Name: Metais de imagem no tecido cerebral por Laser Ablation - plasma indutivamente acoplado - Espectrometria de Massa (LA-ICP-MS) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprenda a mapear metais em tecido cerebral de camundongo usando LA-ICP-MS. Esta técnica quantifica a distribuição espacial de ferro e zinco, auxiliando pesquisas sobre doenças neurodegenerativas.

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DJH e PAD são suportados por um projeto Australian Research Council Linkage (LP120200081) com a Agilent Technologies e ESI Ltd. A contribuição de BK foi apoiado pela Research Escola PLUS Universidade Ruhr, financiado pela Iniciativa de Excelência da Alemanha [DFG GSC 98/3]. DJH foi parcialmente financiado pela Fundação Ramaciotti. KK é suportado pelo Juselius Fundação Sigrid.

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<li>Theiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LA-ICP-MS+imaging+in+multicellular+tumor+spheroids+-+a+novel+tool+in+the+preclinical+development+of+metal-based+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">LA-ICP-MS imaging in multicellular tumor spheroids - a novel tool in the preclinical development of metal-based anticancer drugs.</a> Metallomics. 8, 398-402 (2016).</li>
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<li>Austin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+distributions+in+teeth+reveal+early-life+dietary+transitions+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Barium distributions in teeth reveal early-life dietary transitions in primates.</a> Nature. 498 (7453), 216-219 (2013).</li>
<li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2013/ja/c3ja50281c">The effect of paraformaldehyde fixation and sucrose cryoprotection on metal concentration in murine neurological tissue.</a> J Anal At Spectrom. 29, 565-570 (2014).</li>
<li>Dodt, H. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Meth. 4 (4), 331-336 (2007).</li>
<li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation-inductively+coupled+plasma-mass+spectrometry+imaging+of+white+and+gray+matter+iron+distribution+in+Alzheimer%27s+disease+frontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging of white and gray matter iron distribution in Alzheimer's disease frontal cortex.</a> NeuroImage. 137, 124-131 (2016).</li>
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RWH e COC são funcionários remunerados da ESI Ltd. FF e TPH são funcionários remunerados da Agilent Technologies Australia.

metais de imagem em tecido neurológico é apenas um exemplo de como este protocolo pode fornecer informações úteis sobre a distribuição e quantidades de metais em qualquer matriz biológica. Embora a preparação dos materiais de referência padrão pode ser árdua, que é uma experiência que pode ser realizada uma vez e arquivadas para uso posterior. LA-ICP-MS tem certas vantagens sobre os métodos alternativos, como a microscopia de fluorescência de raios-X com base em síncrotron, principalmente em termos de acessibilidade e sensibilidade. No entanto, existem algumas desvantagens que devem ser considerados na preparação de um experimento usando LA-ICP-MS, e como tal, é muitas vezes uma técnica útil para complementar imagem química que inclui técnicas de análise de metais alternativos, bem como histoquímica comparativo 5. Alinhamento com características anatômicas conhecidas do cérebro do rato pode fornecer informações úteis sobre a possível relati funcionalonship entre os níveis de metal e distribuição espacial. Anteriormente, temos usado o recurso online Allen Brain Atlas, 29, que é um repositório de acesso aberto de ambos os dados de expressão anatómicas e genéticas no cérebro do rato C57BL / 6 para examinar a correlação espacial de ambos dependentes de metais expressão da enzima 14 e neuroanatomia 27, 30. Outros recursos, como o WorkBench Rodent Cérebro 31 também estão disponíveis para ajudar com o registo e alinhamento de imagens de metal para ajudar na identificação correta de distribuição de metal em muitas vezes pequenas regiões anatômicas. Aplicações desta técnica são úteis para avaliar os níveis de metal e como a mudança de distribuição em microescala longo de ambos os eventos de vida normais (por exemplo, envelhecimento) e em estados de doença; assim como o estudo dos efeitos de ambos os compostos e medicamentos contendo metal destinadas a me alvometabolismo tal. Os atuais principais limitações da LA-ICP-MS como uma técnica de imagem para avaliar espacialmente a distribuição de metal são rendimento e sensibilidade. Há uma troca entre a velocidade de análise e resolução espacial 5, 12, com imagens de resolução mais alta que exigem tempos de análise mais longos. A técnica é bem adequado para elementos biológicos em concentrações mais elevadas, apesar de elementos, tais como manganês, cobalto e selénio são restritas devido à sua baixa abundância em tecidos normais e / ou limitações na detecção por ICP-MS convencional. Os novos avanços na tecnologia de ICP-MS, tal como a introdução de analisadores de massa triplo quadrupolo-, para permitir a detecção de analitos alvo de difíceis, tais como o selênio 32 com sensibilidades superiores 33. Como procedimento impulsionada pela tecnologia, os avanços em ambos laser e design de espectrometria de massa vai ver isso imaging técnica continuam a evoluir, aumentandoa velocidade de análise e sensibilidade 34.

