Reconhecimento Molecular de engenharia com Polymers Bio-mimético em únicos Walled nanotubos de carbono

O objetivo geral deste procedimento é preparar nanotubos de carbono fluorescentes de parede única no infravermelho próximo para sensoriamento molecular que foram funcionalizados usando polímeros biomiméticos. Esses nanossensores podem permitir imagens resolvidas no tempo em tecidos vivos. Por exemplo, eles podem ser usados para detectar dopamina no cérebro.

A principal vantagem desses sensores é sua fluorescência inerente ao infravermelho próximo, que permite imagens mais profundas do tecido. Os sensores sintéticos permitem a detecção de moléculas sem elementos naturais de reconhecimento molecular, tornando este método genérico de desenvolvimento de sensores especialmente útil para a detecção de pequenas moléculas. Para preparar uma suspensão de ácido nucleico de SWNTs, primeiro dissolva os ácidos nucléicos em cloreto de sódio 0,1 molar até uma concentração de 100 miligramas por mililitro.

Em uma capela de exaustão, remova a eletricidade estática da espátula descartável, dos tubos de microcentrífuga e do estoque SWMT, usando uma pistola antiestática. Em seguida, adicione 20 microlitros da solução de ácido nucleico a 980 microlitros de cloreto de sódio 0,1 molar. Em seguida, adicione 1 miligrama de SWNTs lavados à solução de ácido nucleico resultante antes de sonicar a mistura.

Posicionar a ponta da sonda durante a sonicação é fundamental. Se ocorrer formação de espuma, reposicione a ponta da sonda e tente diminuir a amplitude. Como alternativa, você pode tentar pulsos de sonicação ou sonicação de banho se a suspensão permanecer ruim.

Usando um ultrassônico com ponta de 3 milímetros de diâmetro, sonicar a solução por 10 minutos a 40% de amplitude em banho de gelo. Centrifugar a solução de DNA SWNT duas vezes durante 90 minutos a 16,100 xg. Colete e guarde o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet contendo feixes e agregados de nanotubos de carbono.

Rejeitar o pellet em conformidade com os procedimentos institucionais aplicáveis aos resíduos perigosos adequados para os nanomateriais. Medir a absorvância da solução a 632 nanómetros utilizando um espectrofotómetro UV-vis para determinar a concentração aproximada de SWNT em suspensão, de acordo com a lei de Lambert-Beer, e o factor de diluição adequado. Para suspensões de polímero anfifílico, primeiro remova a eletricidade estática da espátula descartável, tubos de microcentrífuga e estoque SWNT.

Em uma capela de exaustão, adicione cinco miligramas de SWNTs a cinco mililitros de solução de colato de sódio a 2%. Usando um ultrassônico com ponta de seis milímetros de diâmetro, sonicar a solução por uma hora a 40% de amplitude em banho de gelo. Centrifugar a amostra a 150 000 xg durante quatro horas com uma ultracentrífuga, antes de recolher cuidadosamente o sobrenadante.

Em seguida, dissolva 1% do peso do polímero anfifílico na solução scSWNT. Em seguida, dialise a solução de polímero scSWNT usando uma membrana de diálise de 3,5 kilodalton contra um litro de água deionizada ou tampão por cinco dias. Troque a água ou o tampão na segunda hora e na quarta hora.

Meça a absorbância da solução a 632 nanômetros usando um espectrofotômetro UV-Vis para determinar a concentração aproximada de SWNTs suspensos. Para preparar as lâminas revestidas com biotina BSA, limpe uma lâmina de microscópio e uma lamínula de 0,17 milímetro com água deionizada, seguida de metanol, acetona e um enxágue final de água deionizada. Crie canais colocando vários pedaços de fita dupla face com aproximadamente cinco milímetros de distância na lâmina limpa do microscópio.

