Estabelecimento de células tetraplóides proliferativa de fibroblastos humanos não transformadas
8 de janeiro de 2017
Embora as células poliplóides proliferativas sejam necessárias para analisar a instabilidade cromossômica das células poliplóides, não é fácil criar essas células a partir de células humanas não transformadas. O presente relato descreve procedimentos relativamente simples para estabelecer células tetraplóides proliferativas livres de uma população diplóide de fibroblastos humanos normais.
O objetivo geral deste procedimento é estabelecer células tetraplóides proliferativas, livres de uma população diplóide, a partir de fibroblastos humanos normais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa de carcinogênese, como como as células aneuploides se desenvolvem nos estágios iniciais da carcinogênese. A principal vantagem dessa técnica é que as células tetraplóides proliferativas, livres de uma população diplóide, podem ser estabelecidas por procedimentos relativamente simples.
Enquanto algumas cepas se tornam completamente tetraplóides por tratamento simples com veneno de fuso, demecolcina, a maioria precisa ser tratada com o método de shake-off durante esse tratamento para emular uma população diplóide. Para iniciar a indução da tetraploidia sem o método de agitação, passe aproximadamente cinco vezes 10 para 1/5 das células cultivadas em um prato de 100 milímetros. Incube o prato em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 24 horas.
Depois disso, trate as células de crescimento exponencial com meio contendo 0,1 microgramas por mililitro DC. Incube em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por quatro dias. Em seguida, substitua o meio contendo DC por meio livre de drogas. Incubar em 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius até que a proliferação seja retomada.
Para induzir a tetraploidia utilizando o método de agitação, passe as células cultivadas em frascos T-75, certificando-se de que cada frasco contenha pelo menos uma vez 10 elevado a 1/6 das células. Incube os frascos em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, trate as células com meio contendo DC por 16 a 18 horas para detê-las na mitose, conforme descrito no protocolo de texto.
Após a incubação, verificar as células num balão ao microscópio de contraste de fase invertida. Em seguida, agite suavemente cada frasco para iniciar a coleta de células mitóticas frouxamente aderidas. Deve evitar-se o manuseamento descuidado, como agitação violenta ou toque na superfície do balão pela ponta da pipeta.
Não contamine as células mitóticas com células de interface aderidas. Lave suavemente os frascos com meio quente e transfira as células para tubos de centrífuga. Utilize um contador de células atômicas para contar o número da célula.
Após a contagem das células, centrifugue a 300 vezes g durante cinco minutos. Semeie novamente as células mitóticas coletadas em placas de cultura de 16 milímetros. Em seguida, trate as células plaqueadas com meio contendo 0,1 microgramas por mililitro DC. Incube em 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por três dias.
Depois disso, substitua o meio contendo DC por meio livre de drogas. Incube em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius até que a proliferação seja retomada. Para análise da ploidia do DNA, lave as células com PBS.
Em seguida, adicione uma solução contendo 0,05% de tripsina e 0,02% de EDTA às células. Incube por 10 minutos a 37 graus Celsius. Depois disso, transfira a suspensão da célula para um tubo de centrífuga.
E neutralize a tripsina adicionando meio contendo 10% de soro bovino fetal. Centrifugar as células em meio a 300 vezes g durante cinco minutos. Ressuspenda as células em cinco mililitros de PBS.
Em seguida, centrifugue novamente a 300 vezes g por cinco minutos. Em seguida, ressuspenda as células em um mililitro de PBS. Adicione quatro mililitros de etanol 100% gota a gota com a mistura.
Deixe a suspensão descansar em temperatura ambiente por 30 minutos para fixar as células. Em seguida, centrifugue as células em solução fixadora a 300 vezes g por cinco minutos. E ressuspenda as células em cinco mililitros de PBS.
Centrifugar a suspensão a 300 vezes g durante cinco minutos. Em seguida, trate as células com 475 microlitros de 0,5 miligramas por mililitro de solução de RNA. Adicione 25 microlitros de um miligrama por mililitro de solução de iodo propídio para corar as células.
E então misture. Deixe a suspensão descansar em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, use um citômetro de fluxo com um laser de 488 nanômetros e filtro de emissão de canal vermelho para analisar o conteúdo de DNA das células.
Analise também uma amostra de referência preparada a partir de células diplóides genuínas para avaliar a ploidia das células-alvo. Para começar, trate as células de crescimento exponencial com meio contendo 0,1 microgramas por mililitro DC por quatro horas para deter as células em metáfase. Depois disso, colha pelo menos cinco vezes 10 elevado a 1/5 de células por tripsinização.
Suspenda as células colhidas em meio contendo FBS. Centrifugar a suspensão a 300 vezes g durante cinco minutos. Em seguida, adicione cinco mililitros de uma solução de cloreto de potássio 0,075 molar.
Incube a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após a incubação completa, centrifugar a suspensão a 300 vezes g durante cinco minutos. Ressuspenda as células em cinco mililitros do fixador de Carnoy.
Em seguida, centrifugue a suspensão a 300 vezes g por cinco minutos. Em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 0,5 mililitros do fixador de Carnoy. Coloque 30 microlitros da suspensão da célula em uma lâmina de vidro.
Finalmente, core e analise as células por meio de contagens de cromossomos ou análise de cariótipo. Neste estudo, células tetraplóides proliferativas, livres de uma população diplóide, são cultivadas a partir de fibroblastos humanos normais. Embora algumas cepas celulares possam se tornar completamente tetraplóides pelo tratamento contínuo com DC, a maioria das células precisa ser tratada com o método de shake-off durante o tratamento DC para eliminar uma população diplóide.
