Name: Isolamento e Citometria de Fluxo Analysis of Human Endocervical Gama Cells Delta T (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprenda a isolar e caracterizar células T gama delta intraepiteliais de amostras endocervicais humanas usando citometria de fluxo. Este método eficiente permite estudar eventos imunes in vitro para prevenção de infecções.

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Agradecemos aos participantes do estudo Miami WIHS para a sua vontade de participar neste trabalho. Os dados apresentados nesta manuscrito foram recolhidos por Interagency HIV Study das Mulheres Miami (WIHS). O conteúdo desta publicação é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam a posição oficial do National Institutes of Health (NIH). Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas e das mulheres Infecção Estudo Interagency HIV (WIHS) [subvenção número U01 AI103397], Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, Instituto Nacional de Saúde [número de concessão P30AI073961], Centro Nacional para a Promoção Ciências translacionais e do Instituto Nacional sobre Minority Saúde e Saúde disparidades, Instituto Nacional de Saúde [número de concessão UL1TR000460 e 1KL2TR000461], e do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano, Instituto Nacional de Saúde [número de concessão K23HD074489].

atividades de estudo teve lugar na Universidade de Miami Unidade de Pesquisa de HIV em colaboração com Estudo das Mulheres Miami HIV Interagency (WIHS) e do Centro Miami for AIDS Research (CFAR) .Institutional Review Board (Universidade de Miami Miller School of Medicine) aprovação foi obtida antes ao recrutamento e quaisquer procedimentos de avaliação ou de estudos relacionados. Coleta de Amostras 1. Endocervical Escova NOTA: Os participantes foram submetidos a um exame vaginal realizado por MD treinados ou ginecologista e recolha de linfócitos intra-epiteliais foram realizadas em exame especular, inserindo cytobrush. <ol><li> As características dos participantes <ol><li> Recrutar mulheres participantes que estão com idade de 18 a 45 anos de idade, sexualmente ativa, não está grávida e não em medicamentos contraceptivos ou com um dispositivo intra-uterino. </li><li> Antes do exame vaginal, têm participantes passam por um empate de 10 mL de sangue em verdeVACUTAINERS heparina superior para o isolamento periférico de células mononucleares do sangue (PBMC). para servir como um controle para análise intra-epitelial endocervical 9. </li></ol></li><li> Coleta das amostras endocervicais <ol><li> Inserir um espéculo estéril de tamanho apropriado na vagina sem lubrificação. Usar uma água quente para facilitar a inserção do espéculo e gaze estéril para limpar o muco. A posição do espéculo permite a visualização completa do sistema operacional e ectocérvice. </li><li> Insira escova endocervical no canal endocervical até que apenas as cerdas mais próxima da mão são visíveis. Girar a escova para 360 °. Transferir a escova para um tubo de 15 ml contendo 5 ml de meio IMDM. </li><li> Imediatamente após a coleta, colocar o tubo contendo cytobrush no gelo. Para obter uma alta viabilidade das células intra-epitelial recolhidos, entregar o cytobrush para o laboratório e processo dentro de 1 h. </li></ol></li></ol><ol><li> tubo de vórtice contendo cytobrush endocervical aplicando 4 cursos de curta duração (10 seg). </li><li> Centrifuga-se o tubo, contendo cytobrush, durante 10 min a 250 x g. </li><li> Cuidadosamente remover o cytobrush a partir do tubo (não perturbar o sedimento no fundo do tubo) e adicionar 1 mL de meio IMDM e colocar o tubo em gelo. </li><li> Colocar o cytobrush no filtro de células 100 milímetros na parte superior do tubo de 50 ml. </li><li> Lave o cytobrush com 20 ml de IMDM. </li><li> tubo de centrifugação durante 10 min a 250 x g. