Imagens ao vivo para estudar microtúbulos instabilidade dinâmica em cancros da mama resistentes a taxano
20 de fevereiro de 2017
Neste artigo, relatamos um protocolo que descreve um método in vivo para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em células de câncer de mama resistentes ao docetaxel (MCF-7TXT). Neste método, um sistema de imagem de microscopia de deconvolução é usado para detectar a expressão de GFP-tubulina em células-alvo.
O objetivo geral deste experimento é medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em células de câncer de mama resistentes ao docetaxel. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular sobre a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em condições fisiológicas e após vários tratamentos medicamentosos. As principais vantagens desta técnica são que ela fornece um protocolo simples, confiável e fisiologicamente aplicável para estudar a dinâmica dos microtúbulos em células vivas.
Antes de iniciar o procedimento, cultive as células do câncer de mama em meio de cultura completo em placas de cultura de 10 centímetros a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até o grau apropriado de confluência. No dia anterior ao experimento, enxágue as lamínulas de vidro revestidas de poli L-lisina de 24 milímetros com álcool a 70% e exponha as lamelas à luz ultravioleta durante a noite. Na manhã seguinte, coloque uma lamínula em cada poço de uma placa de seis poços.
Em seguida, lave as culturas com PBS e retire as células de cada placa com 0,5 mililitros de tripsina EDTA. Quando as células começarem a se levantar do fundo da placa, neutralize a tripsina com cinco mililitros de meio de cultura fresco e conte as células. Em seguida, adicione aproximadamente uma vez 10 as quintas células a cada lamínula, agite a placa suavemente e retorne as células à incubadora por pelo menos 36 horas.
Para testar a dinâmica dos microtúbulos das células, misture a solução estoque de tubulina alfa marcada com GFP várias vezes por inversão para garantir uma solução homogênea sem vórtice. Em seguida, substitua o meio de cultura em cada poço por dois mililitros de meio fresco contendo 40 microlitros da tubulina etiquetada. Agitar suavemente a placa para permitir a mistura completa do marcador com o meio de cultura e voltar a colocar a placa na incubadora durante mais 24 horas.
No dia seguinte, substitua o meio de cultura por meio fresco contendo docetaxel e retorne a placa à incubadora por 30 minutos. Enquanto as células estão sendo inibidas, ligue o microscópio de fluorescência invertida e pré-aqueça o suporte da amostra a 37 graus Celsius. Em seguida, selecione a lente objetiva de óleo 60X 1.42 NA e monte a primeira lamínula no suporte de amostra.
Cubra a amostra com um mililitro de docetaxel fresco a 37 graus Celsius contendo meio e localize um aglomerado de células planas exibindo uma alta intensidade de fluorescência de tubulina alfa marcada com GFP com estruturas de microtúbulos claramente visíveis. Concentre-se na área periférica de uma das células do aglomerado e defina o tempo de exposição apropriado na frequência de aquisição da imagem. Exatamente 50 minutos após a adição da primeira alíquota de docetaxel, comece a registrar a dinâmica dos microtúbulos por dois minutos, obtendo uma foto a cada dois segundos.
Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, crie imagens da próxima célula como acabamos de demonstrar, até que as imagens de cinco células no total de todos os três poços de cada concentração de docetaxel tenham sido capturadas. Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas para cada concentração de inibidor, abra o programa de deconvolução, dentro do sistema de microscópio e clique no processo. Em seguida, selecione deconvolver e arraste o arquivo de imagem para a janela de entrada.
Clique em fazer para desconvolver a imagem e abra o arquivo de imagem deconvolvida no software do microscópio. Clique em arquivo e salve como filme. Defina o formato do filme como AV e o estilo de animação como para frente.
Defina a qualidade da compactação para 100%e a taxa de quadros para cinco por segundo. Em seguida, marque a caixa animar ao longo do tempo e clique em fazer para gerar o vídeo. Neste experimento representativo, células de câncer de mama normais e resistentes ao docetaxel foram tratadas com docetaxel e fotografadas como acabamos de demonstrar, mas os efeitos do tratamento no crescimento e encurtamento dos microtúbulos, mais evidentes nas células não resistentes ao docetaxel.
De fato, medir a taxa de crescimento e encurtamento dos microtúbulos sob condições de tratamento com docetaxel de 0,5 micromolar revela uma forte inibição da dinâmica da tubulina das células parentais, mas não resistentes ao docetaxel. Uma vez dominado, todo o processo pode ser concluído em 60 horas se as técnicas forem executadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de selecionar células planas, com alta intensidade de fluorescência da tubulina GFP, e reduzir a intensidade da fluorescência de excitação e a duração da exposição para evitar o desbotamento da fluorescência GFP.
Desde o seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de biologia celular e do câncer avaliarem os efeitos de vários agentes direcionados a microtúbulos em células normais e cancerígenas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em células vivas sob uma variedade de condições.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em células de câncer de mama resistentes ao docetaxel utilizando microscopia de desconvolução. O método concentra-se na expressão da tubulina GFP em células vivas, fornecendo informações sobre o comportamento dos microtúbulos sob tratamento com fármacos.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Pesquisa em Câncer
- Técnicas de Microscopia
Contexto
- Os microtúbulos desempenham um papel crucial na estrutura e função celular.
- A resistência ao docetaxel é um desafio significativo no tratamento do câncer de mama.
