Name: Um Modelo para Perineural Invasion em cabeça e pescoço carcinoma espinocelular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprenda a avaliar rapidamente condições de tratamento para invasão perineural em carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço usando ganglios da raiz dorsal de camundongos. Este método oferece alta reprodutibilidade.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado integralmente por financiamento do NIH por meio da bolsa R21, "Mecanismos de Invasão Perineural no Câncer de Cabeça e Pescoço" e da bolsa de treinamento NCI T32, "Treinamento em Pesquisa de Pós-Doutorado em Oncologia de Cabeça e Pescoço (2T32CA060397-21)". Obrigado a Richard Steiman, MD, PhD e equipe do laboratório.

1. Preparação do Meio de Cultura e pratos (10 min) <ol><li> Adicionar 100 uL de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com soro fetal bovino a 10% (FBS) aos poços de uma placa de 96 poços de fundo em V. </li><li> Remover um pré-aliquotadas-ampola de, aproximadamente, 100 mL de matriz semi-sólida a partir do congelador 20 ° C e colocá-lo directamente em gelo. NOTA: Para fazer isso, antes da colheita de gânglio da raiz dorsal (DRG), porque a matriz semi-sólido leva cerca de 30 minutos para atingir o estado líquido em gelo, a qual é necessária para os passos subsequentes. A falha em manter a matriz semi-sólida de gelo em todo o tempo vai resultar uma gotícula de matriz de má qualidade. </li><li> Etiqueta de vidro de fundo culturas placas com tinta permanente, criando identificadores únicos em cada um dos quatro cantos na superfície inferior da placa. Coloque as placas do lado direito para cima no gelo para esfriar a superfície da placa. NOTA: Rendimento de cada ratinho 32 - 40 DRG, assim classificá-los a partir de 1 a 40. Não é necessário pré-pi friopet dicas, como dicas refrigerados vai aquecer ao longo de colocação das gotículas de matriz, potencialmente introduzir diferenças de consistência da matriz. </li></ol> 2. Dissecção de Murino DRG (45 min) <ol><li> Eutanásia um ratinho nu atímicos de acordo com protocolos laboratoriais específicos, tais como através da utilização de uma câmara de CO 2 e uma toracotomia. </li><li> Definir a área de dissecção e microscópio. Use o lado limpo, esterilizado, e plana de recipientes de poliestireno para 15 ou tubos cônicos de 50 mL. NOTA: Para além disso, eles são adequados para utilização como superfície de dissecação, uma vez que são de baixo custo, descartável, e permitir a fixação da coluna vertebral utilizando pinos ou agulhas. Utilize apenas os instrumentos e agulhas esterilizadas. </li><li> Sob a visão natural, faça uma incisão longitudinal ao longo da coluna vertebral a partir da raiz da cauda para a cabeça do rato com um par de tesouras finas retas ou curvas. </li><li> Use as mesmas tesouras para dividir transversalmente abaixo do sacral espinha. Dissecar ambos os lados da coluna vertebral todo o caminho até à base do crânio usando a tesoura. Neste ponto, garantir que a coluna cervical é seccionado cranialmente, tanto quanto possível, com uma tesoura. </li><li> Observar a extremidade cervical da coluna vertebral sob o microscópio de operação a baixa potência. A medula espinhal branco é aparente no meio de um anel ósseo, que está rodeado por quantidades variáveis ​​de músculos paraespinhais e tecido mole. </li><li> Dividir a dorsal ou aspecto superior dos primeiros 2 - 3 corpos vertebrais com uma tesoura primavera microscópicas. Usando a acção de mola a tesoura, abrir esta óssea inicial corte para garantir que o corpo vertebral dissecção ocorreu na linha média. Continue em pequenos incrementos para a coluna sacral, e depois bissetriz a coluna vertebral através do preenchimento dos cortes idênticos no aspecto ventral ou inferior dos corpos vertebrais. Observação: A falha de assegurar a dissecção da linha média da coluna vertebral óssea irá resultar num rendimento mais baixo de DRG. </li><li> No this ponto, a coluna vertebral é dividido em duas metades. Coloque um hemi-espinha de lado, com a medula espinhal no lugar e virado para baixo em uma placa estéril. NOTA: Deixando a medula espinhal no local vai impedir que os DRGs de secar, como os DRGs são profundas para a medula espinhal. </li><li> Fixe cada extremidade da outra hemi-coluna, com duas agulhas 18-gauge na plataforma de poliestireno dissecando. Começando na extremidade cervical (que é evidente porque a coluna vertebral é mais estreita, o DRG estão mais próximos um do outro, e existem inserções RIB), suavemente descascar a medula espinal a partir de cerca de quatro níveis vertebrais. </li><li> Observe os nervos sensoriais (geralmente dois) que