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 1 ml de IMDM e combinam-se com o sedimento ressuspenso já descrito em 2.3. </li><li> Contar as células utilizando um contador de células automatizado 10 ou contar as células utilizando um hemocitómetro, combinando 10 ul da suspensão celular com 10 ul de corante azul de tripano. Suavemente pipeta cima e para baixo dez vezes para misturar as células e corante. Carga de 10 ulda mistura para dentro da abertura de uma das duas câmaras de hemocitómetro. Contar todas as células nas cinco áreas de grade. Manter uma contagem separada de as células viáveis ​​e não viáveis. Determinar a viabilidade celular usando a seguinte fórmula:% de células viáveis ​​= células não viáveis ​​x 100 células / total de número de células. Determinar a concentração de células por ml subsequente (e o número total de células) utilizando os seguintes cálculos. Total de células por ml = x total de células contadas (fator de diluição / número de quadrados contados) x 10.000 células / ml. </li><li> Congelar as células endocervicais isolados utilizando meio de congelamento contendo 10% de DMSO e 90% de FBS. </li></ol> 3. Citometria de Fluxo <ol><li> Re-suspender a 1-3 x 10 5 células endocervicais em 100 ul de tampão de FACS (PBS contendo 1% de albumina de soro bovino </li><li> Adicionar 1 mL / 10 6 Live / Dead fixável kit celular mancha amarela inoperante e anticorpos para marcadores de superfície nas concentrações descritas na Tabela 1. </li><li> Incubam-se as células durante 30 min a 4 ° C, protegidos da luz. </li><li> Adicionar 1 mL de tampão de FACS e as células e tubos de centrifugação durante 5 min a 350 xg </li><li> Re-suspender a pelete de células em 300 uL de paraformaldeído a 1%. </li><li> Preparar controlos de compensação usando grânulos e anticorpos utilizados para a coloração por adição de 100 uL de tampão de SCAF e uma gota de os grânulos e a mesma concentração dos anticorpos utilizados para a coloração da amostra. </li><li> Adquirir pérolas coradas e as amostras num citómetro de fluxo, equipado com 405 nm, 488 nm e 635 nm lasers. </li></ol> 4. Endocervical Gamma delta T Isolamento celular <ol><li> Isolamento esférulas magnéticas <ol><li> Re-suspender a pelete de células endocervicais (≤ 10 7 células totais), descrito em 2.6, em 40 mL de tampão incluídos no kit micropérola gama delta TCR referenciado na Tabela de Materiais e Reagentes. </li><li> Siga as instruções do kit para protocolo de coloração de duas etapas: primeiro, sagacidadeh anti TCR-delta gamma de hapteno-anticorpo e, segundo, com anti-hapteno microbeads-FITC </li><li> Após a incubação de 15 min a 4-8 ° C, lavar as células por adição de 1 ml de tampão e centrifugar a 300 xg durante 10 min. Decantar o sobrenadante por inversão do tubo, e toque em seco com a ajuda de um pedaço de papel. </li><li> Re-suspender o sedimento celular em 500 uL de tampão fornecido e preparar a coluna magnética, colocando-o num separador magnético apropriado de acordo com o protocolo do fornecedor. </li><li> Aplicar a suspensão de células na coluna e recolher células não marcadas que passam através da coluna e lavar 3x com a quantidade apropriada de tampão (500 uL). Executar passos de lavagem através da adição de tampão três vezes, cada vez que uma vez que o reservatório está vazio da coluna. Recolha efluente total. Esta é a fracção de células não marcado, negativo </li><li> Retirar a coluna do separador magnético formar e pipeta de 1 ml de tampão para a coluna e imediatamente expulsar fracção com o rótulo magneticamenteed células, aplicando firmemente o êmbolo fornecidas com a coluna. NOTA: célula isolada T gama delta já estão fluorescente corada para análise de citometria de fluxo desde marcadas magneticamente microesferas anti-hapteno são conjugados com FITC corante fluorescente. </li></ol></li><li> separação de células <ol><li> Para separação de células, as células endocervicais de etiquetas com die viabilidade e painel de anticorpos, como descrito na seção 3. </li><li> Configurar portões eletrônicos na ao vivo, CD45 + CD3 + e delta gamma células positivas e executar separação de células. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Autores não têm associação comercial ou outra, que podem representar um conflito de interesses (por exemplo, a propriedade de ações farmacêutica, consultoria, a adesão Advisory Board, patentes relevantes, ou o financiamento da investigação).

