Name: Regulamento baseada MicroRNA de Picornavirus tropismo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprenda a regular o tropismo de picornavírus usando elementos de resposta a microRNA no genoma viral. Este método minimiza a engenharia genética e melhora a segurança em pesquisas de virologia.

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Al e Mary Agnes McQuinn, a Fundação Richard M. Schulze e um NIH Relief Grant da Mayo Clinic financiaram o trabalho representativo descrito aqui.

Os autores não têm nada a divulgar.

A concepção, a composição e a localização dos elementos de resposta microARN dentro do genoma viral ditará segmentação eficácia e especificidade. Otimizar estes irão exigir tentativa e erro. No entanto, design racional baseada na análise estrutural de RNA e estudos anteriores de replicação viral e microRNA assinaturas auxilia na implementação dessa técnica com otimização mínima 10, 11, 12, 13,<...

O desenvolvimento de um método amplamente aplicável, fácil e eficaz para a engenharia de um vector com tropismo restrito proporciona uma grande oportunidade para melhorar a segurança, a compreensão biológica e utilidade terapêutica de vírus. Existem vários mecanismos para atingir tropismo viral incluindo transdução, da transcrição, e as técnicas baseadas em translação. No entanto, estes métodos não são geralmente aplicáveis ​​a todos os sistemas de vectores, pode exigir vias de sinalização defeituosos em células alvo ou exigir a inserção de sequências codificadoras grandes no genoma viral. Além disso, esses métodos podem resultar na atenuação do vírus, o que dificulta significativamente a sua actividade terapêutica e limitando uma visão sobre o sistema não modificado. MicroRNAs são pequenos (22-25 nucleótidos), RNAs não-codificantes que medeiam o silenciamento de genes em células eucarióticas. função MicroRNAs ligando sequências alvo complementares (elementos de resposta) em RNAs mensageiro (mRNA) resulti<html> ng na desestabilização da transcrição, a degradação ou a repressão de translação. MicroRNAs normalmente ligam-se elementos de resposta com complementaridade parcial e produzir pequenas modificações na expressão do gene 1, 2, 3, 4, 5. Alterações mais significativas na expressão do gene pode ser conseguido aumentando a complementaridade do elemento de resposta a seis. Milhares de microARNs maduros têm sido identificados numa variedade de espécies e muitas exibem padrões de expressão diferenciais em uma variedade de tipos de células e tecidos 7, 8, 9. Estas assinaturas microRNA pode ser explorada para a restrição específica da célula de amplificação do vírus, incorporando elementos de resposta perfeitamente complementares ao genoma viral 10,= &quot;xref&quot;&gt; 11, 12, 13. O objetivo geral desta técnica de metas de microRNA é controlar o tropismo de um genoma vector sem atenuação adicional. A utilidade deste método para regular o tropismo viral foi inicialmente demonstrada em vectores lentivirais para restringir a expressão do transgene em tecidos específicos, 14, 15, 16. Esta técnica foi subsequentemente aplicada a uma vasta gama de replicar e não replicantes vectores virais para terapia génica aumentada, bem como para melhorar os perfis de segurança de muitos vírus oncolí ticos, eliminando toxicidades indesejadas em tecidos normais 10, 11, 12, 13, 17 . Também tem sido utilizado para gerar e e seguravacinas vivas atenuadas FICAZ, bem como para melhorar o vírus e fabrico de vacinas de processos 18, 19, 20, 21. MicroRNA-alvo de um vector pode permitir a atenuação em hospedeiros vacinados ou sistemas segmentados, mantendo níveis de crescimento do tipo selvagem em sistemas de produtores. MicroRNA-direccionamento podem também ser utilizadas para melhorar a segurança biológica do vírus para fins de investigação, restringindo a transmissão em uma espécie (por exemplo, seres humanos), mantendo a transmissão em outros hospedeiros 22. Finalmente, microRNA-alvo pode permitir análises em profundidade de ciclo de vida viral e papéis específicos de tipos de células em patogênese e imunidade por segregar o crescimento viral 23, 24, 25, 26. Esta técnica oferece uma alternative método que pode ser facilmente implementada e aplicáveis ​​segmentação para todos os sistemas de vírus. Além disso, a recolha em constante expansão de microARNs maduras, com padrões de expressão diferenciais em tipos específicos de células torna esta técnica altamente versátil. -MicroRNA segmentação baseada provou eficaz para uma variedade de sistemas vírus sem comprometer a função do sistema. As principais limitações desta técnica incluem tentativa e otimização de erro, o potencial para mutações de escape, e potenciais efeitos fora do alvo em transcrições endógenos. No entanto, estas limitações geralmente podem ser superados com design otimizado e racional elemento de resposta. vírus de ARN de sentido positivo tende a ser particularmente sensível a microARN-direccionamento devido à orientação de sentido positivo do seu genoma e a disponibilidade dos transcritos à maquinaria microARN durante o ciclo de replicação completamente citoplasmática. Aqui nós descrevemos um protocolo para gerar um picornavírus alvejado-microRNA eo experimmétodos ental para verificar a eficiência e especificidade de que a segmentação in vitro.