ligam o DRG. Na área onde os nervos inserir no DRG, suavemente agarrar as fascia circundantes com pinças microscópicas. Dissecar e aparar essa fáscia e outros tecidos nervosos com a tesoura primavera microscópicas para liberar o DRG. retração gentil trará o DRG fora de sua posição dentro da coluna vertebral óssea. NOTA: O aumento dapoder microscópio neste passo é benéfico. Lesão por esmagamento com o DRG vai limitar significativamente o crescimento de neurites. Isto é evitado por não compreender a DRG diretamente, mas sim segurando os fáscia circundantes. </li><li> Cortar o nervo periférico (DRG tem geralmente um nervo periférico, que é profundo em relação à visualização de dissecação) com a tesoura primavera microscópicos para libertar o DRG. NOTA: É mais fácil determinar onde as extremidades dos nervos e o DRG começa quando em tensão, tornando assim este corte o mais próximo possível para o DRG neste momento é o ideal. Uma vez que este ramo distal é cortado, os ramos são cortados proximais bem. </li><li> Apare o DRG de quaisquer fibras nervosas perdidas ou anexos fasciais com a tesoura primavera microscópicas. Após o isolamento adequado, colocar o DRG para o meio à temperatura ambiente no interior da placa de 96 poços de fundo em V. NOTA: Colocar um fundo escuro por baixo da placa faz visualizar o sub-mm DRGs brancos mais fácil. Apenas coloque um DRG em each bem; Desta forma, eles podem ser explicados mais facilmente nas etapas subsequentes. </li><li> Repita esse processo até o fim de um hemi-coluna e depois o outro. Cada lado resulta em 16 - 20 DRGs, num total de 32 - 40. NOTA: Se houver menos DRGs do que isso, a dissecção da coluna precisa ser realizada ainda mais cefálica e / ou caudal. Os DRGs se tornado cada vez menos bem definida como uma prossegue caudalmente. </li></ol> 3. Preparação de Queijos Matrix Gotas (&lt;1 min por placa) <ol><li> Remova uma placa de vidro bem inferior de gelo e coloque-o em um bloco de gelo sob o microscópio cirúrgico. Certifique-se a alíquota de matriz permanece em gelo em todos os momentos. </li><li> Coloque uma gota de 1,5 mL de matriz em cada um dos quatro cantos da placa de vidro de fundo com a 2 uL ou 10 uL micropipetter, deixando uma distância pelo menos tão grande como a própria gotícula a partir da borda do vidro bem. <ol><li> Colocar a ponta da pipeta directamente sobreo vidro a um ângulo de 45 graus. Lentamente pipeta da matriz. Lentamente, afastar-se do fundo de vidro após a matriz está envolvida na placa. NOTA: A tensão superficial entre a matriz de vidro e deve criar um hemisfério perfeito de cada vez. </li><li> Pare pipetando pouco antes de a ponta está vazia, porque a injecção inadvertida de ar para dentro da gotícula da matriz faz com que o diâmetro da gotícula de matriz muito maior e é difícil de remover. NOTA: Usando uma segunda mão para estabilizar a mão pipetagem facilita a colocação mais precisa. </li></ol></li></ol> 4. Inserção de DRG em semi-sólidas Matrix Gotas (&lt;2 min por placa) <ol><li> Deixar a placa com as gotículas de matriz rapidamente à temperatura ambiente (~ 1 min). Isto endurece ligeiramente a matriz, tornando-se mais fácil para o posicionamento preciso do DRG. </li><li> Colher (não entender) o DRG delicadamente com uma pinça microscópicas fechadas na mão esquerda. Mais uma vez, um fundo escuro contra o pequeno, brancoDRG facilita a visualização. Transferir o DRG para a ponta de uma agulha de calibre 21 com a mão direita. Esta transferência vai deixar meios residual sobre a pinça. </li><li> Suavemente inserir o DRG para o meio da gotícula da matriz, utilizando a agulha de calibre 21 (Figura 1). Na maioria das vezes, o DRG vai libertar facilmente na matriz e, em seguida, pode ser posicionada centralmente com a agulha. <ol><li> Se o DRG adere à agulha, utilizar a pinça microscópicas para empurrar o DRG fora da agulha e para dentro da gota de matriz. Wick media o excesso de pinças microscópicas com um laboratório de limpar. NOTA: Apresentando mídia para a matriz irá alterar o diâmetro, volume e consistência do ensaio. Um bloco de gelo com cor ou escrita colorido proporciona um contraste de fundo, o que facilita a visualização deste processo delicado. </li></ol></li><li> Depois de a placa tem todos os quatro DRGs, efectuar uma inspecção final para garantir que o DRG está no centro da gota de matriz. fazer ajustesconforme necessário, com a agulha 21-gauge. </li><li> Transferir a placa preenchido para uma temperatura de 37 ° C incubadora. Isso vai solidificar a matriz semi-sólida e corrigir o DRG na posição. </li><li> Repita esse processo para todos os DRGs. Coloque gotículas de matriz em branco sem um DRG, como