Metais de imagem no tecido cerebral por Laser Ablation - plasma indutivamente acoplado - Espectrometria de Massa (LA-ICP-MS)
22 de janeiro de 2017
Quantitativamente mapeamento metais no tecido por ablação a laser - indutivamente acoplado plasma - espectrometria de massa (LA-ICP-MS) é uma técnica analítica sensível que pode proporcionar uma nova visão sobre como os metais participar nos processos de função e doenças normais. Aqui, descrevemos um protocolo para imagiologia quantitativamente metais nas seções finas de tecido neurológico mouse.
O objetivo geral deste método é quantificar a distribuição espacial de metais em cortes de tecidos utilizando espectrometria de massa com plasma acoplado indutivamente e ablação a laser. Este método pode responder perguntas fundamentais da biologia básica e da pesquisa de doenças, particularmente em condições nas quais a bioquímica dos metais está envolvida na patologia da doença. A principal vantagem desta técnica é que ela preserva as informações espaciais sobre os metais, que tradicionalmente são perdidas ao se utilizarem técnicas convencionais de análise de metais em tecidos.
As implicações dessa técnica estendem-se à terapia e ao diagnóstico de doenças neurodegenerativas, pois ela nos permite monitorar como os metais mudam em regiões cerebrais que apresentam morte celular. Geralmente, pessoas novas nesse método podem ter dificuldades ao montar esses experimentos longos e complexos. A demonstração visual desse método é fundamental, já que o planejamento do experimento e a análise dos dados podem ser desafiadores, porque cada etapa deve ser executada em uma ordem específica.
Primeiro, coloque uma amostra de tecido cerebral e todos os padrões de tecido com matriz correspondente na câmara de ablação a laser. Certifique-se de que as amostras estejam dentro da profundidade de campo da câmera LACCD. Feche a porta da câmara e aperte os parafusos com os dedos.
Em seguida, no software do ICPMS, abra a válvula do gás de arraste e ajuste a vazão para 1,2 litros por minuto. No software do LA, realize uma purgação de 30 minutos da célula de ablação com o gás de arraste. Para uma célula de ablação de dois volumes, a cada dez minutos mova o estágio da amostra para cada canto da câmara para reduzir a quantidade de ar residual na célula.
Ligue o ICPMS e deixe o instrumento aquecer por duas horas. Enquanto o instrumento estiver aquecendo, no software de ablação a laser, desenhe uma linha de ablação com aproximadamente três milímetros de comprimento atravessando a superfície do primeiro padrão de tecido. Clique na linha de ablação e defina o diâmetro padrão do feixe, a velocidade de varredura e a fluência radiante.
Duplique a linha seis vezes, espaçando as linhas pelo diâmetro do feixe. Repita este processo para cada padrão. Em seguida, use a ferramenta de linha para desenhar a área de ablação sobre a amostra, partindo do canto superior esquerdo e atravessando o ponto mais largo da amostra, utilizando os mesmos parâmetros usados nos padrões.
Duplique a linha conforme necessário para cobrir completamente a amostra com o mesmo espaçamento utilizado nos padrões. Em seguida, trace um conjunto de linhas para a varredura intermitente dos padrões, não mais tarde do que 20 horas após a varredura da amostra, ou entre cada amostra. Adicione uma varredura dos padrões ao final do experimento.
Com base no comprimento da linha e na velocidade de varredura, determine o tempo de análise para as linhas da amostra e do padrão. Em seguida, crie um novo lote no software do ICPMS e selecione a análise resolvida no tempo. Escolha os valores da razão massa/carga de interesse e defina os tempos de integração para cada razão, de modo que o tempo total de integração para um ciclo seja de 0,25 segundos.
Salve o lote. Para um lote padrão, preencha o tempo de análise de cada linha com um buffer adicional de 15 segundos para considerar o tempo de aquecimento do laser e de lavagem. Defina uma lista de execução de amostras com uma aquisição para cada linha padrão.
Para o lote da amostra, duplique o lote padrão e ajuste os tempos e o número de aquisições de acordo com o padrão de ablação da amostra. Uma vez que o ICPMS tenha aquecido, adicione o primeiro lote à fila e certifique-se de que o software está aguardando um gatilho do instrumento LA. Em seguida, no software do LA, ligue a fonte de alimentação do laser e defina os tempos de aquecimento do laser e de lavagem.
Inicie a sequência do laser e verifique se o ICPMS inicia corretamente a coleta de dados após a ablação. Após a coleta dos dados, extraia os dados dos padrões dos arquivos CSV. Realize as correções de linha de base e exclua o sinal de fundo.
