Name: Reconhecimento Molecular de engenharia com Polymers Bio-mimético em únicos Walled nanotubos de carbono (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprenda a preparar nanotubos de carbono de parede única funcionalizados com polímeros anfifílicos para detecção molecular. Este método permite imagem em tecido vivo usando fluorescência no infravermelho próximo.

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Este trabalho foi apoiado pelo Burroughs Wellcome Fund Career Award na Scientific Interface (CASI), uma bolsa da Simons Foundation e uma bolsa de jovem investigador da Brain and Behavior Research Foundation.

Cuidado: Por favor, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (SDS) antes do uso. Nanomateriais podem ter riscos adicionais em comparação com o seu homólogo material a granel. Use todas as práticas de segurança adequadas, incluindo controles de engenharia (coifa, do cerco de ruído) e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, óculos de proteção, jaleco, calça de corpo inteiro, fechou-toe sapatos). 1. Preparação do Tampão, surfactante e Polymer Solutions <ol><li> Preparação da solução de 100 mM de NaCl <ol><li> Dissolve-se 584 mg de NaCl em 80 ml de água desionizada. Adiciona-se água desionizada para levar o volume total a 100 mL. </li></ol></li><li> Preparação de sulfato de dodecilo de sódio 3% solução (SDS) <ol><li> Dissolve-se 3 g de SDS em 80 ml de água desionizada. Adiciona-se água desionizada para levar o volume total a 100 mL. </li></ol></li><li> Preparação de 2% de colato de sódio solução (SC) <ol><li> Dissolve-se 2 g de SODio colato hidrato em 80 ml de água desionizada. Adiciona-se água desionizada para levar o volume total a 100 mL. </li></ol></li><li> Preparação de tampão de imagiologia (1x Tris: Tris 20 mM, NaCl 100 mM) <ol><li> Dissolve-se 22,23 g de base Tris e 58,44 g de NaCl em 500 mL de água desionizada, utilizando uma barra de agitação magnética e a placa. </li><li> Cuidadosamente adicionar HCl concentrado até um pH de 8,1 seja alcançado. </li><li> Adiciona-se água desionizada para atingir um volume final de 1 L. </li></ol></li><li> Síntese de polímero RITC-PEG-RITC <ol><li> Dissolver amina polietileno glicol difunctionalized (PEG) (5 kDa ou de 20 kDa, 0,1 mol / L) e isotiocianato de rodamina (RITC, 0,2 mol / L) em 1 mL de uma mistura 1: 1 de diclorometano e dimetilformamida (DMF). </li><li> Adicionar 0,2 mol / L de N, N-di-isopropiletilamina (DIEA). </li><li> Após 3 h, precipitar com 10 x o volume de éter dietílico seguida por filtração sob vácuo. </li><li> Dissolver novamente em DMF e repetir Follo precipitação éterconduzido por filtração a vácuo. NOTA: Outras moléculas modificadas isotiocianato (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína, ITCF) podem ser ligados a PEG ou outros polímeros de amina modificada, utilizando um método semelhante. </li></ol></li><li> Preparação de DNA-peguilado (PEG-ADN) <ol><li> Combinar 100 mL de solução de cloridrato de fosfina (TCEP) (0,5 M, pH 7,0) com 44,9 mL de Tris (2-carboxietil) 5&#39;-tiol-DNA modificado (1 mg / 10 mL em NaCl a 0,1 M) e adicionar 4,855 mL de de água desionizada. </li><li> Agita-se durante 1 h. </li><li> Dissolve-se 500 mg de metoxipolietilenoglicol maleimida em 5 mL de solução salina tamponada com fosfato. </li><li> Combinar as soluções de ADN e PEG (10 mL no total) e agitar durante 24 h. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de uma única carbono vítreo suspensões (SWNTs) <ol><li> Lavagem de nanotubos de carbono para remover o catalisador e impurezas. <ol><li> Adicionar 200-300 mg de nanotubos de carbono que não foram lavadas para um tubo de centrífuga de plástico Containing 45 mL de água desionizada. </li><li> Vortex a solução durante 2 min e sonicado utilizando um sonicador de banho durante 5 min. Note-se que as configurações sonicador variar de instrumento para instrumento, de modo a verificar que a densidade óptica da solução SWNT aumenta (isto é, torna-se preto) para assegurar que os nanotubos de carbono estão a ser dispersas. </li><li> Centrifugar a solução durante 20 min a 16100 xg e descartar o