A química redox única de metais facilita uma gama de funções neurológicas, incluindo a transdução do sinal, produção de energia e síntese de neurotransmissores. Em uma série de importantes doenças neurodegenerativas, dyshomeostasis destes metais tem sido implicada tanto na patogênese da doença e identificados como novos alvos potenciais para intervenção terapêutica 1. Para entender melhor como os metais estão envolvidos em doenças como a doença de Alzheimer e de Parkinson (AD e PD, respectivamente), é imperativo para ser capaz de medir a distribuição de metal e os níveis de mudar dentro de regiões afetadas negativamente pelo processo de doença. Estas mudanças são muitas vezes indicativo de mudanças sutis nas reações bioquímicas que podem estar intimamente ligados aos processos que iniciam a morte celular, como o nosso mecanismo proposto recentemente de ferro e dopamina neurotoxicidade na DP 2. Tradicionalmente, metaníveis l dentro das regiões anatômicas definidas foi conseguida através de excisão cuidado, a digestão e análise usando uma variedade de técnicas analíticas 3. No entanto, uma tal abordagem perde informação espacial, o que pode ser crítico quando estados de doença a ser investigada, envolvem regiões bem definidas pequenas ou tipos de células específicos. Um número de métodos analíticos estão disponíveis para a visualização de metais em sistemas biológicos, a partir de amostras de tecidos intactos para secções e em duas ou três dimensões, usando espectroscopia de emissão, sondas fluorescentes e espectrometria de massa 4. Cada técnica tem vantagens e desvantagens quanto à sensibilidade, selectividade das espécies químicas, e a resolução espacial que pode ser alcançado. Para uma visão abrangente da gama de técnicas disponíveis, consulte a revisão por Hare et al. 5. Espectrometria de massa (MS) -based métodos são os mais sensíveis destas técnicas, Capaz de medir metais biologicamente mais relevantes a sua concentração nativa 6. A ablação por laser - plasma acoplado indutivamente - espectrometria de massa (LA-ICP-MS) imagiologia emprega um feixe de laser ultravioleta focada variando em tamanho desde 1 a&gt; 100 um de diâmetro (ou largura, quando uma forma do feixe quadrilátero é utilizado), sob a qual o amostra é passada 7. A informação quantitativa pode ser obtida através da ablação representativa de materiais de referência padrão, que podem ser produzidos utilizando uma variedade de diferentes abordagens 8, cada um com diferentes graus de dificuldade técnica analítica e praticidade. A abordagem mais comum utiliza-matriz correspondente, onde um padrão com uma composição química predominante comparável à da amostra é preparada por cravação com o analito-alvo e com precisão para avaliar a homogeneidade e a concentração de metais absoluto por meio de análise independentes 9, </sup&gt; 10. A ablação de padrões preparados pode, então, ser utilizado para fins de calibração externa, permitindo que os dados de concentração a partir da imagem resultante da amostra a ser extraído por pixel. A resolução da imagem é determinada tanto pelo tamanho do feixe ea velocidade com que a amostra é digitalizada. O quadrupolo-design padrão ICP-MS (que representam mais de 90% de todos os sistemas ICP-MS instalados em todo o mundo 11) é um analisador de massa seqüencial, em que os ciclos de o detector de massa por toda relação massa-carga selecionado (m / z ) em vez de coleta de dados simultaneamente. Assim, o tempo de aquisição para cada ciclo de massas deve ser igual ao tempo necessário para a amostra a percorrer uma largura do feixe de laser para garantir um representante pixel da resolução desejada é adquirido 12. seleção de tamanho de feixe de laser é um parâmetro crucial que tem efeitos significativos sobre a sensibilidade e tempo de análise total. Como physi ablação por lasercamente remove material que é arrastado para o ICP-MS por um gás portador de árgon, a quantidade de matéria que pode ser fisicamente detectados pelo analisador de massa segue a lei inversa da raiz quadrada. Por exemplo, a redução do diâmetro do feixe de laser a partir de 50 - 25 um resulta numa redução de material sujeito a ablação por um factor de quatro. Além disso, como um método de digitalização, diâmetros de feixe menores aumentam o tempo total necessário para fazer a ablação de uma área seleccionada. Portanto, design experimental é essencial para equilibrar a resolução espacial necessária com as necessidades de sensibilidade e limitações de tempo. Imagiologia por LA-ICP-MS foi aplicado a uma gama de amostras, as matrizes e estados de doença, incluindo modelos animais de desordens neurológicas 13, 14, lesão cerebral traumática 15, a distribuição, a exposição tóxico fármacos anticancerígenos 16 contendo metal na placenta 17 e de metal distribution em dentes como um biomarcador de transições alimentares do início da vida. 18 Neste protocolo, descrevem um método geral para a imagiologia de ferro, cobre e zinco no cérebro do rato WT a uma resolução de 30 um, embora possa ser facilmente adaptado para uma variedade de tipos de amostras e os resultados experimentais, com base nas necessidades do analista.