Sele os canais pegando uma lamínula de vidro longa e pressionando-a na parte superior da fita dupla face. Certifique-se de centralizá-lo na lâmina do microscópio para que as bordas da lamínula e da lâmina não fiquem niveladas. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução estoque de BSA-biotina a 900 microlitros de 1x tampão Tris até uma concentração final de um miligrama por mililitro.

Flua 50 microlitros da solução de BSA-biotina para o canal, pipetando a solução em uma extremidade e absorvendo a solução na outra extremidade usando um lenço de papel. Depois de incubar a solução por cinco minutos, faça três a cinco lavagens com 50 microlitros de cloreto de sódio 0,1 molar. Em seguida, dilua 40 microlitros de cinco miligramas por mililitros de solução estoque de NAV em 960 microlitros de 1x tampão Tris, até uma concentração final de 0,2 miligramas por mililitro.

Flua 50 microlitros da solução de NAV para o canal, pipetando a solução em uma extremidade e absorvendo a solução na outra extremidade usando um lenço de papel. Depois de incubar a lâmina por dois a cinco minutos, faça três a cinco lavagens com 50 microlitros de cloreto de sódio 0,1 molar. Em seguida, dilua as soluções de estoque de SWNTs suspensos e tampão de imagem a uma concentração de 1 a 10 miligramas por litro.

Flua 50 microlitros desta solução para o canal e incube por cinco minutos. Enxágue suavemente o excesso de SWNTs usando 50 microlitros de tampão de imagem. Para medir a resposta reversível dos DNA-SWNTs GT15 à dopamina, primeiro monte os canais revestidos com sensor no microscópio de fluorescência stage.

Traga os canais em foco usando uma objetiva de óleo 100X e uma câmera de arseneto de índio e gálio. Em seguida, adicione 50 microlitros de solução de dopamina 100 micromolar em solução salina tamponada com fosfato ao canal de fluxo e registre a mudança na intensidade da fluorescência. Lave a solução de dopamina usando solução salina tamponada com fosfato e observe a mudança na fluorescência dos sensores SWNT individuais.

Para realizar a triagem da placa do poço para a resposta do analito de SWNTs de polímeros biomiméticos, pipete volumes iguais do sensor SWNT suspenso em cada poço. Use volume suficiente para cobrir o fundo do poço uniformemente. Em seguida, pipeta analitos da biblioteca de triagem para as placas do poço.

Preparar cada analito em triplicata para ter em conta a variação potencial de poço para poço e flutuações de intensidade de excitação ou temperatura. Levante o objetivo enquanto monitora os espectros de emissões usando o espectrômetro e a matriz de arseneto de índio e gálio. A posição ideal da objetiva colocará o plano focal aproximadamente no meio do volume da amostra no poço, que deve corresponder a um máximo na intensidade medida.

Para cada poço de amostra, registre uma exposição de um a 10 segundos para coletar um espectro. Comparar os espectros de emissões de cada alvéolo com um controlo que contenha apenas SWNTs sem analito adicional, a fim de quantificar a resposta de fluorescência. O espectro de absorbância dos sensores de nanotubos de DNA GT15 mostra vários picos correspondentes a nanotubos de carbono bem dispersos de diferentes quiralidades.

A fluorescência do infravermelho próximo dos sensores de nanotubos de DNA GT15 é mostrada. Curiosamente, a intensidade da fluorescência aproximadamente dobra em resposta à dopamina. Nesta figura, a microscopia de fluorescência no infravermelho próximo revela sensores únicos de nanotubos de DNA GT15 imobilizados na superfície de uma lamínula de vidro.

No futuro, é importante testar o sensor para uso in vivo, por exemplo, expandindo a biblioteca de analitos para incluir concorrentes moleculares, testando a linearidade da resposta no regime de concentração biologicamente relevante e também testando a reversibilidade. Uma vez dominada, essa abordagem pode ser usada para fazer uma biblioteca de diferentes sensores sintéticos a partir de moléculas sem elementos de reconhecimento molecular conhecidos.