sobrenadante. </li><li> Adicionar cerca de 45 mL de água deionizada fresco. </li><li> Repita os passos 2.1.2-2.1.4 até 8 vezes. </li><li> Remover o máximo de água possível de ser cuidado para não perturbar SWNTs peletizadas e permitir SWNT pellet secar ao ar. </li></ol></li><li> Suspensões de ácidos nucleicos de nanotubos <ol><li> Dissolve-se os ácidos nucleicos (NA) em NaCl 0,1 M para uma concentração de 100 mg / mL. </li><li> Remover a eletricidade estática de espátula descartável, microtubos e estoque SWNT usando uma arma anti-estático. Numa hotte, adicionar 20 ul da solução de NA para 980 ul de 00,1 M de NaCl, seguida pela adição de 1 mg de nanotubos de carbono. </li><li> Utilizando uma ponta ultrasonicator com 3 mm de diâmetro, sonicar a solução durante 10 minutos a 40% da amplitude em um banho de gelo. </li><li> Centrifugar a solução de DNA-SWNT duas vezes durante 90 min a 16.100 x g. Se estiver usando PEG-DNA, purificar o excesso e DNA que não reagiu e PEG utilizando um spin-filtro de 100 kDa. Adicionar o suficiente PBS para preencher o spin-filtro e girar a 9.300 xg durante 1,5 min, Repita este passo de lavagem 3 vezes. </li><li> Recolher e guardar o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet contendo pacotes e agregados CNT. Descartar o sedimento em conformidade com os procedimentos de resíduos perigosos institucionais apropriados para os nanomateriais. </li><li> Medir a absorção solução a 632 nm usando um UV / Vis para determinar a concentração aproximada de SWNTs em suspensão usando ε = 0,036 L / cm · mg de acordo com a lei de Lambert-Beer e do fator de diluição. </li></ol></li><li> Suspensões polímero anfifílicode SWNTs <ol><li> Remover a eletricidade estática de espátula descartável, tubos de centrífuga de micro e estoque SWNT. Numa hotte, adicionar 5 mg nanotubos de carbono a 5 ml de solução de SC a 2% (em alternativa, a solução de SDS pode ser utilizado). </li><li> Usando um ultrasonicator com ponta de 6 mm de diâmetro, sonicar a solução durante 1 h a 40% da amplitude em um banho de gelo. </li><li> amostra centrifugar a 150.000 xg durante 4 h usando uma ultracentrífuga e recolher cuidadosamente sobrenadante. </li><li> Dissolve-se 1% em peso de polímero anfifílico (por exemplo, RITC-PEG-RITC) em solução SC-SWNT. </li><li> Dializar a solução de polímero-SC-SWNT usando uma membrana de diálise 3.5 kDa contra 1 litro de água desionizada ou tampão durante 5 dias. Mudar a água ou tampão após 2 horas e horas 4. Uma membrana de diálise maior pode ser usada, desde que permite a remoção do surfactante de escolha, mas a retenção de ambos os SWNT e polímero anfifílico. </li><li> Medir a absorvância solução a 632 nm usando um UV / Vis para determinarconcentração aproximada de SWNTs em suspensão usando ε = 0,036 L / cm * mg de acordo com a lei de Lambert-Beer e do fator de diluição. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de Superfície Imobilizado Sensores SWNT <ol><li> Preparação de BSA-biotina e soluções de neutravidina <ol><li> Dissolve-se 10 mg de liofilizado de BSA-biotina em 1 ml de água desionizada para perfazer uma solução 10 mg / ml de caldo e armazenar a 4 ° C. </li><li> Dissolve-se 10 mg de proteína NeutrAvidin (NAV, desglicosilada proteína avidina) em 2 mL de água desionizada para produzir uma solução stock de 5 mg / mL. alíquotas armazenar a -20 ° C. alíquotas descongelados pode ser mantido durante vários dias a 4 ° C. </li></ol></li><li> Prepare BSA-biotina lâminas de microscópio revestidas <ol><li> Uma lâmina de microscópio limpa e 0,17 milímetros de vidro de cobertura (ou, conforme apropriado para o objectivo microscópio) com água desionizada, seguido de metanol, acetona e um enxaguamento final de água desionizada. </li><li&gt; Criar canais, colocando vários pedaços de fita dupla face aproximadamente 5 mm de distância da lâmina de microscópio limpa. Selar os canais, tendo uma lamela de vidro longa e pressionando-a para a parte superior da fita de dupla face. Certifique-se de que está centrado na lâmina de microscópio para que as bordas da lamínula e slide não estão alinhadas. </li><li> Adicionar 100 uL de solução de