<table><tbody><tr><td>Lâminas de microscópio de vidro de soda</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>As lâminas típicas são adequadas para todas as experiências</td></tr><tr><td>Lâminas de micrótomo revestidas com PTFE</td><td>C.L. Stuckey</td><td>DT315R50</td><td>O tamanho da lâmina depende do suporte da lâmina do criostato. Verifique antes de encomendar.</td></tr><tr><td>Parafomaldeído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td>Qualquer fornecedor adequado</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>O açúcar branco de grau comercial é adequado</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>Sachês pré-misturados listados, podem ser preparados de acordo com os protocolos normais de laboratório</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>247624</td><td>Qualquer fornecedor adequado</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Qualquer fornecedor adequado</td></tr><tr><td>Cérebro de cordeiro</td><td>n/a</td><td>n/a Disponível</td><td>na maioria dos açougueiros locais</td></tr><tr><td>Sais metálicos</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Use sais metálicos solúveis em água contendo analitos desejados</td></tr><tr><td>Homogeneizador de Tecidos Omni TH</td><td>Omni Inc</td><td>THP115</td><td>Homogeneizadores alternativos são adequados</td></tr><tr><td>Sondas homgenizer de policarbonato</td><td>Omni Inc</td><td>TH115-PCRH</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de digestão por microondas</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Opcional. Consulte a Seção 2</td></tr><tr><td>Tubos de microfuga de 1,5 mL</td><td>TechnoPlas</td><td>P4010</td><td>Tubos de polipropileno sem metal. Os tubos lavados com ácido também são adequados</td></tr><tr><td>65% ácido nítrico</td><td>Merk Millipore</td><td>100441</td><td>Grau</td></tr><tr><td>de análise de traços 30% de peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95321</td><td>Grau de análise de traços</td></tr><tr><td>10 x 10 mm criomoldes descartáveis</td><td>Ted Pella</td><td>27181</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76871</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio líquido</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Uso fornecedor local</td></tr><tr><td>NWR213 Sistema de ablação a laser</td><td>ESI Ltd</td><td>n / a</td><td>Usado nesses experimentos. Outros fabricantes adequados, podem exigir modificações no protocolo</td></tr><tr><td>Agilent Série 8800 ICP-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>n/a</td><td>Usado nesses experimentos. Outros fabricantes adequados, podem exigir modificações no protocolo</td></tr><tr><td>Iolite</td><td>Iolite Software</td><td>n/a</td><td>Disponível a partir de http://iolite-software.com/. Outros métodos estão disponíveis, consulte o protocolo</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>IGOR Pro</td><td>Wave Metrics</td><td>n/a</td><td>Disponível a partir de https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm</td></tr></tbody></table>

