Isolamento e Citometria de Fluxo Analysis of Human Endocervical Gama Cells Delta T

Os objetivos gerais deste procedimento são isolar e caracterizar uma população de células T gama delta intraepitelial não convencional de uma amostra de escova endocervical humana. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na compreensão dos eventos imunológicos dentro do compartimento intraepitelial endocervical, para auxiliar no desenho de estratégias eficazes para prevenir infecções. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma ferramenta poderosa e eficiente para o estudo de linfócitos T gama delta intraepiteliais endocervicais, in vitro.

Demonstrando o procedimento estará Laura Romero, pesquisadora associada sênior do meu laboratório. Imediatamente após a coleta, coloque o tubo contendo o pincel citográfico no gelo. Dentro de uma hora após a coleta, vórtice o tubo contendo a escova citográfica por quatro pulsos de 10 segundos.

Em seguida, centrifugue o tubo e remova cuidadosamente o pincel sem perturbar a paleta. Em seguida, adicione um mililitro de meio IMDM às células e coloque o tubo no gelo. Coloque a escova citocitária em cima de um filtro de células de 100 milímetros em um tubo cônico de 50 mililitros e lave a escova com 20 mililitros de IMDM fresco.

Centrifugue a lavagem. Ressuspendendo a paleta em um mililitro de IMDM fresco e piscina com lavagem com as células no tubo de coleta original do cytobrush. Para analisar as células endocervicais por citometria de fluxo, alíquota de uma a três vezes 10 elevado à quinta célula em 100 microlitros de tampão fax por tubo de cinco mililitros e rotule as células com os anticorpos e o corante de viabilidade de interesse por 30 minutos a quatro graus Celsius no escuro.

No final da incubação, lave as células em um mililitro do tampão do kit. Depois de girar as células, decantar completamente o sobrenadante. Use grânulos e os anticorpos de controle IgG apropriados para definir os controles de compensação.

Em seguida, carregue o primeiro tubo e defina a porta na população total de células endocervicais em um gráfico de dispersão para frente a lado, seguido pela exclusão dos dublês de células. Exclua as células mortas de acordo com sua expressão de corante de viabilidade, controlando as células vivas CD45 positivas e CD3 positivas. As células positivas gama delta um e gama delta dois são definidas como as subpopulações de células CD3 positivas que expressam gama delta TCR.

Para isolar as células T gama delta por isolamento de esferas magnéticas, ressuspenda até uma vez 10 elevado às sétimas células endocervicais recém-colhidas em 40 microlitros de tampão TCR gamma delta MicroBead kit. Seguindo as instruções do fabricante para o protocolo de coloração em duas etapas, rotule as células com anticorpo anti-TCR gama delta hapteno, seguido por MicroBeads conjugadas com anti-hapteno FITC por 15 minutos a quatro a oito graus Celsius. No final da incubação, lave as células em um mililitro do tampão do kit e decanta completamente o sobrenadante.

Ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão do kit e aplique a suspensão da célula diretamente em uma coluna de esferas magnéticas colocada no ímã separador apropriado, coletando o fluxo em um novo tubo. Quando todas as células tiverem passado pela coluna, lave a coluna três vezes com 500 microlitros de tampão fresco e junte as lavagens com as células coletadas. Para coletar as células T gama delta, transfira a coluna para um tubo cônico e use o êmbolo da coluna para liberar as células T da coluna com um mililitro de tampão fresco.

Para isolar as células T gama delta por classificação de células ativadas por fluorescência, rotule as células com um corante de viabilidade, no painel de anticorpos, conforme demonstrado. Em seguida, classifique as células de acordo com seu corante viável e positividade para CD45, CD3 e gama delta. Uma população única de células T que expressam gama delta V1 pode ser prontamente detectada em amostras de células endocervicais humanas.

A análise fenotípica detalhada das células CD3 positivas para gama delta um revela que a maioria dessas células são CD4 e CD8 negativas. A separação magnética das células endocervicais, como acabamos de demonstrar, resulta na purificação de uma população quase 98% pura dessas células TCR gama delta. Este nível de pureza também pode ser alcançado por meio da classificação de células ativadas por fluorescência, validando o uso de qualquer técnica para o isolamento de células T gama delta endocervicais.

Curiosamente, a análise de células intraepiteliais endocervicais, células T gama delta, colhidas de pacientes do sexo feminino infectadas pelo HIV e controles de doadores saudáveis, demonstra uma ligeira redução no número e na viabilidade dessas células importantes em indivíduos infectados pelo HIV. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em duas a três horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de processar rapidamente a amostra e manter as células congeladas durante todo o procedimento, para manter uma boa viabilidade celular.

Após este procedimento, outros métodos, como a classificação de células únicas combinada com uma PCR multiplex de alta sensibilidade, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre as vias inflamatórias e de sinalização dentro do compartimento intraepitelial endocervical. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores no campo do HIV e doenças infecciosas explorarem novos marcadores celulares de vulnerabilidade da mucosa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar linfócitos intraepiteliais a partir de uma amostra de escova endocervical humana.