reserva de BSA-biotina para 900 ul de tampão de 1x Tris a uma concentração final de 1 mg / mL. </li><li> De fluxo 50 mL da solução de BSA-biotina para o canal pipetando a solução em uma extremidade e que a absorção de distância solução para o outro utilizando um tecido. Incubar durante 5 minutos, seguido por 3-5 rubores com 50 uL de 0,1 M de NaCl. </li><li> Diluir 40 uL de 5 mg de estoque / mL NAV em 960 ul de tampão 1x Tris a uma concentração final de 0,2 mg / mL. </li><li> Fluxo de 50 mL da solução NAV para o canal pipetando a solução em uma extremidade e que a absorção de distância solução para o outro utilizando um tecido. Incubar por 2-5 minutosseguido por 3-5 rubores com 50 ul de 0,1 M de NaCl. </li><li> Dilui-se as soluções concentradas de nanotubos de carbono em suspensão em tampão de imagem para uma concentração de 1-10 mg / L e de fluxo 50 mL da solução para dentro do canal e incubar durante 5 min. </li><li> Suavemente enxaguar nanotubos de carbono em excesso, utilizando 50 ul de tampão de imagem. </li></ol></li><li> Preparação de APTES silanizada lâminas de microscópio NOTA: APTES lâminas silanizadas permitir imobilizar uma forma de nanotubos de carbono envolvido por ADN carregadas negativamente para a superfície de um substrato de vidro. <ol><li> Prepara-se uma solução a 10% de (3-aminopropil) trietoxissilano (APTES) em etanol. </li><li> Utilizando canais feitos usando as etapas descritas em 3.2.2, o fluxo em 100 ul de tampão de 1x Tris. </li><li> Lave o canal com APTES solução e incubar durante 5 min. Lave com tampão 1x Tris. </li><li> Dilui-se as soluções concentradas de ADN-nanotubos de carbono em suspensão em tampão de imagem para uma concentração de 1-10 mg / fluxo de terra 50 mL da solução para dentro do canal e incubComeram por 5 min. </li><li> Suavemente enxaguar nanotubos de carbono em excesso, utilizando 50 ul de tampão de imagem. </li></ol></li></ol> 4. espectroscopia de fluorescência e microscopia de SWNT Sensores <ol><li> NIR microscopia de fluorescência <ol><li> Realizar imagem de SWNTs imobilizadas na superfície usando laser de excitação e um microscópio invertido equipado com um conjunto de sensores InGaAs para a imagem latente. </li><li> Direcionar o feixe de laser para entrar no porto de iluminação traseira de um microscópio invertido usando espelhos ajustáveis ​​montagens cinemáticos e um par de íris pós-montada definidas para a altura da porta. Certifique-se o feixe é nível e em linha reta, confirmando que passa através de ambas as íris quando colocado entre espelhos subsequentes e antes de entrar no porto de iluminação. Se necessário, ajuste a altura do feixe usando um conjunto periscópio. Retire quaisquer filtros de calor passe curto na porta iluminação que iria atenuar o feixe. </li><li> Insira um cubo de filtro apropriado no microscópiopara refletir a luz de excitação para o objetivo e recolher luz de emissão. Este consiste, tipicamente, um filtro de passe longo dicróico com um corte acima do comprimento de onda de excitação, (por exemplo, 750 LP) e uma emissão filtro de passagem longa (por exemplo, 850 LP) para minimizar ainda mais a luz de excitação espalhada de bater o sensor. Além disso, o filtro de emissão pode ser escolhida para ser selectiva para a emissão de nanotubos de carbono de uma quiralidade específica. </li><li> Realizar ajustes finos para o alinhamento do feixe através da inserção de um cubo de alinhamento apropriado substituindo o objetivo com dois discos offset, fosco contendo 1 pinholes mm. Alinhar o feixe para o centro de ambos os discos de alinhamento inferior e superior. </li><li> Anexar uma matriz de sensores 2D InGaAs à porta de imagiologia lado do microscópio usando um adaptador apropriado e uma lente de 0,5X, se necessário, para acomodar o tamanho do sensor. </li><li> Usando uma objectiva de imersão em óleo de 100X (1,4 NA), aplique óleo de imersão livre de fluorescência e colocar a imobilização comamostra SWNT lized para o palco microscópio. </li><li> Elevar o objetivo até que os contatos de óleo na parte inferior da tampa de vidro (# 1.5, 170 espessura mm). Fazer ajustes para o colar objetivo