controlo negativo. </li><li> Adicionar 4 ml de DMEM com 10% de meio FBS a cada placa com fundo de vidro depois de completar todas as placas e expondo-os a 37 ° C incubadora durante pelo menos 3 min. Coloque a placa em um ângulo ligeiro e adicionar lentamente o meio, de tal modo que, gradualmente, entra em contato com as unidades de matriz de DRG. NOTA: Se o meio é adicionado demasiado depressa ou vigorosamente, a matriz e / ou DRG pode tornar-se desalojado. </li><li> Armazenar os ensaios in a 37 ° C incubadora para a próxima 48-72 h. NOTA: exame periódico dos ensaios mostrará excrescência de neurites circunferencial na direcção da extremidade da matriz (Figura 2). Quando as neurites são maiores do que três quartos do caminho para a matriz, eleé apropriado para a chapa das células. </li></ol> 5. Preparação da Cabeça e Pescoço Cancer Cells NOTA: outros do que a cabeça e as células carcinoma de células escamosas do pescoço As linhas celulares podem ser usados ​​neste projeto experimental. <ol><li> Manter linhas de carcinoma de células escamosas de células em DMEM com 10% de FBS em frascos preferidos ou pratos de cultura num banho a 37 ° C incubadora. Para preparar as células para a experimentação, a aspiração todo o meio do frasco de cultura ou prato e lavá-lo duas vezes com PBS. Suspender as células por adição de uma quantidade apropriada de 0,025% de tripsina durante 5 minutos, seguido por DMEM com FBS a 10%. Pipeta 4 mL da mistura de células e meios de cultura em placas de 6 mL. NOTA: uma placa de cultura de 6 mL fornece mais do que suficiente de células, mesmo quando menos de 50% confluente. </li><li> Expor as linhas de células de carcinoma epidermóide para diferentes condições de 24 h antes da coloração e plaqueamento em ensaio DRG. Re-dosear a condição uma vez que as células são plaqueadas a manter uma environme consistentent. NOTA: Adicionar anticorpos, factores de crescimento, citoquinas, ou outras moléculas para as placas de cultura de célula de 1 - 2 dias após dissecção ratinho e implantação do DRG na matriz. </li><li> Adicionar manchas de células fluorescentes 1 h antes de plaqueamento das células (2 - 3 dias após a colheita e DRG implantação na matriz). NOTA: As manchas particulares utilizados aqui passar livremente através da membrana celular; No entanto, depois de reagir com grupos tiol intracelular, a mancha permanece no interior da célula e é passado para as células filhas. A coloração facilita grandemente visualização dentro dos ensaios. Estas manchas temporárias são ideais para estes ensaios, porque a fluorescência está presente durante 2 - 3 dias, que é o prazo destas experiências. Também permite o uso de muitas cores diferentes e obvia a necessidade para a criação de linhas de células transfectadas com proteínas fluorescentes. <ol><li> Preparar 10 uM de solução de corante por mistura de 2 ul de 10 mM de manchas de células estoque em 2 mL de DMEM isento de soropara cada condição de celular. Aquecer esta a 37 ° C antes de adicionar às células. </li><li> Remover o meio de cultura no interior da placa de 6 ml, deixando as células aderentes CECP na placa. Adicionar 2 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 2 ml de remover a mancha de células DMEM 10 uM / isento de soro, adicionado a cada placa </li><li> Retorno da placa de cultura de 6 ml com a mancha de células para a temperatura de 37 ° C incubadora durante 40 min. </li><li> Após 40 min, aspirar o meio. Adicionar 2 mL de PBS e depois aspirar-lo. Adicionar 1 mL de 0.025% de tripsina a cada placa e substitui-los na temperatura de 37 ° C incubadora. </li><li> Adicionar 2 ml de DMEM com FBS a 10% após 3-5 minutos e transferir as células em suspensão para um tubo cónico de 15 ml. Rodar as células e ressuspenderam-se-lhes em 1 mL de meio DMEM com FBS a 10%. </li><li> Contar as células com um hemocitómetro ou contador de células automatizado, e, em seguida, adicionar DMEM com FBS a 10% para criar uma concentração celular final de 300.000 culas por mL. </li></ol></li></ol> 6. Galvanização Cabeça e NAs células cancerosas eck <ol><li> Remover as placas de vidro de fundo com os ensaios de matriz-DRG da incubadora. NOTA: Mais uma vez, eles são adequados quando as neurites é pelo menos 75% da forma para a aresta da matriz, o que geralmente ocorre depois de 2 - 3 dias. Isto é melhor visto usando pelo menos uma objectiva 10X. </li><li> Aspirar o meio dentro da placa com fundo de vidro. Completamente aspirar o meio no interior do vidro bem sem remover as unidades de matriz de DRG. </li><li> Elaborar 200 mL da 300.000 células / mL de meio usando uma pipeta de 200 mL. Coloque duas gotas de células em cada ensaio de matriz