<table><tbody><tr><td>RE que codifica oligonucleotídeos</td><td>IDT</td><td>PAGE-Purified Ultramer</td><td>Sequence Projetado pelo investigador</td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos que codificam o local de restrição exclusivo</td><td>IDT</td><td>25nM</td><td>Sequence Projetado pelo investigador</td></tr><tr><td>Expand High Fidelity PCR Kit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11732641001</td><td>Muitos outros kits de PCR da polimerase de alta fidelidade disponíveis</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase System</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>Livre de RNase</td></tr><tr><td>5 M NH4 Acetato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>Vem em MEGAclear Kit</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Água</td> livre de nuclease <td>ThermoFisher Scientific BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção TransIT-2020 Fisher</td> Scientific AM9938 <td></td><td></td> Mirus MIR 5404 <td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção de mRNA TransIT</td><td>Mirus</td><td>MIR 2225</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 0.2 &mu;<td></td></tr><tr><td> m filtro de seringa</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de tampa de rosca de 2 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td></td></tr><tr><td>Raspadores de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>MicroRNA Imita</td><td>Dharmacon</td><td>Ensaio de</td> Proliferação de Células MTT Variadas <td></td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>30-1010K</td><td></td></tr><tr><td>Eficiência de Subclonagem DH5&alpha; Células competentes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>pBlueScript II Vectors</td><td>Agilent Technologies</td><td>Variável (por exemplo, 212205)</td><td>Existem diferentes plasmídeos com promotores T7 ou T3 e locais de clonagem variáveis para permitir a clonagem e a transcrição do RNA.</td></tr></tbody></table>

regulamento baseada microrna de picornavirus tropismo

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

A restrição específica da célula da replicação viral sem atenuação concomitante pode beneficiar o desenvolvimento de vacinas, terapia gênica, viroterapia oncolítica e compreensão das propriedades biológicas dos vírus. Existem vários mecanismos para regular o tropismo viral, no entanto, eles tendem a ser específicos da classe do vírus e muitos resultam na atenuação do vírus. Além disso, muitos vírus, incluindo picornavírus, exibem restrições de tamanho que não permitem a incorporação de grandes quantidades de material genético estranho necessário para alguns métodos de direcionamento. Os microRNAs são RNAs curtos e não codificantes que regulam a expressão gênica em células eucarióticas, ligando-se a sequências-alvo complementares em RNAs mensageiros, impedindo sua tradução ou acelerando sua degradação. Diferentes células exibem assinaturas distintas de microRNA e muitos microRNAs servem como biomarcadores. Esses padrões de expressão diferencial podem ser explorados para restringir a expressão gênica em células que expressam microRNAs específicos, mantendo a expressão em células que não expressam. No que diz respeito à regulação do tropismo viral, sequências complementares a microRNAs específicos são incorporadas ao genoma viral, geralmente nas regiões não codificantes 3', direcionando-as para destruição na presença dos microRNAs cognatos, impedindo assim a expressão e/ou replicação do gene viral. O direcionamento de microRNA é uma técnica que, teoricamente, pode ser aplicada a todos os vetores virais sem alterar a potência do vírus na ausência dos microRNAs correspondentes. Aqui descrevemos métodos experimentais associados à geração de um picornavírus direcionado a microRNA e avaliamos a eficácia e especificidade desse direcionamento in vitro. Este protocolo é projetado para um vírus de replicação rápida com um ciclo de replicação lítica, no entanto, a modificação dos pontos de tempo analisados e as leituras específicas de titulação de vírus usadas ajudarão na adaptação deste protocolo a muitos vírus diferentes.

A Tabela 1 representa os resultados típicos de um ensaio de titulação para um picornavírus e descreve a forma de calcular a dose infecciosa de cultura de tecido de 50%. Uma representação esquemática do conceito global de regulação baseada em microARN de tropismo viral descrito neste manuscrito é mostrado na Figura 1. A orientação do elemento de resposta para microARN durante interacções intracelulares, concepção adequada de elemento de resposta de oligon...

Descrevemos aqui um método para regular o tropismo do picornavírus incorporando sequências complementares a microRNAs específicos no genoma viral. Este protocolo pode ser adaptado a todas as diferentes classes de vírus com modificações baseadas na duração e natureza de seu ciclo de vida.