Avaliação da vulnerabilidade das mucosas do tracto genital inferior feminino é um componente essencial de estudos clínicos que abordam risco de aquisição e transmissão do HIV. Tipicamente FGT vulnerabilidade à infecção do HIV é avaliada através da medição moduladores imunitários solúveis em secreções genitais (citocinas, quimiocinas e péptidos antimicrobianos) 12, 13. No entanto, estes biomarcadores são apenas indicativos da inflamação vaginal, são afetados por ...

Nós desenvolvemos metodologia de utilização de amostras escova endocervical para avaliar células GD T intra-epitelial. O canal endocervical é recoberto por uma camada única de epitélio colunar. Linfócitos intra-epiteliais representam linfócitos linha de frente que residem na camada epitelial que podem iniciar rapidamente as respostas imunes ao encontrar micróbios patogênicos 7, 8. Compreender os eventos imunológicos do compartimento intra-epitelial endocervical é importante para a concepção de estratégias eficazes para prevenir infecções, incluindo o HIV. O nosso método pode ser aplicado a amostras endocervicais humanos recentemente recolhidos, bem como células endocervicais congelados para explorar ainda mais o papel das células T intra-epiteliais GD em mulheres com infecção por VIH ou em risco de infecção pelo HIV. O principal objectivo deste protocolo é descobrir novos eventos imunológicos no compartimento intra-epitelial endocervical e Avaliado comrespostas de células e GD T como um marcador de vulnerabilidade da mucosa em mulheres com infecção pelo HIV. As lacunas substanciais no conhecimento em torno imunidade FGT são parcialmente devido à dificuldade na recolha e processamento de amostras de mucosa com sucesso. Além disso, o complexo de heterogeneidade das células imunes das mucosas, e a sua interligação uns com os outros, são os principais desafios para a identificação de medições clinicamente relevantes que reflectem o estado e a capacidade do sistema imunitário. Nós desenvolvemos um método para obter células T GD intra-epitelial altamente purificados que podem ser analisados ​​usando tecnologias altamente multiplexados, de uma única célula que pode ser fundamental para identificar os mecanismos subjacentes da imunidade FRT.

<table><tbody><tr><td>Cytobrush Plus GT&nbsp;</td><td>(CareFusion, San Diego, CA, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMDM, Iscove's Modified Dulbecco's Medium&nbsp;</td>Contador de células automatizado <td>ThermoFisher Scientific</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter (A Série Vi-CELL Cell Cell Analyzer</td><td>Beckman Coulter</td><td>496178</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Dimetilsulfóxido&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS, Soro Fetal Bovino</td><td>Invitrogen, Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen, Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-9647</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de Mancha de Células Mortas Amarelas Fixáveis&nbsp;</td><td>Life</td> <td>Technologies,L349S9</td><td></td></tr><tr><td>1% paraformaldeído</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D6148</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo Fortessa&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads eBioscience</td><td></td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA)</td><td>Life Technologies</td><td>A10346</td><td></td></tr><tr><td>anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit&nbsp;</td><td>Milteny Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-050-701</td><td></td></tr><tr><td>Separador</td><td></td> MACS da <td></td> coluna 103-042-201 MS 4124 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e citometria de fluxo analysis of human endocervical gama cells delta t