se necessário, para as condições de imagem, por exemplo, temperatura, espessura de vidro, etc. </li><li> aumentar lentamente o objectivo com a fonte de excitação e de monitorizar o sinal de fluorescência da câmara de InGaAs. A intensidade de fluorescência deve aumentar gradualmente à medida que se aproxima o plano focal da superfície e os sensores imobilizadas entrar em foco. </li></ol></li><li> Nir espectroscopia de fluorescência NOTA: espectroscopia de fluorescência pode ser realizada utilizando a mesma configuração de microscópio, mas por dirigir a luz recolhida para fora do corpo do microscópio e para um espectrómetro de InGaAs e detector de arranjo linear. <ol><li> Usando montagens cinemáticos e espelhos classificados para NIR, direcionar o caminho da luz para a fenda de entrada do espectrômetro. Focalizar a luz para baixo a um point para a entrada de fenda utilizando uma lente de focagem (por exemplo, plano-convexa, F = 150 mm). Este alinhamento é realizado por atenuar a potência do laser &lt;1 mW e substituindo a objetiva do microscópio com um &quot;espelho 1 e utilizando um cubo de filtro 50/50 feixe de divisão. A luz de excitação, então, deixar o corpo do microscópio através da porta de saída e pode ser utilizada para ajustar os espelhos e da lente para focar o feixe para a fenda de entrada. </li><li> Depois de substituir a objetiva do microscópio e filtro de passagem longa, coloque uma placa bem para o palco e gravar o espectro de uma amostra em foco usando o espectrômetro e matriz InGaAs. </li></ol></li><li> Medir a resposta reversível de (GT) 15 ADN nanotubos à dopamina <ol><li> sensor de Mount canais revestidos para o palco microscópio e pôr em foco usando uma objetiva de óleo de 100X e câmera InGaAs. Adicionar 50 uL de 100 uM solução dopamina em tampão fosfato salino (PBS) para o canal de escoamento e fichaa mudança na intensidade de fluorescência. </li><li> Lavar a solução de dopamina utilizando solução salina tamponada com fosfato e observar a alteração na fluorescência dos sensores SWNT individuais. </li></ol></li><li> Rastreio bem-placa para a resposta dos sensores de nanotubos de carbono analito NOTA: Rastreio de diferentes analitos pode ser realizada utilizando uma placa transparente bem controlada usando uma platina motorizada. Uma placa de ideal é transparente para visível e IR e tem paredes laterais pretas para minimizar a interferência entre os poços. <ol><li> Volumes iguais de pipeta de sensor de SWNT suspensa (por exemplo, 5 mg / L de concentração) para cada poço, o suficiente para cobrir o fundo do poço de modo uniforme, tipicamente&gt; 100 uL de uma placa de 96 poços e&gt; 30? L para uma placa de 384 poços . </li><li> Analitos pipeta (por exemplo, 2 ml, 100 fiM de volume final) a partir de rastreio de bibliotecas para as placas de poços. Prepare cada substância, em triplicado para explicar potencial bem-bem variação, Fluctuatiões de intensidade de excitação, ou a temperatura. </li><li> Elevar o objectivo (por exemplo, 20X achroplan, 0,45 NA), enquanto monitora os espectros de emissão usando o espectrômetro e matriz InGaAs. posição ideal do objectivo irá colocar o plano focal, aproximadamente a meio do volume da amostra no poço, que deve corresponder a um máximo de intensidade medido. </li><li> Para cada poço de amostra, registrar a exposição de um 1-10 s para coletar um espectro. </li><li> Comparar os espectros de emissão para cada poço a um controlo contendo apenas nanotubos de carbono sem analito adicional para quantificar a resposta de fluorescência. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Nanotubos de carbono são prontamente suspenso em solução aquosa através de sonicação directa com SDS ou ADNcs, como indicado por um aumento na densidade óptica proporcionado pela dispersão coloidal do híbrido SWNT-polímero resultante. SDS e ssDNA dispersa e solubiliza feixes de nanotubos de carbono por adsorção na superfície do SWNT através de interacções hidrofóbicas ou pi-pi. Além disso, outros polímeros, tais como o ADN genómico, os polímeros anfifílicos, polímeros conjugados e lípidos, pode ser adsorvido sobre a sup...