- O entendimento da dinâmica dos microtúbulos pode orientar estratégias terapêuticas.
- A tubulina GFP permite a visualização em tempo real do comportamento dos microtúbulos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para estudar a dinâmica dos microtúbulos em células vivas.
- Investigar os efeitos de tratamentos com fármacos na instabilidade dos microtúbulos.
- Aprimorar a compreensão da biologia das células cancerígenas.
Métodos Utilizados
- Imagem in vivo de microtúbulos utilizando microscopia de desconvolução.
- Cultivo de células de câncer de mama resistentes ao docetaxel (MCF-7 TXT).
- Expressão de tubulina-GFP para visualização.
- Preparação de lamínulas revestidas com poli-L-lisina para adesão celular.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida da dinâmica dos microtúbulos em células vivas.
- Demonstração da instabilidade dos microtúbulos em resposta ao tratamento com fármacos.
- Estabelecimento de um protocolo que pode ser aplicado a diversos tipos celulares.
- Compreensão dos mecanismos de resistência a medicamentos em células cancerígenas.
Conclusões
- O protocolo fornece uma ferramenta valiosa para o estudo da dinâmica dos microtúbulos.
- Os achados contribuem para a compreensão do comportamento das células cancerígenas sob tratamento.
- Pesquisas futuras podem se basear neste método para explorar outras estratégias terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A medição da instabilidade dinâmica dos microtúbulos em células cancerígenas vivas fornece um ensaio fisiologicamente relevante para avaliar mecanismos de resistência a agentes que visam microtúbulos (MTA). Essa abordagem permite a validação de alvos ao associar o comportamento dos microtúbulos à resposta ao fármaco, reforçando a confiança preditiva na triagem pré-clínica de MTA. O método auxilia na redução de riscos das terapias baseadas em taxanos ao identificar fenótipos de resistência precocemente no processo de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a quantificação das taxas de crescimento e encurtamento de microtúbulos sob exposição ao docetaxel.
- Valor Operacional: Utiliza a expressão de tubulina marcada com GFP em células vivas para permitir imagens em tempo real e fisiologicamente aplicáveis, sem artefatos de fixação.
- Valor Preditivo: Distingue fenótipos sensíveis ao docetaxel de fenótipos resistentes com base na inibição da dinâmica de microtúbulos, auxiliando na avaliação da confiança do alvo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Estabelece um protocolo padronizado para medir a dinâmica de microtúbulos em células de câncer de mama aderentes utilizando microscopia de desconvolução.
- Saída Quantitativa: Gera dados de lapso de tempo que permitem a medição das taxas de crescimento e encurtamento de microtúbulos como leituras funcionais.
- Aplicação em Triagem: Permite a avaliação dos efeitos de agentes antimitóticos na instabilidade de microtúbulos em células vivas, facilitando a triagem de compostos ou genótipos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela a resistência a taxanos em células de câncer de mama derivadas de MCF-7, refletindo mecanismos de resistência observados clinicamente.
- Continuidade Tradutiva: Relaciona alterações na dinâmica dos microtúbulos ao arresto mitótico induzido por docetaxel e à resistência à apoptose.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Permite a identificação precoce de fenótipos de resistência, orientando decisões de avançar ou não avançar em programas de desenvolvimento de agentes terapêuticos modificadores do tumor (MTA).
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líder e a avaliação pré-clínica, especialmente para agentes que atuam nos microtúbulos, nos quais o mecanismo de resistência está associado a alterações na dinâmica dos microtúbulos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre o comportamento dos microtúbulos como determinante da resposta a fármacos em células vivas.
- Triagem: Fornece um sistema pronto para ensaio capaz de quantificar alterações na instabilidade dos microtúbulos após perturbações por compostos ou de natureza genética.
- Análises: Permite a medição das taxas de crescimento e encurtamento dos microtúbulos como parâmetros quantitativos e dependentes do tempo, para comparação entre condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona as medidas de instabilidade dinâmica com desfechos funcionais, como o arresto mitótico e apoptose em células resistentes versus sensíveis.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de imagem reutilizável, aplicável a múltiplas classes de agentes antimitóticos e modelos celulares além do câncer de mama resistente ao docetaxel.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos ao associar a dinâmica dos microtúbulos ao fenótipo do fármaco em um contexto fisiológico.
- Valor Operacional: Oferece um protocolo confiável e padronizado para imagem em células vivas, exigindo equipamentos especializados mínimos além da microscopia de fluorescência.
- Valor Estratégico: Reduz a ambiguidade mecanicista na resistência aos agentes antimitóticos, permitindo desvios precoces de risco e maior eficiência no uso de capital em programas oncológicos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos a agentes antimitóticos mediante a identificação de mecanismos de resistência antes de estudos in vivo.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência, imagem de células vivas e biologia dos microtúbulos.
- Depende do acesso a um microscópio de fluorescência invertido com objetiva de imersão a óleo, câmara ambiental e software de desconvolução.
- Necessita padronização do semeador celular, expressão de tubulina-GFP e do tempo de tratamento com fármacos entre os experimentos.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes tipos celulares, marcadores de microtúbulos ou modalidades de imagem.
- Limitado pelos riscos de fotodesvanecimento, exigindo controle cuidadoso da intensidade de excitação e da duração da exposição, conforme observado no protocolo.
