Name: Coleção de sérica e sem Alimentador rato-tronco embrionárias Médio condicionado celular para uma abordagem livre de celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprenda a coletar meio condicionado de células-tronco embrionárias de rato sem soro e alimentador. Este método revela propriedades anti-senescência para aplicações terapêuticas em doenças relacionadas ao envelhecimento.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Ciência Básica Pesquisa (2013R1A1A2060930) e do Programa do Centro de Investigação Médica (2015R1A5A2009124) através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência, TIC e planejamento futuro. Esta pesquisa também é apoiado por uma subvenção de funcionamento Start-up do Hospital for Sick Children (HK Sung). Nós gostaríamos de agradecer a Laura Barwell e Sarah JS Kim por sua excelente ajuda na edição deste manuscrito e Dr. Andras Nagy para fornecer a linha G4 MESC.

NOTA: Um esquema do protocolo de recolha sérica e CM isento de alimentador é mostrado na Figura 1. 1. Materiais (Preparação de MEFs, Medium, pratos e Soluções) <ol><li> Preparar 500 ml de meio de cultura para os MEFs. Suplemento Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de FBS (qualidade CES), 50 unidades / ml de penicilina, e 50 mg / ml de estreptomicina. </li><li> Isolar MEFs de embriões seguindo um protocolo de rotina estabelecida 13 e mantê-los em meio MEF. </li><li> Preparar 500 ml de meio de cultura para os mESCs. DMEM é suplementado com 15% de FBS e 2 mM de L-glutamina, 100 uM aminoácidos não essenciais (NEAA), 100 uM β-mercaptoetanol, 100 unidades / factor inibidor de leucemia ml (LIF), 50 unidades / ml de penicilina, e 50 mg / ml de estreptomicina. </li><li> Preparar as placas gelatinizados (5 placas gelatinizados / 1 placa MESC) por revestimento de placas de cultura celular de 10 cm com 5 ml de solução de gelatina a 0,1%. Incuba-se durante pelo menos 10 min<html> à temperatura ambiente. </li><li> Prepare 500 ml de Redução de meio de soro para uma condição livre de soro de mESCs. Suplemento de meio de soro reduzido com 1,2 g de bicarbonato de sódio (pH 7,0). Filtrar através de um filtro de garrafa-top 0,2 m. </li><li> Prepara-se o associada à senescência β-galactosidase (SA β-gal) de solução corante para a detecção de células senescentes: 1 mg / ml de X-gal (dissolvido em dimetilf ormamida, DMF), ácido cítrico 40 mM / tampão de fosfato de sódio (pH 6,0) , ferricianeto de potássio 5 mM, ferrocianeto de potássio 5 mM, NaCl 150 mM, e 2 mM de MgCl 2 14. CUIDADO: (Perigosos) DMF é uma solução tóxico e corrosivo. Usar vestuário de protecção pessoal (por exemplo, borracha nitrílica ou luvas de látex, um jaleco e óculos de proteção) ao manusear solução. Use um exaustor. </li><li> Prepare 500 ml de meio para a cultura de fibroblastos dérmicos humanos (HDFS, NHDF-Ad-Der-de fibroblastos). Suplemento DMEM com FBS a 10% e 100 unidades / ml de penicilina e 100 mg / ml de estreptomicina. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. cultura de células estaminais embrionárias de camundongos (Figura 1A e 2A) NOTA: Realizar todas as etapas de um capô de segurança biológica de cultura de células. <ol><li> Tratar as MEFs com 20 ml de meio de MEF contendo 10 ug / ml de mitomicina C em uma placa de cultura celular de 15 cm. Incubar durante 2 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Aspirar o meio de MEFs. Lavam-se as células com PBS três vezes. Adicionar 3 ml de tripsina-EDTA (TE, 1x) e incubar durante 3 min a 37 ° C e 5% de CO 2. Após 3 min, neutralizar o TE com 6 ml de meio de MEF e centrifuga-se durante 3 min a 300 x g. </li><li> Ressuspender em 5 ml de meio de MEF. Determinar o número de células na suspensão de células resultante utilizando coloração com azul de tripano e um hemocitómetro. Placa MEFs inactivadas (alimentador) a uma densidade de 2 X 10 6 células por 10 cm de placa de cultura de células em meio de MEF. Incubar durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Substituir o meio de MEF com meio MESC 24 h após o plaqueamento o alimentador (nadia seguinte). </li><li> Placa os mESCs (G4 F1 celulares