos em tubos de 1,5 mililitro. Incube os tubos em um mini rotador de tubos a uma velocidade de nove a quatro graus Celsius durante a noite. Verifique após alguns minutos para garantir que as amostras não estejam vazando e estejam se misturando corretamente.

No dia seguinte, gire brevemente os tubos para coletar o líquido nas tampas e coloque os tubos em um rack magnético por um minuto. Em seguida, aspirar o extracto. Adicione 0,75 mililitros de tampão RIPA a cada tubo.

Em seguida, remova os tubos do rack magnético e inverta-os várias vezes para misturar. Após uma breve rotação, coloque os tubos de volta no ímã e aspire o sobrenadante. Após a última lavagem, adicione 0,75 mililitros de Tris HCL 10 milimolares a cada tubo.

Remova os tubos do rack magnético e inverta as amostras várias vezes para misturar. Após uma breve rotação, coloque os tubos de volta no rack e aspire o sobrenadante. Depois de realizar as reações de polimento e detalhamento de acordo com o protocolo de texto, preencha os cálculos do master mix de ligação.

Em seguida, faça a mistura de ligadura em um tubo de 1,5 mililitro no gelo e pipete para misturar a solução. Com os tubos de amostra no rack magnético, adicione 48 microlitros de mistura mestre de ligação P7 e dois microlitros de um índice de adaptador diferente a cada uma das resinas de amostra. Incube as amostras em um ThermoMixer três vezes g em 25 graus Celsius por duas horas.

Depois de lavar as amostras e realizar o reparo de corte Phy 29 e as reações de quinase de acordo com o protocolo de texto, preencha os cálculos da mistura principal de exonuclease lambda e faça a mistura de exonuclease lambda em um tubo de 1,5 mililitro no gelo. Adicione 50 microlitros de mistura de exonuclease lambda a cada amostra de resina enquanto ainda estiver no rack magnético. Em seguida, incube as amostras em um ThermoMixer três vezes g em 37 graus Celsius por 30 minutos.

Depois de aspirar a última lavagem conforme descrito no protocolo de texto, realize a reação de nuclease RecJf preenchendo os cálculos da mistura mestre RecJf e fazendo a mistura RecJf no gelo. Adicione 50 microlitros da mistura RecJf a cada amostra de resina no rack magnético. Em seguida, incube as amostras em um ThermoMixer três vezes g em 37 graus Celsius por 30 minutos.

Após aspirar a última lavagem, prepare o tampão de eluição ChIP e a mistura principal de proteinase K e adicione 200 microlitros da solução a cada resina de amostra. Incube as amostras em um ThermoMixer três vezes g em 65 graus Celsius durante a noite com uma tampa aquecida para evitar condensação. No dia seguinte, gire brevemente as amostras e coloque os tubos no rack magnético por um minuto.

Em seguida, transfira 200 microlitros de sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro contendo 200 microlitros de tampão TE. Após a extração de DNA, extensão primária P7 e reações ATL, preencha os cálculos de mistura mestre da tabela de ligação do adaptador P5 e faça a mistura mestre de ligação no gelo. Adicione 20 microlitros da mistura de ligadura a cada amostra e pipeta para misturar.

Em seguida, incube as amostras em um termociclador a 25 graus Celsius por duas horas. Realize a purificação e quantificação do DNA de acordo com o protocolo de texto. Como mostrado aqui, vale a pena gastar tempo para otimizar as condições de sonicação para obter extratos de cromatina de alta qualidade que produzem fragmentos de DNA entre 100 a 500 pares de bases.

E o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética é usado para verificar se os extratos sonicados contêm ligações cruzadas de DNA de proteína intactas, evidentes como um super deslocamento de fragmentos de DNA. Para avaliar o sinal de fundo, um ChIP simulado é rotineiramente realizado sem anticorpos na reação. Uma exobiblioteca ChIP de alta qualidade produzirá muito pouco histórico na amostra simulada em comparação com uma preparação de biblioteca ChIP-seq.

Aqui é mostrada uma avaliação do bioanalisador de uma biblioteca ChIP-exo. A análise garante com precisão a distribuição do tamanho da biblioteca e detecta dímeros de adaptador contaminantes que são executados em 125 pares de bases. Este painel ilustra a distribuição suave de cinco Ns primos da marca ChIP-exo separados por fita para polimerase II, TFIIB e TBP no gene RPS12 humano em células K562 em proliferação.

Nesta figura são mostrados os padrões médios de ChIP-exo em relação aos locais de início da transcrição dos genes codificadores de proteínas. As principais localizações de pico para TBP, TFIIB e polimerase II na parcela composta refletem a organização genômica dos complexos de iniciação da transcrição humana. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro dias se executada corretamente.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da regulação gênica explorarem detalhes moleculares da estrutura subnuclear na assimetria em leveduras. Seguindo este procedimento, outros métodos, como o perfil de expressão de busca de RNase, podem ser realizados para abordar questões como se um determinado fator influencia a expressão de um gene próximo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preencher cuidadosamente as tabelas de mixagem principal para todas as etapas enzimáticas.

Não se esqueça, trabalhar com agentes cancerígenos e outros agentes cáusticos pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento. Depois deste vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar uma biblioteca ChIP-exo de alta qualidade.