metais de imagem no tecido cerebral por laser ablation - plasma indutivamente acoplado - espectrometria de massa (la-icp-ms)

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Os metais são encontradas ao longo de um organismo ubiquamente, com o seu papel biológico tanto ditada pela sua reactividade química e abundância dentro de uma região anatómica específicas. Dentro do cérebro, metais têm uma distribuição altamente compartimentada, dependendo da função primária que desempenham no sistema nervoso central. Imagem da distribuição espacial dos metais forneceu visão única da arquitectura bioquímica do cérebro, o que permite uma correlação directa entre as regiões neuroanatomical e a sua função conhecida no que diz respeito a processos dependentes de metais. Além disso, várias doenças neurológicas relacionadas com a idade apresentam perturbado homeostase metal, que é muitas vezes confinados a pequenas regiões do cérebro que são de outra maneira difícil de analisar. Aqui, descrevemos um método abrangente para imagiologia quantitativamente metais no cérebro do rato, usando ablação a laser - plasma indutivamente acoplado - espectrometria de massa (LA-ICP-MS) e processamento de imagem especialmente concebidoProgramas. Concentrando-se em ferro, cobre e zinco, que são três dos metais mais abundantes e doenças relevantes dentro do cérebro, descrevemos os passos essenciais na preparação da amostra, análise, medições quantitativas e processamento de imagem para produzir mapas de distribuição de metal dentro da baixa micrômetro faixa de resolução. Esta técnica, aplicável a qualquer secção de corte de tecido, é capaz de demonstrar a distribuição altamente variável de metais dentro de um órgão ou sistema, e pode ser utilizada para identificar alterações na homeostase de metal e os níveis absolutos no interior de estruturas anatómicas finas.