Identifique quedas de sinal causadas por buracos nos padrões de tecido. Mire essas áreas de sinal baixo e, em seguida, exporte os dados como uma planilha. Calcule um fator de conversão de CPS para PPM para cada elemento identificado.
Repita este processo para cada padrão. Em seguida, abra o software de construção de imagens quantitativas e importe os dados das amostras dos arquivos CSV. Selecione várias áreas do fundo para aplicar a correção de fundo.
Selecione a ferramenta de edição de gráficos, clique com o botão direito na imagem e selecione modificar a aparência da imagem. Altere a primeira cor em Z para um valor negativo grande e clique em concluído para realçar o sinal de fundo. Em seguida, na guia padrões, insira os fatores de correção CPS PPM para cada padrão e clique em ir.
Abra o navegador de dados na guia de dados, clique com o botão direito em um arquivo de imagem corrigido e clique em nova imagem. Abra a janela de modificação da aparência da imagem e defina a tabela de cores e a escala. Use o utilitário de adição de anotação para colocar uma escala de cores na imagem.
Ajuste a escala de cores na janela de escala de cores. Depois que a imagem tiver sido colorida e anotada, copie e cole a imagem em outro programa ou exporte a imagem a partir do software de montagem de imagens. Para ativar as ferramentas de ROI, selecione processamento de imagem nos pacotes de análise e escolha uma imagem.
No separador de imagem, clique em ROI e inicie o desenho de ROI. Selecione a região de interesse e, em seguida, clique em finalizar ROI. No separador de imagem, clique em estatísticas para obter os dados da ROI.
Copie e cole os dados em uma planilha, certificando-se de salvar sempre que uma ROI for adicionada. Repita o processo conforme necessário. O conteúdo e a distribuição de metais no cérebro de um camundongo tipo selvagem foram investigados utilizando esta técnica.
Aqui, as distribuições de carbono, magnésio e fósforo são mostradas em contagens por segundo. Imagens quantitativas são apresentadas para manganês, cobre, ferro e zinco. A distribuição de carbono foi utilizada como padrão interno.
O ferro era mais abundante na região medial do cérebro e no giro denteado. O zinco era mais abundante nas áreas corticais. As informações provenientes dessas imagens podem então ser utilizadas para acompanhar a expressão e a funcionalidade de proteínas ligadoras de metais. Uma vez dominado, um experimento que abrange vários dias pode ser montado em uma hora, quando realizado corretamente.
Ao realizar este procedimento, é importante sincronizar suas linhas de ablatação e seus arquivos de dados com o ICPMS. Após este procedimento, podem ser realizados métodos adicionais, como coloração histológica em seções adjacentes, a fim de fornecer informações complementares, como a colocalização de metais com proteínas específicas. Tivemos pela primeira vez a ideia para este método quando desejávamos examinar como os níveis de metais mudavam em modelos laboratoriais da doença de Parkinson.
Embora este método possa ser usado para obter informações sobre neurodegeneração, ele também pode ser aplicado a diferentes tipos de tecidos e estados patológicos, incluindo tecido humano e uma variedade de matrizes biológicas. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de neurociência examinassem como os níveis de metais mudavam tanto em amostras humanas quanto em modelos animais de doenças. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como configurar o experimento de ICPMS com ablação a laser.
Não se esqueça de que o trabalho com material biológico pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual apropriados, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para mapear quantitativamente metais em tecido neurológico de camundongo utilizando espectrometria de massa com plasma acoplado indutivamente por ablação a laser (LA-ICP-MS). Essa técnica sensível fornece informações sobre a distribuição de metais relacionada à função normal e a processos de doença.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Química Analítica
- Metalômica
Contexto
- A LA-ICP-MS preserva informações espaciais sobre metais, ao contrário dos métodos tradicionais.
- Compreender a bioquímica dos metais é essencial para a pesquisa de doenças.
- Essa técnica pode auxiliar no monitoramento de doenças neurodegenerativas.
- Demonstrações visuais são essenciais para a execução eficaz de protocolos.
Objetivo do Estudo
- Quantificar a distribuição espacial de metais em cortes de tecidos.
- Responder a questões biológicas fundamentais relacionadas ao envolvimento de metais em doenças.
- Aprimorar a compreensão das proteínas ligadoras de metais no cérebro.
Métodos Utilizados
- Preparação de amostras de tecido cerebral e padrões na câmara de ablação a laser.