ES híbrido) a uma densidade de 2 x 10 6 células no alimentador com meio MESC. Incubar durante 48 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. NOTA: O efeito anti-envelhecimento de MESC-CM é provavelmente mais forte quando o número de passagem inferior mESCs são usados 15-17. Adquirimos uma linha G4 MESC do Dr. Andras Nagy no Instituto Lunenfeld-Tanenbaum Research, Mount Sinai Hospital, 25 Orde Street, Toronto, ON, M5T 3H7, Canadá. </li><li> Manter as células a uma densidade relativamente elevada e uma passagem no estado de sub-confluência de 70-80%. Substituir o meio com meio MESC fresco diariamente. </li></ol> 3. Recolha de sérica e sem Alimentador meio condicionado (Figura 1B e 2B) NOTA: Realizar todas as etapas de um capô de segurança biológica de cultura de células. <ol><li> Lavar a placa MESC com 5 ml de PBS. Adicionar 1 ml de TE (2,5x) e incubar durante 3 min a 37 ° C e 5% de CO 2. Após 3 min, neutralizar o TE com 2 ml de MESC medium e centrifuga-se durante 3 min a 300 x g. </li><li> Ressuspender em 5 ml de meio e MESC placa 1 ml para cada placa de cultura revestidos com gelatina (placas gelatinizados 5/1 MESC placa) em meio MESC. Cultura a 37 ° C e 5% de CO2, até 80-85% de confluência é atingido. </li><li> Lavar com PBS mESCs suficiente para cobrir as células (8 mL por placa de 10 cm) durante 10 min por lavagem, para um total de três lavagens. Incubar em Redução meio de soro durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. NOTA: O passo de lavagem é importante para evitar a contaminação de FBS. É importante seguir o tempo de incubação 18,19. </li><li> Recolhe MESC-CM em um tubo de 50 ml e centrifugar durante 20 min a 2500 x g. Recolhe-se o sobrenadante da solução (CM) depois da centrifugação. Filtrar através de um filtro de garrafa-top 0,2 m. </li></ol> 4. Efeitos do rato-tronco embrionárias Médio com ar-Cell (MESC-CM) NOTA: Os efeitos de MESC-MC foram validados por vários métodos, tais como aSA ensaio β-gal, análise do ciclo celular, e de qRT-PCR. <ol><li> SA β-gal Ensaio (Figura 3A) <ol><li> HDFs semente a uma densidade de 2 x 10 4 culas por po em placas de 6 poços em meio de HDF. Incubar durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Após uma incubação durante a noite, meia descarte do meio HDF e adicionar MESC-CM e médio controle. Incubar durante 72 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. meio de controlo é derivado a partir de meio isento de soro (meio de soro reduzido) em uma placa revestida com gelatina na ausência de mESCs. </li><li> Lavam-se as células com PBS suficiente para cobrir as células (2 ml por placa de 6 poços) durante 30 segundos por cada lavagem, para um total de duas lavagens. Adicionar 3,7% de paraformaldeído (PFA) para fixação. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente. CUIDADO: (Perigosos) O paraformaldeído é uma solução tóxico e corrosivo. Usar vestuário de protecção pessoal (por exemplo, borracha nitrílica ou luvas de látex, um jaleco e óculos de proteção) ao manusear a solução.Use um exaustor. </li><li> Aspirar a solução de fixação. Lavam-se as células fixadas, com PBS, duas vezes, conforme descrito no passo 4.1.3. </li><li> Adicionar a solução de coloração β-gal SA (1-2 ml por poço numa placa de 6 poços). Incuba-se durante 17,5 horas a 37 ° C. NOTA: Não está a ser incubadas numa incubadora de CO 2. </li><li> Aspirar a solução de coloração β-gal SA e lavar as células duas vezes com PBS, como descrito no passo 4.1.3. </li><li> Adicionar a solução de eosina para a contra-coloração. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Lavar as células duas vezes com PBS, como descrito no passo 4.1.3. </li><li> células de imagens em 100X com uma luz imagens de microscópio e captura usando uma câmera digital anexada para posterior análise. NOTA: O número total de células pode ser contado de uma maneira cega e a percentagem de células azuis positivas β SA-gal pode ser calculada. </li></ol></li><li> Análise do ciclo celular (Figura 3B) <ol><li> HDFs sementes a uma densidade de8 x 10 4 culas por po numa placa de cultura celular de 6 cm de forma HDF. Incubar durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Após uma incubação durante a noite, meia descarte do meio HDF e adicionar MESC-CM e médio controle. Incubar durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Tripsinizar as células, como descrito no passo 3.1, e centrifuga-se durante 5 min a 300 x g. Lavam-se as células com uma solução de PBS frio (PBS com 0,5 mM de CaCl 2 e 2% de FBS, 1 ml por tubo 1,5 ml) duas vezes e centrifuga-se durante 3 min a 2500 x g. Ressuspender em 100 uL de solução de PBS frio. </li><li> Fixar as células, largando 200 mL de etanol frio, enquanto vórtex. Armazenar a 4 ° C durante pelo menos 1 h. </li><li> Lavam-se as células com solução de PBS frio, duas vezes, conforme descrito no passo 4.2.3. </li><li> Ressuspender as células em 250 ul de tampão de citrato de sódio (1,12%, pH 8,5) contendo 50 ug / ml de RNase. Incubar durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 250 ul de citrato de sódiotampão contendo / ml de iodeto de propídio 50 ug. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Medem-se as células de 10.000 em cada amostra utilizando a citometria de fluxo 20. </li></ol></li><li> qRT-PCR (Figura 3C) <ol><li> HDFs sementes e adicione MESC-CM, conforme descrito nos passos 4.1.1 e 4.1.2. </li><li> Isolar o ARN total a partir dos HDFs utilizando um kit de extracção de ARN de acordo com o protocolo do fabricante. Quantificar o ARN total extraído usando um espectrofotómetro 21. </li><li> Sintetizar ADNc por adição de 1 ug do ARN total para a 20 ul de mistura reaccional contendo iniciadores oligo (dT) e M-MLV de transcriptase inversa, de acordo com o protocolo do fabricante 20. </li><li> Medir a amplificação do cDNA com uma máquina de PCR em tempo real, utilizando PCR master mix verde e iniciadores específicos de gene (Suplemento Tabela 1). Normalizar os dados com a expressão GAPDH. Use o seguinte protocolo de PCR: de inicialnaturação durante 10 min a 95 ° C; 45 ciclos de 15 seg a 95 ° C, 20 seg a 55 ° C, e 35 seg a 72 ° C; e a fase de fusão curva durante 15 seg a 95 ° C, 1 min a 60 ° C, 30 seg a 95 ° C, e 5 segundos a 60 ° C 15. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
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<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).</li>
<li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+number+affects+the+pluripotency+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+judged+by+tetraploid+embryo+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation.</a> Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).</li>
<li>Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+protein+enrichment+and+analysis%3A+an+optimized+approach+applied+on+cancer+cell+lines+using+2D+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS.</a> J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).</li>
<li>Makridakis, M., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+proteomics+for+discovery+of+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers.</a> J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).</li>
<li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+replicative+senescence+by+insulin-like+growth+factor-binding+protein+3+in+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells.</a> Aging Cell. 6, 535-545 (2007).</li>
<li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cellular+senescence+by+insulin-like+growth+factor+binding+protein-5+through+a+p53-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism.</a> Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).</li>
<li>Eiselleova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Para a recolha bem sucedida de sérica e MESC-CM sem alimentador, as seguintes sugestões devem ser levados em consideração. O fator mais crítico é usando mESCs passagem precoce para a recolha de MESC-CM. Anteriormente, demonstrou-se que no início passagem MESC-CM tem melhores efeitos anti-envelhecimento em comparação com mESCs passagem final. O número passagem do mESCs tem sido relatada a afectar o seu potencial de desenvolvimento 16 e pluripotência 17. Embora pesquisas ...

