In Situ Deteção e única célula quantificação de nanopartículas de óxido de Metal usando análise de microsonda Nuclear

As nanopartículas são cada vez mais utilizadas na indústria e na medicina devido às suas propriedades físico-químicas únicas. No entanto, persistem preocupações com a saúde humana associadas à exposição prolongada a nanopartículas. Esses riscos podem ser quantificados estudando o comportamento das nanopartículas dentro das células e as respostas metabólicas induzidas das células às nanopartículas.

Isso se deve em parte à falta de métodos que permitam a detecção e quantificação de nanopartículas internalizadas em uma célula síntese. Embora inúmeras ferramentas analíticas, incluindo microscopia e espectrometria de massa, possam ser usadas para estimar a absorção celular de nanopartículas, elas fornecem apenas informações qualitativas em nível microscópico. Pelo contrário, os métodos in situ baseados em espectroscopia atômica podem reduzir a quantidade de artefatos de imagem que surgem da preparação da amostra e podem produzir observação direta de nanopartículas.

Para tirar proveito disso, apresentamos uma abordagem correlativa que nos permite estudar nanopartículas no estado nativo ou no leito de laboratório com uma etiqueta fluorescente. Aqui, descrevemos um método baseado na combinação de microscopia de fluorescência e análise de microssonda nuclear. Isso fornece imagens da densidade celular, distribuição especial de elementos químicos e a quantidade de nanopartículas por célula.

Como demonstração, pesquisaremos a partir de células expostas a nanopartículas de dióxido de titânio por mais de 24 horas usando microscopia de fluorescência e análise de microssonda nuclear. Para este protocolo, é necessário um suporte de amostra personalizado feito com o polímero PEEK. Deve ser adequado para cultura celular e observações in vitro.

Cubra o suporte com uma folha de policarbonato de dois mícrons de espessura. A folha de policarbonato é colada ao prato PEEK com uma fina camada de solução Formvar. Uma vez montado, o porta-amostras precisa ser esterilizado.

Vários porta-amostras estéreis podem ser armazenados, um por poço, em uma placa estéril de doze poços até que sejam necessários para uso. As células transfectadas com plasmídeos GFP da linha de matriz são verificadas por microscopia de fluorescência para garantir que a transfecção ocorreu com sucesso e que expressam a proteína fluorescente. Colha as células com tripsina e incube-as por três minutos a 37 graus Celsius.

Pare a ação da tripsina adicionando meio de cultura fresco. Pulverizar as células por centrifugação durante cinco minutos a 1200 rotações por minuto a quatro graus Celsius. Retirar o sobrenadante e adicionar um volume adequado de meio de cultura fresco.

Contar as células e efectuar uma diluição com meio de cultura completo fresco e termostatizado para obter uma suspensão celular de 500 células por microlitro. Coloque uma gota de 40 microlitros no centro da folha de policarbonato. Coloque cuidadosamente a amostra na incubadora de células por duas horas.

Adicione delicadamente dois mililitros de meio de cultura fresco e deixe-os por 24 horas. Nanopartículas fluorescentes de óxido de titânio dimodificadas foram projetadas, sintetizadas e enxertadas com fluoróforos comumente usados para detectar, rastrear e localizar nanopartículas in vitro. Para esta etapa, uma suspensão de nanopartículas de dióxido de titânio em água ultrapura com concentração de um miligrama por mililitro já deveria ter sido preparada.

Disperse as nanopartículas usando pulsos de sonicação intensos de um minuto à temperatura ambiente. Diluir as nanopartículas em um meio de cultura apropriado para obter uma suspensão de exposição de quatro microgramas por centímetro quadrado. Mude o meio de cultura de células anterior para este novo meio contendo nanopartículas e misture-o suavemente para obter uma distribuição homogênea de nanopartículas.

Prepare um conjunto de células de controle da mesma maneira, sem a adição de nanopartículas de dióxido de titânio. Incubar as populações de células por 24 horas. Usando paraformaldeído, essas amostras podem ser fixadas e processadas para imagens in situ e de célula única usando microscopia de fluorescência.