Os resultados representativos para a indução de tetraploidia em três cepas de fibroblastos são mostrados aqui. A cepa TIG-1 torna-se quase inteiramente tetraplóide através do tratamento contínuo simples com DC. No entanto, este tratamento faz com que as cepas BJ e TIG-hT se tornem uma mistura de populações diplóides e tetrápodes. Portanto, o isolamento das células mitóticas pelo método shake-off é necessário durante o processo de tratamento.
Uma contagem de cromossomos é realizada nas células tetraplóides estabelecidas. Como pode ser visto, o número modal do cromossomo é 92 para as células TIG-1 e BJ e 91 para as células TIG-hT. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas semanas se for executada corretamente.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de agitar suavemente os frascos na etapa de agitação, para não causar contaminação das células mitóticas por células de interface aderentes.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo apresenta um método para estabelecer células tetraploides proliferativas a partir de fibroblastos humanos normais, que são essenciais para o estudo da instabilidade cromossômica. A técnica permite aos pesquisadores criar essas células sem uma população diplóide, facilitando investigações sobre a carcinogênese inicial.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Biologia Celular
- Pesquisa em Carcinogênese
- Estabilidade Cromossômica
Antecedentes
- Células poliploides proliferativas são cruciais para analisar a instabilidade cromossômica.
- Criar essas células a partir de células humanas não transformadas apresenta desafios.
- Compreender a aneuploidia é essencial no contexto do desenvolvimento do câncer.
- Este estudo tem como objetivo simplificar o processo de geração de células tetraploides.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer células tetraploides proliferativas livres de populações diplóides.
- Facilitar a pesquisa sobre o desenvolvimento de células aneuploides na carcinogênese.
- Fornecer um método simples para gerar essas células.
Métodos Utilizados
- Repicagem de células cultivadas em uma placa de 100 milímetros.
- Incubação das células em atmosfera com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 24 horas.
- Uso do veneno de fuso, demecolcina, para induzir tetraploidia.
- Emprego do método de desprendimento por agitação para certas linhagens, a fim de eliminar populações diplóides.
Resultados Principais
- Estabelecimento bem-sucedido de células tetraploides proliferativas.
- Demonstração da eficácia dos procedimentos simples descritos.
- Compreensão dos mecanismos do desenvolvimento de aneuploidia.
- Aplicações potenciais na pesquisa de câncer e estudos cromossômicos.
Conclusões
- O método fornece uma maneira confiável de gerar células tetraploides.
- Esta pesquisa aprimora a compreensão da instabilidade cromossômica.
- Estudos futuros podem aproveitar essas células para explorar ainda mais a carcinogênese.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de células tetraploides proliferativas a partir de fibroblastos humanos não transformados atende a uma necessidade crítica por modelos robustos de instabilidade cromossômica no início da carcinogênese. Essa capacidade permite a desmistificação mecanicista e a validação de alvos em vias implicadas na progressão de doenças impulsionadas pela aneuploidia. A simplicidade e reprodutibilidade do método apoiam pesquisas translacionais abrangentes e conferem confiança preditiva na seleção de modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação dos mecanismos de instabilidade cromossômica relevantes para a transformação oncogênica.
- Apóia a validação funcional de alvos envolvidos na poliploidia e na aneuploidia.
- Facilita a redução de riscos biológicos ao isolar populações tetraploides livres de contaminação diplóide.
- Melhora a confiabilidade preditiva para análise de vias downstream e triagem.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Oferece um sistema validado para avaliação quantitativa do conteúdo cromossômico por citometria de fluxo e cariótipo.
- Padroniza a geração de populações celulares tetraploides para o desenvolvimento reprodutível de ensaios.
- Permite avaliação confiável de compostos ou intervenções direcionadas a vias associadas à poliploidia.
- Apóia a escalabilidade e reutilização da plataforma em diversas linhagens de fibroblastos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para a doença no estudo dos eventos iniciais da carcinogênese.
- Garante a continuidade desde estudos mecanicistas em fase de descoberta até a validação pré-clínica de biomarcadores de instabilidade cromossômica.
- Reduz o risco no avanço de candidatos que visam processos oncológicos impulsionados pela poliploidia.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a geração e validação de modelos celulares tetraploides para pesquisas mecanicistas e translacionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre as origens e consequências da tetraploidia em células humanas.
- Triagem: Fornece medidas reprodutíveis e quantitativas do conteúdo de DNA para padronização de ensaios.
- Análises: Oferece saídas de citometria de fluxo e cariótipo para comparação robusta de populações celulares.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas mecanicistas iniciais ao alinhamento de biomarcadores pré-clínicos em estudos de instabilidade cromossômica.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo amplamente aplicável para gerar modelos policlones em diversos programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de instabilidade cromossômica.
- Valor Operacional: Agiliza a padronização e a reprodutibilidade da geração de células tetraploides.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir/não prosseguir e o avanço eficiente em termos de capital de programas de oncologia.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos e modelos em etapas iniciais de descoberta.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura de células, citometria de fluxo e análise de cariótipo.
- Exige acesso à demecolcina, contadores de células e instrumentação de citometria.
- Exige padronização cuidadosa das etapas de coleta por agitação e manipulação celular para evitar contaminação.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes linhagens de fibroblastos ou tipos celulares.
- As limitações potenciais incluem respostas específicas à demecolcina conforme a linhagem e variabilidade técnica no isolamento de células em mitose.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:51
Induction and Establishment of Tetraploid Cells from Diploid Fibroblasts without the Shake-off Method
1:52
Induction and Establishment of Tetraploid Cells from Diploid Fibroblasts with the Shake-off Method
4:01
Examination of DNA Ploidy
6:30
Preparation for Chromosome Counts and Karyotype Analysis
8:04
Results: Establishment of Proliferative Tetraploid Cells
9:28
Conclusion