Para demonstrar as capacidades desta abordagem de imagem LA-ICP-MS, um experimento simples com uma única seção de um / 6 cérebro do rato WT C57BL, dividido em corpo caloso e seccionados no plano coronal, é apresentado. Um fluxo de trabalho para a análise de dados usando BioLite (Figura 1), tal como descrito nas Secções 6 e 7, bem como para fornecer uma imagem representativa da distribuição do metal na secção de analisado (Figura 2) é também descrita. Como pode ser visto, a distribuição de metal no cérebro do rato é variável de acordo com a região anatómica. Isto pode ser atribuído aos metais papéis variáveis, e mais especificamente as proteínas a que ambos se ligam, desempenham em cada região do cérebro 27. Por exemplo, ferro tende a ter concentrações mais elevadas no mesencéfalo e ao longo do giro dentado, enquanto que o zinco é o mais abundante no Cortiáreas cal. Carbono, que é um padrão interno utilizada 8, está distribuída de forma homogénea. Mapas elementar (Figura 2) pode ser particularmente útil quando usado em conjunto com o atlas anatómicos e funcionais existentes de Referência 29, em que a informação sobre a co-localização de metais pode a expressão de proteínas específicas de ligação a metais pode fornecer informações sobre a função de metais dentro de um cérebro região ou mudanças nos níveis de metal em linha com uma biomolécula relacionada com a doença identificada. Utilizando a abordagem descrita, que é optimizado para uma gama mais ampla de analitos, se opõe a sensibilidade para os elementos de baixa abundância, tais como o manganês, e métodos podem ser adaptados a centrar-se essencialmente sobre este analito, aumentando os tempos de retenção em detrimento de outras massas medidas. A principal vantagem na utilização de imagens por LA-ICP-MS está observando diferenças relativas de concentr de metalção e distribuição entre os grupos experimentais. Temos anteriormente utilizada uma tal técnica a demonstrar o aumento de ferro na sequência de um insulto neurotoxina imitando PD 2, 10, e as alterações dos níveis de ferro no tecido cortical da doença de Alzheimer humana 21. um protocolo tal como descrito aqui pode ser facilmente adaptado a qualquer outro tipo de tecido com alterações mínimas para os métodos listados. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55042/55042fig1.jpg" /> Figura 1: Fluxo de trabalho para processamento de imagens. Fluxo de trabalho complementar com as Secções 6 e 7, que descrevem a conversão de dados em tempo-prima resolvidos a partir do ICP-MS para imagens quantitativas de distribuição de metal no cérebro do rato. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55042/55042fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </p&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55042/55042fig2.jpg" /> Figura 2: Distribuição elementar típica de Biometals dentro de um mouse cérebro. mapas de elementos representativos de uma secção coronal 30 mm de espessura de um único hemisfério cerebral do rato analisados ​​com LA-ICP-MS. Imagens para carbono-13 (C13), magnésio-24 (MG24) e fósforo-31 (P31) exibidos em escalas de ouro de cor (contagens por segundo; CPS) (linha superior). Imagens quantitativos (linha inferior) para o manganês-55 (Mn55), cobre-63 (Cu63), ferro-56 (Fe56) e zinco-66 (Zn66) exibido com correspondentes escalas de cores BlueHot (mg g -1). O tempo total de análise para a secção de cérebro foi de aproximadamente 5 horas. Barra de escala = 2 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55042/55042fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <strong&gt; Código Complementar arquivo 1. código Python Open-source com o ponto 6.1, que pode ser modificado utilizando um editor de Python apropriado de acordo com o método de saída de dados do fabricante ICP-MS. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55042/CopyFilesFromSubDirs_3.txt" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.</a>

Quantitativamente mapeamento metais no tecido por ablação a laser - indutivamente acoplado plasma - espectrometria de massa (LA-ICP-MS) é uma técnica analítica sensível que pode proporcionar uma nova visão sobre como os metais participar nos processos de função e doenças normais. Aqui, descrevemos um protocolo para imagiologia quantitativamente metais nas seções finas de tecido neurológico mouse.

Metais de imagem no tecido cerebral por Laser Ablation - plasma indutivamente acoplado - Espectrometria de Massa (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