de DRG. Execute esta etapa para cada gotícula matriz, criando quatro repetições de cada condição de células em um prato. NOTA: A forma hemisférica da matriz permite que as células se instalar um anel ao longo da periferia do ensaio (Figura 3-A, Figura 3b). Encontrar uma pipeta com um gatilho lisa torna a colocação do uniforme cai muito mais fácil. </li><li> Confirmar o número de células semelhantes e Distribution das várias condições célula sob microscopia de 4X. </li><li> Coloque as placas com fundo de vidro para a 37 ° C incubadora por aproximadamente 60 min. Nota: Embora haja apenas um pequeno volume de células e meios de informação (~ 150 mL), os ensaios não sequem até várias horas de tempo incubadora ter decorrido. </li><li> Após 60 min, adicionar cuidadosamente 4 ml de DMEM com 10% de FBS ao longo da parede lateral da placa de vidro de fundo. NOTA: Ao longo de um período de tempo, as células parcialmente aderir ao fundo da placa, e o método de adição do meio de não perturbar as células. Diferentes tipos de células faz demorar mais ou menos tempo para começar a aderir à placa de vidro de fundo. </li><li> Substitua todas as drogas exógenas ou fatores de crescimento neste momento para manter os níveis de concentração anteriores. </li><li> Devolver os ensaios para a 37 ° C incubadora, excepto quando são examinadas ao microscópio. Quantificar os resultados deste ensaio por imagem microscópica. Resumidamente, conte os fios de invasão perineural comem quatro quadrantes utilizando uma imagem microscópica 4X. NOTA: Um microscópio com um 4X capacidades objetivas e de fluorescência é adequada para a foto-documentação dos ensaios. O tamanho dos ensaios se encaixa muito bem dentro do campo de um objetivo 4X, que está detalhado o suficiente para capturar as áreas individuais de invasão perineural. perineural torna-se evidente dentro de 24 h, mas para além de 48 h, a integridade dos ensaios começa a enfraquecer, como as células tumorais dividir ao longo da periferia da matriz e invadir. Para além de 48 h, existe também o efluxo substancial de fibroblastos a partir do DRG, que obscurece a visualização utilizando microscopia de campo claro. Portanto, é aconselhável foto-documento os resultados com microscopia de 4X, pelo menos, duas vezes durante esta janela (por exemplo, às 24 e 48 h após o plaqueamento das células tumorais). Estar consciente de que estes são os ensaios 3-dimensionais, e é difícil de imagem completamente o ensaio de todo. Mais perineural ocorre num plano da parte inferior da placa, em que tele células estão incorporadas na matriz ligeiramente acima do fundo da placa. Porque este plano está perto de horizontal, a grande maioria das neurites com células tumorais são capturados em uma imagem de nível único em 4x. </li></ol>

<ol><li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2006%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2006.</a> CA Cancer J Clin. 56 (2), 106-130 (2006).</li>
<li>Hinerman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+irradiation+for+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+cavity%3A+35-year+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity: 35-year experience.</a> Head Neck. 26 (11), 984-994 (2004).</li>
<li>Rahima, B., Shingaki, S., Nagata, M., Saito, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+perineural+invasion+in+oral+and+oropharyngeal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Surg+Oral+Med+Oral+Pathol+Oral+Radiol+Endod%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of perineural invasion in oral and oropharyngeal carcinoma.</a> Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 97 (4), 423-431 (2004).</li>
<li>Woolgar, J. A., Scott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+cervical+lymph+node+metastasis+in+squamous+cell+carcinoma+of+the+tongue%2Ffloor+of+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Prediction of cervical lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the tongue/floor of mouth.</a> Head Neck. 17 (6), 463-472 (1995).</li>
<li>Tai, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+for+T1-2+oral+squamous+cell+carcinoma+with+or+without+perineural+invasion%3A+neck+dissection+and+postoperative+adjuvant+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Treatment for T1-2 oral squamous cell carcinoma with or without perineural invasion: neck dissection and postoperative adjuvant therapy.</a> Ann Surg Oncol. 19 (6), 1995-2002 (2012).</li>
<li>George, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+sinusitis+in+patients+in+the+medical+intensive+care+unit%3A+a+prospective+epidemiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial sinusitis in patients in the medical intensive care unit: a prospective epidemiological study.</a> Clin Infect Dis. 27 (3), 463-470 (1998).</li>