-walled nanotubos de carbono (nanotubos de carbono) são atomicamente finas camadas de átomos de carbono enroladas em cilindros longos e finos que apresentam propriedades eletrônicas e ópticas únicas. 1 Essas propriedades incluem uma band-gap produção de infravermelho próximo (NIR) de emissão de fluorescência através de recombinação éxciton que é altamente sensível ao seu ambiente local. A emissão de NIR de nanotubos de carbono cai dentro da janela de infravermelho próximo, em que a profundidade de penetração da luz é máxima para o tecido biológico. 2,3 Além disso, nanotubos de carbono exibem várias características únicas atípicas em contraste com fluoróforos orgânicos: SWNT exibem um grande deslocamento de Stokes, não photobleach, e não piscar. 4 Recentemente, explorando estas características tem levado ao desenvolvimento de uma variedade de sensores moleculares novos com aplicações em biologia. 5,6 não modificado, no entanto, nanotubos de carbono são insolúveis em água, e a obtenção de suspensões de nanotubos individuais pode ser um desafio. 7,8 Bundling e agregação de SWNTs em solução pode ofuscar sua fluorescência band-gap, 2 tornando-os inadequados para aplicações de detecção. Dispersar os nanotubos de carbono individuais em solução aquosa requer modificando sua superfície para evitar a agregação orientado a hidrofobia. 9 Enquanto modificação covalente pode tornar nanotubos de carbono solúvel em água, 10, bem como conferir a química de ligação específica, os locais de defeitos na estrutura SWNT reduzir ou diminuir a sua emissão de fluorescência. Em vez disso, SWNT funcionalização pode ser realizado usando agentes tensioactivos, lípidos, polímeros e ADN de 9,11 - 13, que adsorvem a superfície do nanotubo através de interacções hidrofóbicas e de empilhamento pi-pi. O ambiente circundante química resultante nanotubos de carbono funcionalizado de superfície é referido como a sua fase de corona. Perturbações para a fase de corona pode ter um grande impacto sobre excitons que viajam na superfície do nanotubo, fazendo com modulações de SWNT fluorescence emissões. É esta relação sensível entre a fase de corona e de fluorescência SWNT que podem ser exploradas para desenvolver novos sensores moleculares através da incorporação de modalidades de ligação específicos para a área de superfície grande da SWNT. Perturbações para a fase de corona SWNT sobre analito de ligação pode conduzir a alterações no ambiente dieléctrico local, transferência de carga, ou introduzir defeitos de rede, todos os quais podem modular a emissão de fluorescência dos nanotubos de carbono para servir como um mecanismo de transdução de sinal. 14 Esta abordagem é utilizada no desenvolvimento de novos sensores fluorescentes para a detecção de muitas classes diferentes de moléculas de ADN, incluindo, glicose 15,16 e 17 de pequenas moléculas, tais como ATP, 18 espécies de oxigénio reactivas e 19 óxido nítrico. 20,21 No entanto, estas abordagens estão limitadas na medida em que dependem da existência de uma modalidade de ligação conhecida para o analito alvo. Recentemente, um app mais genéricobarata para a concepção de sensores fluorescentes foi desenvolvido usando nanotubos de carbono não-covalentemente funcionalizados com heteropolímeros anfifílicos, fosfolípidos e ácidos polinucleicos. Estas moléculas de adsorver a superfícies de nanotubos de carbono para produzir suspensões altamente estáveis de SWNTs individuais 22 - 25 com fases corona únicas que podem se ligam especificamente proteínas 26,27 ou pequenas moléculas, incluindo o neurotransmissor dopamina. 28-30 Engenharia da fase de corona para dispersar SWNTs e especificamente analitos alvo de ligação é referido reconhecimento molecular de fase como corona (CoPhMoRe). 28 O tamanho pequeno, baixa toxicidade, alta estabilidade e unbleaching fluorescência NIR de sensores CoPhMoRe SWNT torná-los excelentes candidatos para detecção in vivo para medições resolvidas no tempo prolongados. 6 trabalho recente mostrou suas aplicações em tecidos de plantas para a detecção óptica de espécies de nitrogênio e de oxigênio reativo. 31Uma aplicação particularmente interessante para sensores CoPhMoRe SWNT é o potencial para a detecção de etiqueta livre de neurotransmissores, tais como dopamina, in vivo, onde outras técnicas, tais como a detecção electroquímica ou imuno-histoquímica, sofrem de uma falta de resolução espacial, resolução temporal, e especificidade. Projetando e descobrindo sensores CoPhMoRe SWNT até agora tem sido restringido pelo tamanho e química diversidade da biblioteca dispersante, limitando a probabilidade de encontrar um sensor para um alvo particular. Até à data, os investigadores apenas arranhamos a superfície do conjugado disponível, co-block, biológicos e polímeros biomiméticos que poderiam servir como dispersantes funcionalmente ativos para sensores SWNT. Aqui, apresentamos métodos diferentes, tanto para dispersar SWNTs e caracterizar sua fluorescência para triagem de alto rendimento e para a análise do sensor SWNT única. Especificamente, nós descrevem o procedimento para nanotubos de carbono de revestimento com oligom ácido polinucleicoers usando sonicação directo, bem como a forma de funcionalizar SWNT com polímeros anfifílicos através da troca de surfactante por diálise. Usamos (GT) 15 -ADN e polietileno glicol funcionalizado com rodamina isotiocianato (RITC-PEG-RITC) como exemplos. Nós demonstramos a utilização de (GT) 15 -ADN nanotubos de carbono como um sensor para a detecção CoPhMoRe de dopamina. Por fim, descrevem os procedimentos para a realização de medições do sensor molécula de solteiro, que podem ser utilizados para a caracterização ou simples detecção molécula.