A fixação física criogênica, no entanto, preserva a ultraestrutura celular e a integridade bioquímica. A fixação por congelamento por imersão interrompe rapidamente a atividade celular em milissegundos e evita o uso de compostos fixadores. Para fixar criogenicamente as células, realizamos o seguinte.

Prepare uma placa de transferência de alumínio resfriando-a em nitrogênio líquido. Armazene a placa em uma caixa cheia de nitrogênio líquido, mantendo a superfície da placa acima do líquido no vapor frio de nitrogênio. Resfrie uma quantidade suficiente de 2-metilbutano a 150 graus Celsius.

Prepare um Falcon de 50 mililitros com meio de cultura e dois Falcons com água ultrapura. Certifique-se de que o papel absorvente esteja próximo para secar a amostra antes de congelá-la. Enxágue as células uma vez em meio de cultura e depois mais duas vezes em água estéril e ultrapura para remover o excesso de sais remanescentes no meio de cultura.

Seque rapidamente a amostra no papel absorvente. Congele as células no 2-metilbutano resfriado por 30 segundos e coloque-as na placa de transferência de alumínio resfriada. É fundamental que a caixa seja mantida fechada o máximo possível para evitar que o vapor de água se condense na superfície da placa fria.

Após o congelamento de todas as amostras, a liofilização é realizada pelo seguinte método para sublimar qualquer água. Primeiro, execute uma dessecação primária por 12 a 24 horas em baixa pressão e baixa temperatura. Em seguida, mantendo a pressão baixa, execute uma fase de dessecação secundária por pelo menos 24 horas com a temperatura da placa aumentada para 40 graus Celsius.

Após a criofixação, as amostras podem ser armazenadas em temperatura ambiente por vários dias em condições estéreis e secas, protegidas contra poeira e umidade. A análise de microssonda nuclear foi realizada nas instalações da Ifera em Bordeaux, França. Um acelerador de partículas singletron de 3,5 megavolts fornece um feixe de íons leves na faixa de energia de megaelétron-volts.

A imagem de elementos químicos foi realizada na linha de luz da microssonda usando técnicas analíticas complementares de feixe de íons. As técnicas utilizadas através de micro-PIXE, emissão de raios-X induzida por partículas, STIM, microscopia de íons de transmissão de varredura e micro-RBS, espectrometria de retroespalhamento de rutherford. As amostras são posicionadas dentro da câmara de análise e irradiadas sob vácuo com diferentes partículas, a fim de realizar diferentes análises de feixes de íons.

O STIM é usado para registrar mapas de densidade aérea de células com base nas partículas de energia soltas que passam por regiões de células com diferentes densidades. A análise micro-PIXE e micro-RBS fornece a distribuição espacial e quantificação de elementos químicos em um nível de célula única. Um microfeixe de prótons de 1,5 megaelétron-volt é focado em um diâmetro de cerca de 1 micrômetro e é escaneado através das células de interesse, identificadas pelo STIM.

Os raios X emitidos pelos átomos presentes na amostra, variando de sódio a titânio, permitem que as concentrações elementares sejam determinadas. Os prótons retroespalhados são coletados para medir o número total de partículas de entrada necessárias para normalizar as intensidades de raios-X. É fundamental ter padrões de calibração certificados para a quantificação de concentrações elementares, a fim de calibrar a resposta do detector de raios X.

Para analisar os dados do feixe de íons, desenvolvemos um novo plugin para o ImageJ. Primeiramente, foram calculados os mapas de densidade STIM. O contraste nas imagens de microscopia de ferro de transmissão de varredura é devido a diferenças locais de densidade e permite a detecção de estruturas celulares, como o núcleo e o citoplasma.

Vários mapas podem ser processados de uma só vez. Cada mapa corresponde à energia média transmitida pelas partículas recebidas. A segunda etapa na análise de dados consiste em calcular espectros de células individuais.