O objetivo geral deste método é quantificar a distribuição espacial de metais em cortes de tecidos utilizando espectrometria de massa com plasma acoplado indutivamente e ablação a laser. Este método pode responder perguntas fundamentais da biologia básica e da pesquisa de doenças, particularmente em condições nas quais a bioquímica dos metais está envolvida na patologia da doença. A principal vantagem desta técnica é que ela preserva as informações espaciais sobre os metais, que tradicionalmente são perdidas ao se utilizarem técnicas convencionais de análise de metais em tecidos.As implicações dessa técnica estendem-se à terapia e ao diagnóstico de doenças neurodegenerativas, pois ela nos permite monitorar como os metais mudam em regiões cerebrais que apresentam morte celular. Geralmente, pessoas novas nesse método podem ter dificuldades ao montar esses experimentos longos e complexos. A demonstração visual desse método é fundamental, já que o planejamento do experimento e a análise dos dados podem ser desafiadores, porque cada etapa deve ser executada em uma ordem específica.Primeiro, coloque uma amostra de tecido cerebral e todos os padrões de tecido com matriz correspondente na câmara de ablação a laser. Certifique-se de que as amostras estejam dentro da profundidade de campo da câmera LACCD. Feche a porta da câmara e aperte os parafusos com os dedos.Em seguida, no software do ICPMS, abra a válvula do gás de arraste e ajuste a vazão para 1,2 litros por minuto. No software do LA, realize uma purgação de 30 minutos da célula de ablação com o gás de arraste. Para uma célula de ablação de dois volumes, a cada dez minutos mova o estágio da amostra para cada canto da câmara para reduzir a quantidade de ar residual na célula.Ligue o ICPMS e deixe o instrumento aquecer por duas horas. Enquanto o instrumento estiver aquecendo, no software de ablação a laser, desenhe uma linha de ablação com aproximadamente três milímetros de comprimento atravessando a superfície do primeiro padrão de tecido. Clique na linha de ablação e defina o diâmetro padrão do feixe, a velocidade de varredura e a fluência radiante.Duplique a linha seis vezes, espaçando as linhas pelo diâmetro do feixe. Repita este processo para cada padrão. Em seguida, use a ferramenta de linha para desenhar a área de ablação sobre a amostra, partindo do canto superior esquerdo e atravessando o ponto mais largo da amostra, utilizando os mesmos parâmetros usados nos padrões.Duplique a linha conforme necessário para cobrir completamente a amostra com o mesmo espaçamento utilizado nos padrões. Em seguida, trace um conjunto de linhas para a varredura intermitente dos padrões, não mais tarde do que 20 horas após a varredura da amostra, ou entre cada amostra. Adicione uma varredura dos padrões ao final do experimento.Com base no comprimento da linha e na velocidade de varredura, determine o tempo de análise para as linhas da amostra e do padrão. Em seguida, crie um novo lote no software do ICPMS e selecione a análise resolvida no tempo. Escolha os valores da razão massa/carga de interesse e defina os tempos de integração para cada razão, de modo que o tempo total de integração para um ciclo seja de 0,25 segundos.Salve o lote. Para um lote padrão, preencha o tempo de análise de cada linha com um buffer adicional de 15 segundos para considerar o tempo de aquecimento do laser e de lavagem. Defina uma lista de execução de amostras com uma aquisição para cada linha padrão.Para o lote da amostra, duplique o lote padrão e ajuste os tempos e o número de aquisições de acordo com o padrão de ablação da amostra. Uma vez que o ICPMS tenha aquecido, adicione o primeiro lote à fila e certifique-se de que o software está aguardando um gatilho do instrumento LA. Em seguida, no software do LA, ligue a fonte de alimentação do laser e defina os tempos de aquecimento do laser e de lavagem.Inicie a sequência do laser e verifique se o ICPMS inicia corretamente a coleta de dados após a ablação. Após a coleta dos dados, extraia os dados dos padrões dos arquivos CSV. Realize as correções de linha de base e exclua o