- Configuração do software do ICPMS para coleta de dados.
- Realização da ablação a laser e extração de dados de arquivos CSV.
- Uso de software de construção de imagens quantitativas para análise de dados.
Resultados Principais
- A distribuição de metais como ferro e zinco foi mapeada em regiões do cérebro de camundongo.
- O ferro foi mais abundante no mesencéfalo e no giro denteado.
- A concentração de zinco foi mais elevada nas áreas corticais.
- Imagens quantitativas forneceram informações sobre a funcionalidade das proteínas ligadoras de metais.
Conclusões
- A LA-ICP-MS é uma ferramenta valiosa para o estudo da distribuição de metais em tecidos neurológicos.
- Com prática, a configuração experimental pode ser concluída de forma eficiente.
- Este método tem implicações significativas para a compreensão das doenças neurodegenerativas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A LA-ICP-MS permite a quantificação espacialmente resolvida de metais em tecido cerebral, abordando uma lacuna crítica na pesquisa de doenças neurodegenerativas, onde ocorre a desregulação da homeostase de metais em regiões anatomicamente precisas. Essa capacidade apoia a validação de alvos ao associar a distribuição de metais a vias relevantes para a doença e à expressão proteica, aumentando a confiança preditiva em modelos pré-clínicos. O método fornece dados quantitativos e de alta resolução que orientam a redução de riscos mecanicistas e a priorização de portfólios para terapêuticas moduladoras de metais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao mapear a distribuição de metais para regiões neuroanatômicas associadas à patologia da doença.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da correlação entre níveis de metais e expressão e atividade de proteínas ligadoras de metais.
- Valor Científico: Apoia a confiança preditiva ao identificar a desregulação de metais específica por região como biomarcador para estágios iniciais da doença.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente, estabelecendo a distribuição basal de metais em tecidos selvagens.
- Valor Operacional: Fornece saídas quantitativas padronizadas e reprodutíveis (PPM), essenciais para a normalização de ensaios e a preparação para triagem de compostos.
- Valor Científico: Permite avaliação confiável de compostos ao detectar alterações na homeostase de metais indicativas do engajamento do mecanismo alvo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Demonstra o alinhamento com sistemas relevantes para doenças por meio do rastreamento de alterações de metais em modelos de neurodegeneração, como a doença de Parkinson.
- Valor Operacional: Garante a continuidade translacional, desde a descoberta até a validação pré-clínica, por meio da quantificação consistente de metais em seções de tecidos.
- Valor Científico: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao identificar assinaturas fisiopatológicas baseadas em metais antes de estudos de eficácia in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem da hipótese do alvo até a identificação de compostos promissores e a validação pré-clínica, fornecendo dados espacialmente resolvidos de metais que elucidam o mecanismo biológico e a ação do composto.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao revelar o enriquecimento de metais em regiões como o mesencéfalo e o giro denteado para ferro, e áreas corticais para zinco.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas prontas para ensaios com resolução na faixa de micrômetros baixos, permitindo mapeamento reprodutível de metais em conjuntos de amostras.
- Análises: Gera dados de CPS com resolução temporal convertidos em PPM por meio de padrões, fornecendo leituras estatísticas para comparação entre grupos e determinação do tamanho do efeito.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao permitir o acompanhamento longitudinal das alterações nos metais em modelos de doenças, apoiando o alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma reutilizável para imagem de metais em diferentes tipos de tecidos e estados patológicos, reduzindo o desenvolvimento metodológico redundante.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista em vias dependentes de metais por meio da correlação espacial direta.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de padrões compatíveis com a matriz e parâmetros consistentes de ablação a laser.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção ao permitir a detecção precoce de perturbações na homeostase de metais, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados em programas do SNC.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco ao quantificar o engajamento do alvo em estratégias de modulação de metais em regiões cerebrais relevantes para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em parâmetros de ablação a laser, otimização de ICPMS e interpretação de dados de metalômica.
- Depende de instrumentação LA-ICP-MS, controle de gás de arraste e software para construção de imagens quantitativas para conversão de CPS em PPM.
- Necessita padronização entre equipes nos procedimentos de preparação de amostras, padrões de ablação e protocolos de correção de fundo.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes espessuras de tecido, composição elementar e efeitos de matriz entre espécies ou estados patológicos.
- Inclui limitações práticas, como mascaramento da queda de sinal devido à heterogeneidade do tecido e a necessidade de ciclos sequenciais de ablação padrão-amostra-padrão para manter a precisão da quantificação.