O objetivo deste protocolo é recolher rato com células-tronco embrionárias (MESC) meio climatizados, (MESC-CM) a partir de condições de cultura sérica e livre de alimentação e caracterizar suas funções biológicas. Em geral, as células-tronco embrionárias (CES) têm um grande potencial para a medicina regenerativa e terapia celular, devido à sua pluripotência e capacidade de auto-renovação 1-3. No entanto, o transplante de células-tronco directa tem várias limitações, tais como a rejeição imunológica e a formação do tumor 4,5. Portanto, uma abordagem livre de células pode fornecer uma estratégia terapêutica alternativa para a medicina regenerativa e envelhecimento intervenções 6,7. A senescência é visto como um homólogo celular para o envelhecimento dos tecidos e órgãos, caracterizado por um estado permanente de paragem do crescimento, fisiologia celular alterada, e comportamentos. O envelhecimento é o principal fator de risco para doenças prevalentes, incluindo cancro, doenças cardiovasculares, tYpê 2 diabetes e neurodegeneração 8. Uma das características óbvias de envelhecimento é o declínio no potencial regenerativo dos tecidos, que é causada pelo envelhecimento de células-tronco e exaustão 9. Muitos estudos têm demonstrado significativas moléculas farmacológicas, tais como a rapamicina 9, o resveratrol 10, 11 e metformina, e factores sistémicos transmitidas pelo sangue, a saber, GDF11 12, que tem a capacidade de atrasar o envelhecimento de forma consistente e estender a esperança de vida. No presente estudo, MESC-CM foi colhida sem soro camadas (soro fetal bovino, FBS) e alimentação (rato embrionárias fibroblastos, MEFs) para excluir a contaminação de fatores séricos e factores de secreção de MEFs. Estas condições permitidas para uma CM sérica e livre de alimentador que, consequentemente, permitiu a identificação precisa dos fatores de secreção MESC específicas do. Este protocolo proposto é altamente eficiente, de custo relativamente eficaz e fácilpara operar. Esta técnica proporciona perspectivas sobre a caracterização de factores solúveis MESC-derivados que podem mediar um efeito anti-senescência, que pode ser utilizada para o desenvolvimento de uma abordagem terapêutica isento de células segura e potencialmente vantajoso para intervenções para as doenças do envelhecimento-associados e de outros regenerativa tratamentos.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>#11960-044</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>#30044333</td><td>20%, qualidade de células ES</td></tr><tr><td>Penicilina e estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>#15140</td><td>50 unidades/ml de penicilina e 50&nbsp; mg/ml de estreptomicina</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>#25030</td><td>2&nbsp; mM</td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais (NEAA)</td><td>Invitrogen</td><td>#11140</td><td>100&nbsp; &micro; M</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M3148</td><td>100&nbsp; &micro; </td></tr><tr><td>Fator inibidor da leucemia</td> M<td>Millipore</td><td>#ESG1107</td><td>100 unidades/ml</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>#22600</td><td></td></tr><tr><td>X-gal&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#B4252</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>3,70%</td></tr><tr><td>Dimetilformamida (DMF)</td><td>Sigma</td><td>#D4551</td><td></td></tr><tr><td>Ferricianeto de potássio</td><td>Aldrich</td><td>#455946</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>ferrocianeto de potássio</td><td>Aldrich</td><td>#455989</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>#S7653</td><td>150 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>#M2393</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Sigma</td><td>#M4287</td><td>10&nbsp; &micro; g/ml</td></tr><tr><td>de iodeto de propídio</td><td>Sigma</td><td>#P4170</td><td>50&nbsp; &micro; g/ml</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion</td><td>#15596018</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV reverse transcript-tase</td><td>Promega</td><td>#M170B</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR master mix&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>#4367659</td><td></td></tr><tr><td>HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblastos&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>#CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>Filtro superior</td><td>de garrafa Corning</td><td>#430513</td><td>0.2 &mu; m</td></tr></tbody></table>