sinal de fundo.Identifique quedas de sinal causadas por buracos nos padrões de tecido. Mire essas áreas de sinal baixo e, em seguida, exporte os dados como uma planilha. Calcule um fator de conversão de CPS para PPM para cada elemento identificado.Repita este processo para cada padrão. Em seguida, abra o software de construção de imagens quantitativas e importe os dados das amostras dos arquivos CSV. Selecione várias áreas do fundo para aplicar a correção de fundo.Selecione a ferramenta de edição de gráficos, clique com o botão direito na imagem e selecione modificar a aparência da imagem. Altere a primeira cor em Z para um valor negativo grande e clique em concluído para realçar o sinal de fundo. Em seguida, na guia padrões, insira os fatores de correção CPS PPM para cada padrão e clique em ir.Abra o navegador de dados na guia de dados, clique com o botão direito em um arquivo de imagem corrigido e clique em nova imagem. Abra a janela de modificação da aparência da imagem e defina a tabela de cores e a escala. Use o utilitário de adição de anotação para colocar uma escala de cores na imagem.Ajuste a escala de cores na janela de escala de cores. Depois que a imagem tiver sido colorida e anotada, copie e cole a imagem em outro programa ou exporte a imagem a partir do software de montagem de imagens. Para ativar as ferramentas de ROI, selecione processamento de imagem nos pacotes de análise e escolha uma imagem.No separador de imagem, clique em ROI e inicie o desenho de ROI. Selecione a região de interesse e, em seguida, clique em finalizar ROI. No separador de imagem, clique em estatísticas para obter os dados da ROI.Copie e cole os dados em uma planilha, certificando-se de salvar sempre que uma ROI for adicionada. Repita o processo conforme necessário. O conteúdo e a distribuição de metais no cérebro de um camundongo tipo selvagem foram investigados utilizando esta técnica.Aqui, as distribuições de carbono, magnésio e fósforo são mostradas em contagens por segundo. Imagens quantitativas são apresentadas para manganês, cobre, ferro e zinco. A distribuição de carbono foi utilizada como padrão interno.O ferro era mais abundante na região medial do cérebro e no giro denteado. O zinco era mais abundante nas áreas corticais. As informações provenientes dessas imagens podem então ser utilizadas para acompanhar a expressão e a funcionalidade de proteínas ligadoras de metais. Uma vez dominado, um experimento que abrange vários dias pode ser montado em uma hora, quando realizado corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante sincronizar suas linhas de ablatação e seus arquivos de dados com o ICPMS. Após este procedimento, podem ser realizados métodos adicionais, como coloração histológica em seções adjacentes, a fim de fornecer informações complementares, como a colocalização de metais com proteínas específicas. Tivemos pela primeira vez a ideia para este método quando desejávamos examinar como os níveis de metais mudavam em modelos laboratoriais da doença de Parkinson.Embora este método possa ser usado para obter informações sobre neurodegeneração, ele também pode ser aplicado a diferentes tipos de tecidos e estados patológicos, incluindo tecido humano e uma variedade de matrizes biológicas. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de neurociência examinassem como os níveis de metais mudavam tanto em amostras humanas quanto em modelos animais de doenças. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como configurar o experimento de ICPMS com ablação a laser.Não se esqueça de que o trabalho com material biológico pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual apropriados, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Laser de ionização electrospray ablação (LAESI) é uma fonte de íons na atmosfera de pressão para a espectrometria de massa. No modo de imagem, um sondas de laser infravermelho médio das distribuições de moléculas através de uma secção de tecido ou de um biofilme. Esta técnica apresenta uma nova abordagem para diversos estudos bioanalíticos realizadas sob condições experimentais nativa.