<li>Fagan, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perineural+invasion+in+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Perineural invasion in squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124 (6), 637-640 (1998).</li>
<li>Soo, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+implications+of+perineural+spread+in+squamous+carcinomas+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Prognostic implications of perineural spread in squamous carcinomas of the head and neck.</a> Laryngoscope. 96 (10), 1145-1148 (1986).</li>
<li>Parsons, J. T., Mendenhall, W. M., Stringer, S. P., Cassisi, N. J., Million, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+factors+influencing+the+outcome+of+postoperative+irradiation+for+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">An analysis of factors influencing the outcome of postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 39 (1), 137-148 (1997).</li>
<li>Liao, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+adjuvant+radiation+therapy+improve+outcomes+in+pT1-3N0+oral+cavity+cancer+with+tumor-free+margins+and+perineural+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Does adjuvant radiation therapy improve outcomes in pT1-3N0 oral cavity cancer with tumor-free margins and perineural invasion.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 71 (2), 371-376 (2008).</li>
<li>Fan, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+results+of+postoperative+radiotherapy+on+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+cavity%3A+coexistence+of+multiple+minor+risk+factors+results+in+higher+recurrence+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Treatment results of postoperative radiotherapy on squamous cell carcinoma of the oral cavity: coexistence of multiple minor risk factors results in higher recurrence rates.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 77 (4), 1024-1029 (2010).</li>
<li>Dai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+survival+in+perineural+invasion+of+pancreatic+cancer%3A+an+in+vitro+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer: an in vitro approach.</a> Hum Pathol. 38 (2), 299-307 (2007).</li>
<li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+invasion+in+pancreatic+cancer%3A+a+mutual+tropism+between+neurons+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Neural invasion in pancreatic cancer: a mutual tropism between neurons and cancer cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 374 (3), 442-447 (2008).</li>
<li>Gil, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+pancreatic+cancer+cell+invasion+by+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves.</a> J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFRalpha1+released+by+nerves+enhances+cancer+cell+perineural+invasion+through+GDNF-RET+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GFRalpha1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (19), 2008-2017 (2014).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+%28CCL2-CCR2%29+signaling+axis+mediates+perineural+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion.</a> Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).</li>
<li>Bakst, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+impairs+perineural+invasion+by+modulating+the+nerve+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Radiation impairs perineural invasion by modulating the nerve microenvironment.</a> PLoS One. 7 (6), 39925(2012).</li>
<li>Ayala, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+dorsal+root+ganglia+and+human+prostate+cell+line+interaction%3A+redefining+perineural+invasion+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer.</a> Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).</li>
<li>Na'ara, S., Gil, Z., Amit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Modeling+of+Cancerous+Neural+Invasion%3A+The+Dorsal+Root+Ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion.</a> J Vis Exp. (110), (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Passos críticos dentro do Protocolo Os passos mais importantes dentro deste protocolo são a dissecção e extração do gânglio da raiz dorsal preciso. transecção adequada da coluna vertebral e uma divisão da linha média longitudinal em duas-hemi-espinhas são essenciais para a obtenção de grandes números de DRG. Durante a dissecação de DRGs individuais, o gânglio nunca devem ser tratados diretamente, mas sim os fáscia circundantes deve ser agarrada com as pinças microscópicas. N...

O carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (CECP) é o sexto câncer mais comum nos EUA, com 10.000 mortes por ano em todo o país e 300.000 mortes por ano em todo o mundo1. O prognóstico geral para o CECP permaneceu inalterado em 50% nas últimas décadas. A invasão perineural (PNI) é uma das características patológicas mais proeminentes que pressagiam um prognóstico desfavorável em pacientes com CECP. Infelizmente, a PNI é uma ocorrência frequente no CECP e pode ser encontrada em até 40% dos pacientes com CECP2,3. 
PNI é o processo pelo qual as células malignas rastreiam ao longo dos nervos até os tecidos adjacentes, permitindo taxas mais altas de disseminação local e distante. Assim, os tumores de CECP positivos para PNI apresentam maiores taxas de recidivas locorregionais e metástases à distância, resultando em menor sobrevida global em comparação com pacientes com CECP sem PNI4-8.
Embora o tratamento de pacientes com PNI seja tipicamente maximizado com o emprego de cirurgia, radiação e quimioterapia, as taxas de sobrevida global desses pacientes ainda são reduzidas em até 40% em comparação com pacientes sem PNI9-11. Assim, fica claro que as modalidades atuais de tratamento do CECP são ineficazes para melhorar o prognóstico adverso associado à PNI. A abordagem de desenvolvimento de terapia direcionada contra PNI em CECP tem sido dificultada pela pouca compreensão dos fatores que regulam esse processo. Isso é, em parte, consequência da falta de um modelo in vitro consistente para o estudo do PNI no CECP. 
Nos últimos anos, vários grupos têm utilizado um modelo in vitro para estudar o PNI em cânceres predominantemente de pâncreas e próstata12-19. Este modelo usa os neuritos gerados a partir de gânglios da raiz dorsal isolados de camundongos ou ratos como um substituto para a invasão de grandes nervos. Os gânglios da raiz dorsal são fixados em uma matriz semissólida empobrecida em fator, que é uma mistura de proteínas da membrana basal solubilizada secretada por células de sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm. Essa matriz permite o crescimento dos neuritos e o rastreamento de células cancerígenas individuais ao longo desses neuritos. Descreve-se aqui a adaptação desse modelo para o exame do PNI no CECP.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12 50/50 Mix com L-glutamina e HEPES 15 mM</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-090-CV</td><td>Manassas, VA</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S11150</td><td>Flowery Branch, GA</td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>25200056</td><td>Grand Island, NY</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td>Manassas, VA</td></tr><tr><td>Matrigel hESC-Qualif Mouse</td><td>Corning Incorporated</td><td>354277</td><td>Bedford, MA</td></tr><tr><td>Pratos de cultura com fundo de vidro irradiados com gama de 35 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Ashland, MA</td></tr><tr><td>Microscópio Cirúrgico SteREO Discovery.V8</td><td>Carl Zeiss Microimaging</td><td>495015-0021-000&nbsp;</td><td>Thornwood, Nova Iorque</td></tr><tr><td>Fonte de luz Schott ACE I Schott</td><td></td><td>A20500</td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>CellTracker&nbsp;</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>C2925</td><td>Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>BD Agulha PrecisionGlide 18 G e 21 G</td><td></td><td>BD 305195</td><td>Franklin Lakes, NJ</td></tr><tr><td>Pinça de Microdissecação Premium</td><td>Aparelho Harvard</td><td>60-3851</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Tesoura Padrão de Operação Fina Premium</td><td>Aparelho Harvard</td><td>52-2789</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Tesoura de Mola Premium</td><td>Harvard Aparelho</td><td>60-3923</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Pinça de curativo</td><td>Harvard Aparelho</td><td>72-8949</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Camundongos nus atímicos (002019)</td> <td>Laboratório Jackson 002019</td><td></td><td>Bar Harbor, ME</td></tr></tbody></table>

um modelo para perineural invasion em cabeça e pescoço carcinoma espinocelular