<table><tbody><tr><td>cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>dodecil sulfato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>hidrato de colato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445</td><td></td></tr><tr><td>base tris (base Trizma)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>ácido clorídrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Amina-PEG-amina, NH2-PEG-NH2</td><td>Nanocs Inc</td><td>PG2-AM-5k</td><td></td></tr><tr><td>isotiocianato de rodamina B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>283924</td><td></td></tr><tr><td>isotiocianato de fluoresceína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7250</td><td></td></tr><tr><td>diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>676853</td><td></td></tr><tr><td>dimetilformamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td></td></tr><tr><td>éter dietílico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>673811</td><td></td></tr><tr><td>cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNA modificado com 5'-tiol&nbsp;</td><td>Tecnologias</td><td></td><td></td>integradas de</tr><tr><td>DNA metoxipolietilenoglicol maleimida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63187</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de rotação de 100 kDa</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPCO Nanotubos de carbono de parede única super purificados</td><td>Integris</td><td>HiPco SuperPurified</td><td></td></tr><tr><td>fosfato tamponado solução salina</td><td>Pistola antiestática Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Milty</td><td>Milty Zerostat 3</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>ultra sonicator</td><td>Cole Parmer</td><td>CV18</td><td></td></tr><tr><td>de diálise</td><td>Thermo scientific</td><td>Slide-A-Lyzer G2 87722</td><td></td></tr><tr><td>BSA-biotina</td><td>Thermo scientific</td><td>29130</td><td></td></tr><tr><td>Proteína neutravidina</td><td>Thermo scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>(3-Aminopropil) trietoxissilano (APTES)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>microscópio invertido</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td></td></tr><tr><td>espelhos cinemáticos</td><td>ThorLabs</td><td>KM200-E03</td><td></td></tr><tr><td>periscópio</td><td>ThorLabs</td><td>RS99</td><td></td></tr><tr><td>óleo de imersão</td><td>Zeiss</td><td>Immersol 518f</td><td></td></tr><tr><td>100X objetivo</td><td>Zeiss</td><td>Óleo plano-apocromático 100X, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000</td><td></td></tr><tr><td>20X objetiva</td><td>Zeiss</td><td>N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>vidro de cobertura</td><td>Healthrow Scientific</td><td>HS159879H</td><td></td></tr><tr><td>cloridrato de dopamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>câmera infravermelha da disposição 2D</td><td>Princeton Instruments</td><td>NIRvana</td><td></td></tr><tr><td>disposição infravermelha do sensor 1D</td><td>Princeton Instruments</td><td>PyLoN IR</td><td></td></tr><tr><td>nIR espectrógrafo</td> Lente planoconvexa de <td>Princeton Instruments</td><td>SCT-320</td><td></td></tr> Placas do poço <tr><td></td><td>de ThorLabs</td><td>LA1384</td><td></td></tr><tr><td>(parte inferior de vidro)</td> <td>Corning</td><td>4580</td><td></td></tr></tbody></table>

reconhecimento molecular de engenharia com polymers bio-mimético em únicos walled nanotubos de carbono

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Os nanotubos de carbono semicondutores de parede única (SWNTs) são uma classe de nanomateriais opticamente ativos que fluorescem no infravermelho próximo, coincidindo com a janela óptica onde as amostras biológicas são mais transparentes. Aqui, descrevemos técnicas para adsorver polímeros anfifílicos e ácidos polinucléicos na superfície de SWNTs para projetar suas fases corona e criar novos sensores moleculares para pequenas moléculas e proteínas. Esses sensores SWNT funcionalizados são biocompatíveis e estáveis. Os polímeros são adsorvidos na superfície do nanotubo por sonicação direta de SWNTs e polímero ou pela suspensão de SWNTs usando um surfactante seguido de diálise com polímero. A emissão de fluorescência, estabilidade e resposta desses sensores aos analitos alvo são confirmadas usando espectroscopia de absorbância e fluorescência no infravermelho próximo. Além disso, demonstramos a imobilização da superfície dos sensores em lâminas de vidro para permitir que a microscopia de fluorescência de molécula única caracterize a adsorção do polímero e a cinética de ligação do analito.