Pressão atmosférica Imagem Molecular de tecidos biológicos e Biofilmes por LAESI Espectrometria de Massa

Fonte: Hare, D. J., et.al.  Imagem de metais no tecido cerebral por ablação a laser - plasma indutivamente acoplado - espectrometria de massa (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra o uso de espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado por ablação a laser (LA-ICP-MS) para visualizar e quantificar as distribuições de metais no tecido cerebral de camundongos. O protocolo envolve ablação a laser para gerar um aerossol de partículas de amostra, ionização das partículas em...

Espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado por ablação a laser para visualizar metais no tecido cerebral de camundongos

Ditranol (DT; 1,8-di-hidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) foi previamente relatada como uma matriz de DLAMI para a imagiologia de tecido de pequenas moléculas; protocolos para a utilização de DT para a imagiologia de MALDI de lípidos endógenos na superfície de cortes de tecido por positivo-ion MALDI-MS em um ultra-alta resolução quadrupolo-FTICR instrumento são fornecidos aqui.

Dithranol como Matrix Assisted Laser Matrix para dessorção / ionização de imagem em um Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Espectroscopia de decomposição induzida por laser realizada em órgão fina e tecido do tumor detectado com sucesso elementos naturais e gadolínio injetado artificialmente (Gd), emitidos a partir de nanopartículas à base de Gd. Imagens de elementos químicos atingiu uma resolução de 100 um e sensibilidade quantitativa sub-mM. A compatibilidade da instalação com microscopia óptica padrão enfatiza seu potencial para fornecer várias imagens de um mesmo tecido biológico.

Induzida por laser Breakdown Spectroscopy: Uma Nova Abordagem para Mapeamento e Quantificação de nanopartículas em Organ Tissue

A cromatografia de exclusão de tamanho hifenizada com plasma indutivamente acoplado - espectrometria de massa (ICP-MS) é uma ferramenta poderosa para medir mudanças na abundância de metaloproteínas diretamente de amostras biológicas. Aqui descrevemos um conjunto de padrões de metaloproteínas usados para estimar a massa molecular e a quantidade de metal associada a proteínas desconhecidas.

Normas para Análise Quantitativa Metalloproteomic Usando Tamanho Exclusão ICP-MS

Uma fonte de imagem de espectrometria de massa (MSI) operada à pressão atmosférica foi desenvolvida acoplando dessorção a laser de infravermelho médio e pós-ionização por eletrospray. A matriz de gelo exógena foi usada como matriz de absorção de energia para facilitar a dessorção ressonante do material relacionado ao tecido. Este manuscrito fornece um protocolo passo a passo para a realização de IR-MALDESI MSI de camundongos neonatais de corpo inteiro.

Whole-body Espectrometria de Massa de imagem por infravermelhos matriz assistida por laser de Dessorção Ionização por Electrospray (IR-MALDESI)

Imagem molecular com laser assistida por matriz baseada em ionização/dessorção de imagem espectrometria de massa (MALDI-IMS) permite o mapeamento simultâneo de vários analitos em amostras biológicas. Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e visualização da proteína β amiloide nos tecidos do cérebro de doença de Alzheimer e amostras de Angiopatia amiloide cerebral usando MALDI-IMS.

Visualização dos depósitos β amiloide no cérebro humano com Matrix-assisted Laser dessorção/ionização de imagem espectrometria de massa

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho para visualização sub-mm 2D de múltiplas espécies de nutrientes inorgânicos labile e súute contaminante usando gradientes difusivos em filmes finos (DGT) combinados com imagens de espectrometria de massa. A amostragem de soluto e a análise química de alta resolução são descritas em detalhes para mapeamento quantitativo de solutos na rizosfera das plantas terrestres.

Visualização bidimensional e quantificação de labile, nutrientes vegetais inorgânicos e contaminantes no solo

Farmacoterapia de reposição de dopamina uso de L-DOPA é o tratamento mais comumente utilizado sintomático da doença de Parkinson, mas é acompanhado por efeitos secundários, incluindo movimentos involuntários anormais, discinesia...

Espectrometria de Massa MALDI imagem de neuropeptídeos na Doença de Parkinson

O objetivo desta técnica é avaliar a função da serotonina neurotransmissora (5-HT) no animal vivo e respirando sem a ressonância magnética farmacológica (phMRI) e um desafio intravenoso com um inibidor seletivo da recaptação da serotonina (ISRS), a fluoxetina.

O Uso de desafio-Farmacológicas fMRI em pesquisa pré-clínica: aplicação ao sistema 5-HT

Aprenda a mapear metais em tecido cerebral de camundongo usando LA-ICP-MS. Esta técnica quantifica a distribuição espacial de ferro e zinco, auxiliando pesquisas sobre doenças neurodegenerativas.

Metais de imagem no tecido cerebral por Laser Ablation - plasma indutivamente acoplado - Espectrometria de Massa (LA-ICP-MS)

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