coleção de sérica e sem alimentador rato-tronco embrionárias médio condicionado celular para uma abordagem livre de celular

Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

A capacidade das células-tronco embrionárias (ESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) de gerar vários tipos de células abriu novos caminhos no campo da medicina regenerativa. No entanto, apesar de seus benefícios, o potencial tumorigênico de ESCs e iPSCs tem sido uma barreira para aplicações clínicas. Curiosamente, foi demonstrado que as ESCs produzem vários fatores solúveis que podem promover a regeneração tecidual e retardar o envelhecimento celular, sugerindo que ESCs e iPSCs também podem ser utilizadas como um método de intervenção livre de células. Portanto, o método para a colheita de meio condicionado por células-tronco embrionárias de camundongo (mESC) (mESC-CM) com contaminação mínima de componentes séricos (soro fetal bovino, FBS) e células alimentadoras (fibroblastos embrionários de camundongo, MEFs) tem sido altamente exigido. Aqui, o presente estudo demonstra um método otimizado para a coleta de mESC-CM em condições livres de soro e alimentador e para a caracterização de mESC-CM usando leituras múltiplas associadas à senescência. Este protocolo fornecerá um método para coletar fatores secretores puros específicos de mESC sem contaminação do soro e do alimentador.

Originalmente, mESCs são mantidos em um alimentador MEF em meio com FBS a MESC e outros suplementos (Figuras 1A e 2A). CM foi recolhido a partir de mESCs na redução meio de soro, sem uma camada de alimentação, de FBS, ou outros suplementos (Figuras 1B e 2B). Esta condição cultura nos permite coletar específico do MESC meio condicionado sem potencial contaminação pelos fatores do alimentador, FBS, ou outros suplementos. O...

Este protocolo proporciona um método para a recolha de células estaminais embrionárias de rato (MESC) forma climatizados, (MESC-CM) derivado de soro (soro fetal de bovino, FBS) - e do alimentador (fibroblastos embrionários de ratinho, MEFs) Livres de condições para uma célula abordagem -livre. Pode ser aplicável para o tratamento do envelhecimento e das doenças associadas ao envelhecimento.

Coleção de sérica e sem Alimentador rato-tronco embrionárias Médio condicionado celular para uma abordagem livre de celular

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

Os objetivos gerais deste protocolo são coletar meio condicionado de células-tronco embrionárias de camundongos sob condições de soro e cultura livre de alimentador e caracterizar as funções biológicas desse meio. Este procedimento fornece informações sobre a atividade anti-senescência de fatores solúveis secretados por células-tronco embrionárias de camundongos para o desenvolvimento de uma abordagem terapêutica segura e livre de células para doenças relacionadas à idade. Demonstrando este procedimento estará o Dr. Yun-Ui Bae, professor pesquisador do meu laboratório.Em uma capa de segurança biológica, trate um fibroblasto embrionário de camundongo ou cultura de células MEF com 20 mililitros de meio MEF suplementado com mitomicina C em uma placa de cultura de células de 15 centímetros por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No final da incubação, lave as células três vezes com PBS e separe-as com três mililitros de tripsina EDTA por três minutos a 37 graus Celsius. Neutralizar a tripsina com seis mililitros de meio MEF fresco quando as células forem levantadas do fundo da placa.Depois de coletar as células por centrifugação, ressuspender o pellet em cinco mil

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

A qualidade de fibroblastos embrionários (MEFs) é ditada pela estirpe direito de rato tal como CF-1. Pluripotência-MEFs apoio e meios condicionados (CM), obtida a partir destes deve conter concentrações ótimas de Activin A, Gremlin e TGF-p1 necessários para a Activin / Nodal e vias FGF para co-operatório manter a auto-renovação e pluripotência.

Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

Este vídeo apresenta um método para gerar precursores de interneurônios corticais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos. O protocolo envolve a cultura das células-tronco em meios contendo inibidores específicos de pequenas moléculas, que facilitam a proliferação e agregação de células-tronco em corpos embrióides (EBs). Posteriormente, os EBs são dissociados com enzimas e plaqueados em poços de placa de cultura revestidos com proteínas de adesão para promover sua diferenciação...