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

O trato reprodutivo (FRT) da mucosa sistema imunológico feminino serve como a primeira linha de defesa. Melhor conhecimento da mucosa genital é, portanto, essencial para a compreensão da patogenicidade de diferentes patógenos, incluindo o HIV. Gama células delta (GD) T são o protótipo de células T &#39;não convencionais&#39; e representam um subconjunto relativamente pequeno de células T definidos pela sua expressão de receptores de células T heterodiméricos (TCRs) compostas de cadeias gama e delta. Isso os diferencia das células T clássicos e muito melhor conhecidos CD4 + auxiliares e células CD8 + T citotóxicos que são definidos por TCRs alfa-beta. GD células T muitas vezes mostram a localização específica do tecido e são enriquecidos em epitélio. GD células T orquestrar respostas imunes em inflamação, vigilância de tumores, doenças infecciosas e auto-imunidade. Aqui, apresentamos um método para isolar reprodutível e analisar linfócitos intra-epiteliais endocervicais humanos GD T. que have amostras cytobrush endocervicais usados ​​mulheres participantes Infecção Estudo Interagency HIV das Mulheres (WIHS). Conhecimento sobre GD células T interações durante as condições em que não é um insulto à mucosa vaginal poderia ser aplicada a qualquer estudo clínico em que a vulnerabilidade das mucosas são os destinatários, incluindo o desenvolvimento de adição microbicides.In vaginal, o conhecimento sobre as respostas das células da mucosa GD T tem potencial para aplicação de terapia imunitária baseada em células T GD no tratamento de doenças infecciosas.

Recentemente, analisamos células GD T intraepiteliais endocervicais e fomos o primeiro a relatar sobre a perda de células T gama delta endocervical em mulheres infectadas pelo HIV 9, 11. Aqui, descrevemos o protocolo para isolar e analisar o subconjunto de células T gama delta endocervical. Como mostrado na Figura 1, as células T GD pode ser facilmente detectado em amostras de células endocervicais humanos. <...

Descrevemos aqui um método de isolamento para obtenção de linfócitos intraepiteliais endocervicais humanos para análise de células T gama delta intraepiteliais. Este protocolo pode ser estendido para a purificação de células T gama delta endocervicais por esferas magnéticas ou por classificação de células.

Isolamento e Citometria de Fluxo Analysis of Human Endocervical Gama Cells Delta T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Os objetivos gerais deste procedimento são isolar e caracterizar uma população incomum de células intraepiteliais, células T gama delta, a partir de uma amostra de escovação endocervical humana. Este método pode ajudar a responder questões-chave na compreensão dos eventos imunológicos dentro do compartimento intraepitelial endocervical, auxiliando no desenvolvimento de estratégias eficazes para prevenir infecções. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma ferramenta poderosa e eficiente para o estudo de linfócitos T gama delta intraepiteliais endocervicais in vitro.Demonstrará o procedimento Laura Romero, uma pesquisadora sênior do meu laboratório. Imediatamente após a coleta, coloque o tubo contendo a escova citológica sobre gelo. Dentro de uma hora após a coleta, agite o tubo contendo a escova citológica em vórtex por quatro pulsos de 10 segundos.Em seguida, centrifugue o tubo e remova cuidadosamente a escova sem perturbar a palheta. Depois, adicione um mililitro de meio IMDM às células e coloque o tubo no gelo. Coloque a escova citológica sobre uma peneira celular de 100 milímetros em um tubo cônico de 50 mililitros e lave a escova com 20 mililitros de IMDM fresco

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um método para expandir células T γδ a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) é descrito. PBMC células derivadas de T γδ são estimuladas e expandida usando zoledronato e interleucina-2 (IL-2). Expansão em grande escala de células T γδ podem ser aplicadas a imunoterapia celular autóloga de câncer.

Expansão do sangue periférico humano γδ células T usando zoledronato

Este vídeo demonstra um protocolo para o isolamento baseado em marcação magnética de uma população de baixa concentração de células T CD4+Vδ1+γδ de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs). Usando uma combinação de anticorpos anti-Vδ1 conjugados com FITC, microesferas magnéticas anti-FITC e esferas superparamagnéticas revestidas com anticorpos anti-CD4, as células T CD4 + Vδ1 + podem ser purificadas com sucesso da população PBMC.