A análise de emissão de raios-X induzida por partículas produz a composição química da amostra e os mapas elementares dos elementos químicos. Os mapas de elementos químicos são calculados após a classificação dos fótons de acordo com a posição do feixe no momento da gravação e a seleção de uma janela de energia centrada em torno de um elemento específico. Os mapas geralmente representam o número de eventos detectados na posição do feixe e contêm dados quantitativos.

Uma pilha de mapas químicos, um para cada elemento selecionado, é calculada. As regiões de interesse para cada célula são encontradas usando os dados PIXE para fósforo. Os espectros correspondentes a cada célula inteira são então calculados somando os espectros individuais na região de interesse de cada célula.

A partir daqui, dados quantitativos sobre abundâncias químicas em cada célula podem ser extraídos usando software de análise PIXE e IBS dedicado. Aqui mostramos imagens de fluorescência de células após a fixação do paraformaldeído. A linha superior mostra células que não foram expostas a nanopartículas de dióxido de titânio, enquanto a linha inferior foi.

O canal azul mostra o núcleo da célula, o canal verde mostra as mitocôndrias e o canal vermelho mostra o titânio. Pode-se ver claramente que nenhum dióxido de titânio está presente nos controles. Do canal fundido à direita, pode-se ver que as nanopartículas são encontradas exclusivamente no citoplasma e são excluídas das mitocôndrias.

O que falta a este método, no entanto, são informações quantitativas sobre a concentração de nanopartículas. A análise de microssonda nuclear pode esperar fornecer isso. Todas essas imagens foram tiradas usando várias técnicas de análise de microssonda.

Novamente, a linha superior mostra as células de controle e a linha inferior mostra células contendo nanopartículas de titânio. A imagem mais à esquerda mostra medições STIM da densidade das células criogenicamente fixadas. Os três painéis a seguir mostram a abundância de potássio, fósforo e titânio presentes nas células obtidas pelo PIXE.

Novamente, nenhum titânio é visível nos controles nem nos núcleos celulares. Para quantificar, célula por célula, a absorção de titânio, definimos regiões de interesse com base nos limites celulares mostrados no painel mais à direita e medimos as abundâncias elementares nessas regiões. A partir dessas medições PISHE, traçamos a distribuição de abundâncias elementares no nível de célula única para o controle e as populações expostas.

A população de controle é plotada em branco e a população exposta é plotada em amarelo. O teor médio de titânio presente aqui é bastante baixo em comparação com a dose de exposição de quatro microgramas por centímetro quadrado. A faixa de absorção de titânio mostra uma grande variação em toda a população, de 0,2 microgramas por centímetro quadrado até 1,8 microgramas por centímetro quadrado.

Também notamos um aumento de íons intracelulares livres, como potássio e cálcio, em amostras expostas a nanopartículas, sugerindo uma alteração na homeostase celular induzida pela presença de nanopartículas de dióxido de titânio. A análise de microssonda nuclear pode fornecer informações úteis no nível subcelular e fornece uma quantificação dos elementos químicos que compõem uma amostra biológica. Essas técnicas apresentam muitas vantagens.

Um, na preparação de amostras que não requer fixação química. Dois, a possibilidade de estudar áreas maiores com a capacidade de se concentrar em regiões adicionais de interesse. Terceiro, a quantificação de elementos químicos com sensibilidade de alguns microgramas por grama.

E quatro, a identificação de compartimentos celulares, como núcleo, nucléolo e citoplasma. A determinação precisa dessas, ao estudar a internalização de nanopartículas em células individuais, é essencial para a toxicologia quantitativa de nanopartículas. Como mostrado nos casos aqui estudados, a capacidade de observar e quantificar nanopartículas dentro de células individuais nos permite entender melhor o acúmulo de valor de elementos químicos endógenos e exógenos, como nanopartículas de óxido metálico.

Este protocolo destaca a adequação da análise de microssonda nuclear para estudos futuros de interação de nanopartículas com células vivas. A abordagem quantitativa fornece informações sobre o impacto dessas nanopartículas em termos de detecção, identificação, localização e quantificação, e em nível de célula única para nanopartículas nativas e modificadas quimicamente.