Geração de precursores de interneurônios corticais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos

Este vídeo demonstra um método para a geração in vitro de células progenitoras neurais (NPCs) a partir de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs). As mESCs são cultivadas em suspensão para formar corpos embrióides (EBs), que são então guiados para se diferenciar em NPCs por meio de tratamento com ácido retinóico em uma cultura aderente.

Uma técnica para gerar células progenitoras neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos

Soro utilizado em culturas de embriões contém componentes desconhecidos que podem afetar o resultado de experimentos especialmente em estudos que envolvem interações de sinalização. Aqui, utilizamos um sistema de cultura oxigenado sem soro e mostram que os embriões no meio da gestação rato cultivadas durante 16-40 horas apresentam desenvolvimento morfológico comparável aos embriões em desenvolvimento in utero.

Rato Desenvolvimento Embrionário em todo um sistema de cultura de embriões sem soro

As células-tronco embrionárias de camundongos podem ser diferenciadas em células T in vitro usando o sistema de co-cultura OP9-DL1. O sucesso neste procedimento requer atenção cuidadosa à manutenção do reagente/célula e às principais etapas sensíveis à técnica. Aqui, discutimos esses parâmetros críticos e fornecemos um protocolo detalhado para incentivar a adoção dessa tecnologia.

Derivação de células T In Vitro De Mouse Células-Tronco Embrionárias

Este protocolo descreve em detalhes o método para gerar progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias usando um método de monocamada sem soro. Esses progenitores podem ser usados para derivar tipos de células neurais maduras ou para estudar o processo de especificação neural e são passíveis de escalonamento de formato multipoço para triagem de compostos.

Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

Proteínas, muitas vezes contêm vários domínios que podem exercer diferentes funções celulares. Gene knock-out (KO) não consideram essa diversidade funcional. Aqui, relatamos uma abordagem de estrutura-função com base na troca de cassete mediada por recombinação (RMCE) em KO células estaminais embrionárias que permite a dissecação molecular de vários domínios funcionais ou variantes de uma proteína.

Estudos de estrutura-função em células estaminais embrionárias Rato Usando recombinase mediada por troca cassete

Este artigo descreve um protocolo para eficientemente derivar e cultura linhas de células-tronco pluripotentes de embriões de rato no estágio de blastocisto.

Derivação das linhas de células-tronco de embriões pré-implantação do rato

Este protocolo descreve um método para gerar progenitores interneurônio cortical e pós mitóticas interneurônio precursores de células-tronco embrionárias rato usando um método modificado de corpo-a-monocamada do embryoid. Estes precursores/progenitores pode ser usado em vitro fluorescente classificada e transplantado para o neocórtex neonatal para estudar a determinação do destino ou usado em aplicações terapêuticas.

Diferenciação de células estaminais embrionárias de rato em Cortical interneurônio precursores

Descrevemos em detalhes dois protocolos de base química para cultivo de células-tronco embrionárias do mouse. Esse novo método utiliza mecanismos sinérgicos de promover oxidação mediada por Tet (vitamina C) e reprimindo a síntese de novo de 5-metilcitosina (por PD0325901) para manter o DNA hypomethylation e pluripotência das células-tronco embrionárias do mouse.

Um método alternativo de cultura para manter Hypomethylation genômico das células-tronco embrionárias Mouse usando MEK inibidor PD0325901 e vitamina C

Aqui, descrevemos os métodos para executar o ChIP-Seq e CARIP-Seq, incluindo preparação de biblioteca para o sequenciamento de última geração, para gerar epigenomic global e cromatina associada RNA mapas em pilhas do ES.

CARIP-Seq e ChIP-Seq: métodos para identificar a cromatina associada RNAs e interações da proteína-ADN em células-tronco embrionárias

Aprenda a coletar meio condicionado de células-tronco embrionárias de rato sem soro e alimentador. Este método revela propriedades anti-senescência para aplicações terapêuticas em doenças relacionadas ao envelhecimento.

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