Isolamento seletivo de células T CD4+ Vδ1+ γδ de células mononucleares do sangue periférico humano

O uso de amostragem em escova citocitária para coletar linfócitos e monócitos da endocérvice é uma técnica minimamente invasiva que fornece amostras para análise da imunidade do trato genital feminino. Neste protocolo, descrevemos a coleta de amostras de cytobrush e o isolamento de células imunes para ensaios de citometria de fluxo.

Coleção, isolamento e Citometria de Fluxo de Análise de Amostras endocervix Humano

Aqui, fornecemos um protocolo otimizado para o isolamento e clonagem da escassa entidade de células T Vδ1+CD4+ periféricas que é, como mostramos recentemente, um progenitor de células T αβ extratímicas. Esta técnica permite isolar quantitativamente, clonar e expandir eficientemente essas células em cultura ex vivo.

Isolamento e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Células T, γδ um Extrathymic αβT de células progenitoras

Apresentado aqui é um método simples para o isolamento e análise de citometria de fluxo de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma que produz dados quantitativos tempo-dependente do número e estado de activação das células do sistema imunológico que entram no microambiente do tumor cerebral precoce.

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Este artigo descreve espectral citometria, uma nova abordagem em citometria de fluxo que usa as formas de espectros de emissão de distinguir fluorocromos. Um algoritmo substitui compensações e pode tratar auto-fluorescência como um parâmetro independente. Esta nova abordagem permite a análise adequada de células isoladas de órgãos sólidos.

Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

Descrevemos aqui um método para isolar e purificar as células dendríticas de diferentes compartimentos anatômicas no aparelho reprodutor feminino humano para a avaliação de suas características fenotípica e funcionais. Esse método pode ser adaptado para isolar outras células do sistema imunológico ou células dendríticas de outros tecidos da mucosa.

Isolamento de células dendríticas do tracto reprodutivo feminino humano para estudos fenotípica e funcionais

Aqui, um protocolo para o isolamento e caracterização de CD4+ células T subconjuntos do sangue periférico humano é descrito. Purificado CD4+ T-células são analisadas por citometria de fluxo para determinar proporções de subconjuntos de célula auxiliar T-folicular.

Isolamento de CD4+ T-células e análise de circulação folicular-T Helper (cTfh) célula subconjuntos de citometria de fluxo de 6 cores usando o sangue periférico

Apresentado é um protocolo para a expansão do produto de células T Gama-Delta (γδ). Os linfócitos são isolados por elutriação e enriquecidos com ácido zoledrônico e interleucina-2. As células T alfa-beta estão esgotadas usando um dispositivo de separação magnética de grau clínico. As células γδ são co-cultivadas com células derivadas de antígenos artificiais e expandidas.

Expansão e enriquecimento de células T Gama-Delta (γδ) do produto humano aferido

Este é um método para isolar células linfoides uterinas de camundongos grávidas e não grávidas. Este método pode ser usado para múltiplas aplicações a jusante, como fenotipagem FACS, classificação celular, ensaios funcionais, RNA-seq e proteômica. O protocolo aqui demonstra como fenótipo grupo 1 células linfoides inatas uterinas por citometria de fluxo.

Isolamento de células linfoides inatas uterinas para análise por citometria de fluxo

O presente protocolo descreve um fluxo de trabalho experimental que permite a análise ex vivo da estimulação de células T humanas em um sistema de co-cultura alogênica com células tumorais pré-tratadas.

Análise da atividade de células T humanas em um ambiente de co-cultura alogênica de células tumorais pré-tratadas

Aprenda a isolar e caracterizar células T gama delta intraepiteliais de amostras endocervicais humanas usando citometria de fluxo. Este método eficiente permite estudar eventos imunes in vitro para prevenção de infecções.

Isolamento e Citometria de Fluxo Analysis of Human Endocervical Gama Cells Delta T

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