Regulamento baseada MicroRNA de Picornavirus tropismo

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

O objetivo geral dos experimentos a seguir é avaliar a eficiência e a especificidade da regulação baseada em microRNA da tropismo de picornavírus in vitro. Isso é alcançado preparando picornavírus que codificam elementos de resposta a microRNA em seu genoma. Como segundo passo, utilize os vírus para infectar células que expressem ou não expressem os microRNAs correspondentes.Em seguida, avalie a cinética de replicação viral, propagação e toxicidade para determinar a eficiência e especificidade do direcionamento. Esse método de direcionamento pode ser utilizado no campo da virologia para melhorar a segurança, fabricação e utilidade dos vírus, ou para facilitar pesquisas voltadas à compreensão dos processos biológicos envolvidos na infecção viral. As principais vantagens dessa técnica são a exigência de engenharia mínima do genoma viral e sua alta versatilidade, pois um número significativo de assinaturas celulares de microRNAs já foi identificado.Para iniciar este procedimento, plaque as células permissivas em uma placa de 96 poços com meio de crescimento completo. Adicione meio sem soro sem vírus à linha um e à linha 12 para controles não infectados. Em seguida, incube as células a

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A Biblioteca de ID de destino é um plasmídeo baseado em coleta de todo o genoma de cDNA clonado usado para identificar alvos miRNA. Aqui nós demonstrar o seu uso e aplicação.

Genome-wide tela de Metas de miRNA Usando a missão Biblioteca ID Alvo

MicroRNAs (miRNAs) são importantes reguladores da expressão gênica e foram mostrados a desempenhar um papel em inúmeros processos biológicos. Para entender melhor miRNA-UTR interações, criamos uma coleção de todo o genoma de três repórteres UTR luciferase emparelhado com um novo gene luciferase e reagentes de ensaio, o sistema de interruptor.

Metas de identificação de microRNAs humanos com o Sistema de ensaio de luciferase lightswitch usando 3&#39;UTR repórter-Constrói e um microRNA em células aderentes Mimic

Os norovírus são a principal causa de gastroenterite ainda técnicas moleculares para sua caracterização são ainda relativamente novo. Aqui relatamos duas diferentes abordagens genética reversa para a recuperação eficiente de norovírus murino (MNV), o único membro do gênero que podem ser propagadas em cultura de células.

Recuperação de reversão genética mediada por norovírus Murina Infecciosas

Fonte: Ruiz, A. J. e Russell, S. J. Regulação baseada em microRNA da tropismo de Picornavírus. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra o uso de miméticos sintéticos de microRNA para inibir seletivamente a replicação viral em células epiteliais cultivadas. Destaca como o silenciamento direcionado do genoma por microRNA pode bloquear a disseminação do vírus e confirmar a especificidade do direcionamento por meio de análise da infectividade subsequente.

Avaliação da Inibição da Disseminação Viral por meio do Silenciamento Genômico Mediado por Mímicos de microRNA

Aqui propomos uma estratégia para estudar o efeito de um fator de transcrição de interesse no transcriptoma de microRNA usando dados publicamente disponíveis, recursos computacionais e dados de alto rendimento de matrizes de microRNA após a transfecção de células com pequeno hairpin (sh)RNA visando um fator de transcrição de interesse.

Descrevendo um regulamento Dependente Fator de Transcrição do MicroRNA transcriptoma

Nós relatamos usando uma artificial intrônicas pequeno RNA expressão estratégia para desenvolver um recombinante com defeito não Aedes aegypti densovirus (AaeDV) na vivo sistema de entrega. Um procedimento detalhado para a construção, embalagens e análise quantitativa dos vetores rAaeDV tão bem quanto a infecção larval é descrito.

Uso de um Mosquito recombinante Densovirus como um vetor de entrega do Gene para a análise funcional de Genes em larvas do Mosquito

Double-stranded do RNA produzido durante a replicação de vírus de RNA pode ser reconhecido por receptores de reconhecimento padrão para induzir uma resposta imune inata. Para vírus de RNA de sentido negativo, a interação entre o baixo nível de dsRNA e PRRs permanece obscura. Nós desenvolvemos um método de microscopia confocal para visualizar dsRNA arenavírus e PRR em células individuais.

Imagem latente confocal de RNA Double-Stranded e receptores de reconhecimento padrão na infecção pelo vírus de RNA de sentido negativo

Apresentamos um protocolo detalhado para o sistema de silenciamento de microRNA baseado em vírus de batata X (PVX) para caracterizar funcionalmente microRNAs endógenas (miRNAs) na batata. As moléculas de mímica alvo (TM) de miRNA de interesse são integradas ao vetor PVX e transitavelmente expressas na batata para silenciar a família miRNA ou miRNA alvo.

Silenciador de microRNA baseado em vírus de batata (VbMS) na batata.

Desenvolvemos um ensaio de repórter de biogênese intrônica para ser usado em células in vitro com quatro plasmídeos: um com miRNA intrônico, um com o alvo, um para superexpressar uma proteína regulatória, e outro para a luciferase renilla. O miRNA foi processado e pôde controlar a expressão da luciferase ligando-se à sequência de alvos.

Um ensaio repórter para analisar a maturação intronic microRNA em células mamíferas

O protocolo descreve um ensaio de hibridização de imunofluorescência em tandem com tecido embebido em parafina fixado em formalina para detectar e quantificar microRNA e proteínas multiplexadas simultaneamente.

Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

Aprenda a regular o tropismo de picornavírus usando elementos de resposta a microRNA no genoma viral. Este método minimiza a engenharia genética e melhora a segurança em pesquisas de virologia.

Regulamento baseada MicroRNA de Picornavirus tropismo

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