Nanotubos de carbono foram suspensas em solução aquosa usando ambos os surfactantes e polímeros anfifílicos por sonicação directa e por troca de diálise. A Figura 1 mostra nanotubos de carbono, cresceu utilizando o método catalisada carbonilo de ferro (HiPCO), suspenso usando SC, RITC-PEF20-RITC e (GT) 15 -DNA. A densidade óptica de uma nanotubos de carbono com SDS (ou polímero) aumenta dramaticamente após sonicação e diminui após a remoção de agregados e cont...

Apresentamos um protocolo para engenharia da fase corona de nanotubos de carbono fluorescentes de parede única (SWNTs) usando polímeros anfifílicos e DNA para desenvolver sensores para alvos moleculares sem elementos de reconhecimento conhecidos.

Reconhecimento Molecular de engenharia com Polymers Bio-mimético em únicos Walled nanotubos de carbono

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar nanotubos de carbono fluorescentes de parede única no infravermelho próximo para sensoriamento molecular que foram funcionalizados usando polímeros biomiméticos. Esses nanossensores podem permitir imagens resolvidas no tempo em tecidos vivos. Por exemplo, eles podem ser usados para detectar dopamina no cérebro.A principal vantagem desses sensores é sua fluorescência inerente ao infravermelho próximo, que permite imagens mais profundas do tecido. Os sensores sintéticos permitem a detecção de moléculas sem elementos naturais de reconhecimento molecular, tornando este método genérico de desenvolvimento de sensores especialmente útil para a detecção de pequenas moléculas. Para preparar uma suspensão de ácido nucleico de SWNTs, primeiro dissolva os ácidos nucléicos em cloreto de sódio 0,1 molar até uma concentração de 100 miligramas por mililitro.Em uma capela de exaustão, remova a eletricidade estática da espátula descartável, dos tubos de microcentrífuga e do estoque SWMT, usando uma pistola antiestática. Em seguida, adicione 20 microlitros da solução de ácido nucleico a 980 microlitros de cloreto de sódio 0,1 molar. Em seguida, adicione 1 miligrama de SWNTs lavados à solução de ácido nucleico resultante antes de sonicar a mistura.Posicionar a ponta da sonda durante a sonicação é fundamental. Se ocorrer formação de espuma, reposicione a ponta da sonda e tente diminuir a amplitude. Como alternativa, você pode tentar pulsos de sonicação ou sonicação de banho se a suspensão permanecer ruim.Usando um ultrassônico com ponta de 3 milímetros de diâmetro, sonicar a solução por 10 minutos a 40% de amplitude em banho de gelo. Centrifugar a solução de DNA SWNT duas vezes durante 90 minutos a 16,100 xg. Colete e guarde o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet contendo feixes e agregados de nanotubos de carbono.Rejeitar o pellet em conformidade com os procedimentos institucionais aplicáveis aos resíduos perigosos adequados para os nanomateriais. Medir a absorvância da solução a 632 nanómetros utilizando um espectrofotómetro UV-vis para determinar a concentração aproximada de SWNT em suspensão, de acordo com a lei de Lambert-Beer, e o factor de diluição adequado. Para suspensões de polímero anfifílico, primeiro remova a eletricidade estática da espátula descartável, tubos de microcentrífuga e estoque SWNT.Em uma capela de exaustão, adicione cinco miligramas de SWNTs a cinco mililitros de solução de colato de sódio a 2%. Usando um ultrassônico com ponta de seis milímetros de diâmetro, sonicar a solução por uma hora a 40% de amplitude em banho de gelo. Centrifugar a amostra a 150 000 xg durante quatro horas com uma ultracentrífuga, antes de recolher cuidadosamente o sobrenadante.Em seguida, dissolva 1% do peso do polímero anfifílico na solução scSWNT. Em seguida, dialise a solução de polímero scSWNT usando uma membrana de diálise de 3,5 kilodalton contra um litro de água deionizada ou tampão por cinco dias. Troque a água ou o tampão na segunda hora e na quarta hora.Meça a absorbância da solução a 632 nanômetros usando um espectrofotômetro UV-Vis para determinar a concentração aproximada de SWNTs suspensos. Para preparar as lâminas revestidas com biotina BSA, limpe uma lâmina de microscópio e uma lamínula de 0,17 milímetro com água deionizada, seguida de metanol, acetona e um enxágue final de água deionizada. Crie canais colocando vários pedaços de fita dupla face com aproximadamente cinco milímetros de distância na lâmina limpa do microscópio.Sele os canais pegando uma lamínula de vidro longa e pressionando-a na parte superior da fita dupla face. Certifique-se de centralizá-lo na lâmina do microscópio para que as bordas da lamínula e da lâmina não fiquem niveladas. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução estoque de BSA-biotina a 900 microlitros de 1x tampão Tris até uma concentração final de um miligrama por mililitro.Flua 50 microlitros da solução de BSA-biotina para o canal, pipetando a solução em uma extremidade e absorvendo a solução na outra extremidade usando um lenço de papel. Depois de incubar a solução por cinco minutos, faça três a cinco lavagens com 50 microlitros de cloreto de sódio 0,1 molar. Em seguida, dilua 40 microlitros de cinco miligramas por mililitros de solução estoque de NAV em 960 microlitros de 1x tampão Tris, até uma concentração final de 0,2 miligramas por mililitro.Flua 50 microlitros da solução de NAV para o canal, pipetando a solução em uma extremidade e absorvendo a solução na outra extremidade usando um lenço de papel. Depois de incubar a lâmina por dois a cinco minutos, faça três a cinco lavagens com 50 microlitros de cloreto de sódio 0,1 molar. Em seguida, dilua as soluções de estoque de SWNTs suspensos e tampão de imagem a uma concentração de 1 a 10 miligramas por litro.Flua 50 microlitros desta solução para o canal e incube por cinco minutos. Enxágue suavemente o excesso de SWNTs usando 50 microlitros de tampão de imagem. Para medir a resposta reversível dos DNA-SWNTs GT15 à dopamina, primeiro monte os canais revestidos com sensor no microscópio de fluorescência stage.Traga os canais em foco usando uma objetiva de óleo 100X e uma câmera de arseneto de índio e gálio. Em seguida, adicione 50 microlitros de solução de dopamina 100 micromolar em solução salina tamponada com fosfato ao canal de fluxo e registre a mudança na intensidade da fluorescência. Lave a solução de dopamina usando solução salina tamponada com fosfato e observe a mudança na fluorescência dos sensores SWNT individuais.Para realizar a triagem da placa do poço para a resposta do analito de SWNTs de polímeros biomiméticos, pipete volumes iguais do sensor SWNT suspenso em cada poço. Use volume suficiente para cobrir o fundo do poço uniformemente. Em seguida, pipeta analitos da biblioteca de triagem para as placas do poço.Preparar cada analito em triplicata para ter em conta a variação potencial de poço para poço e flutuações de intensidade de excitação ou temperatura. Levante o objetivo enquanto monitora os espectros de emissões usando o espectrômetro e a matriz de arseneto de índio e gálio. A posição ideal da objetiva colocará o plano focal aproximadamente no meio do volume da amostra no poço, que deve corresponder a um máximo na intensidade medida.Para cada poço de amostra, registre uma exposição de um a 10 segundos para coletar um espectro. Comparar os espectros de emissões de cada alvéolo com um controlo que contenha apenas SWNTs sem analito adicional, a fim de quantificar a resposta de fluorescência. O espectro de absorbância dos sensores de nanotubos de DNA GT15 mostra vários picos correspondentes a nanotubos de carbono bem dispersos de diferentes quiralidades.A fluorescência do infravermelho próximo dos sensores de nanotubos de DNA GT15 é mostrada. Curiosamente, a intensidade da fluorescência aproximadamente dobra em resposta à dopamina. Nesta figura, a microscopia de fluorescência no infravermelho próximo revela sensores únicos de nanotubos de DNA GT15 imobilizados na superfície de uma lamínula de vidro.No futuro, é importante testar o sensor para uso in vivo, por exemplo, expandindo a biblioteca de analitos para incluir concorrentes moleculares, testando a linearidade da resposta no regime de concentração biologicamente relevante e também testando a reversibilidade. Uma vez dominada, essa abordagem pode ser usada para fazer uma biblioteca de diferentes sensores sintéticos a partir de moléculas sem elementos de reconhecimento molecular conhecidos.

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JoVE Journal

Bioengineering

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