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

A invasão perineural (PNI) é encontrada em aproximadamente 40% dos carcinomas espinocelulares de cabeça e pescoço (HNSCC). Apesar do tratamento multimodal com cirurgia, radiação e quimioterapia, as recorrências locorregionais e metástases à distância ocorrem em taxas mais altas, e a sobrevida global é reduzida em 40% em comparação com o CECP sem PNI. Estudos in vitro das vias envolvidas no PNI do CECP têm sido historicamente desafiadores, dada a falta de um ensaio consistente e reprodutível. Descreve-se aqui a adaptação do ensaio do gânglio da raiz dorsal (DRG) para o exame de PNI no CECP. Neste modelo, os DRG são colhidos da coluna vertebral de um camundongo nu sacrificado e colocados dentro de uma matriz semissólida. Nos dias subsequentes, os neuritos são gerados e crescem em um padrão radial a partir dos corpos celulares do DRG. As linhagens celulares de CECP são então colocadas perifericamente ao redor da matriz e invadem preferencialmente ao longo dos neuritos em direção ao DRG. Este método permite a avaliação rápida de múltiplas condições de tratamento, com taxas de sucesso e reprodutibilidade muito altas do ensaio.

Após a dissecção do DRG e a colocação dentro da gotícula de matriz, a aparência do ensaio deve assemelhar-se a Figura 1. Note-se que o DRG não é perfeitamente redondos, mas que é centrado no interior da gotícula de matriz. Isto permite o crescimento de neurites em 360 graus, mostrado parcialmente na Figura 2. Esteja ciente de que certas partes do DRG enviar neurites mais rápido e em maior número do que outros, correspondendo tipicamente a onde o eferente...

A invasão perineural (PNI) é uma característica comum do carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (CECP), conferindo menores taxas de sobrevida. Seus mecanismos são mal compreendidos. Utilizando neuritos gerados a partir de gânglios murinos da raiz dorsal confinados a uma matriz semissólida, as vias envolvidas no PNI de linhagens celulares de CECP podem ser investigadas.

Um Modelo para Perineural Invasion em cabeça e pescoço carcinoma espinocelular

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

O objetivo geral deste protocolo experimental é avaliar rapidamente várias condições de tratamento que afetam a invasão perineural no câncer escamoso de cabeça e pescoço com taxas de sucesso e reprodutibilidade de ensaio muito altas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da oncologia de cabeça e pescoço, como quais são os fatores que influenciam a invasão perineural de células cancerígenas de cabeça e pescoço. A principal vantagem dessa técnica é que um grande número de ensaios pode ser realizado de forma rápida e reprodutível a partir de um camundongo em um período de tempo relativamente curto.Antes de iniciar o procedimento de dissecção do gânglio da raiz dorsal, ou DRG, adicione meio fresco à temperatura ambiente a pelo menos 40 poços de uma placa de 96 poços com fundo em V. Em seguida, use uma tesoura fina para fazer uma incisão longitudinal ao longo da coluna vertebral, da raiz da cauda até a cabeça do camundongo. E divida transversalmente o tecido abaixo da coluna sacral, dissecando ambos os lados da coluna, até a base do crânio.Transfira a amostra ao microscópio e observe a extremidade cervical da coluna vertebral em baixa potência. A medula espinhal branca é aparente no meio de um anel ósseo, que é cercado por quantidades variáveis de músculos periespinhais e tecidos moles. Usando uma tesoura de mola microscópica, divida o aspecto dorsal ou superior dos primeiros dois a três corpos vertebrais.Em seguida, use a ação da mola da tesoura para abrir esse corte ósseo inicial, para garantir que a dissecção do corpo vertebral ocorra na linha média. Continue em pequenos incrementos em direção à coluna sacral, dividindo a coluna com cortes idênticos no aspecto ventral ou inferior dos corpos vertebrais. Colocando uma hemiespinha de lado, transfira a outra metade da coluna voltada para baixo em uma placa estéril com a medula espinhal no lugar.E use duas agulhas de calibre 18 para prender as duas extremidades da hemiespinha na plataforma de dissecação de poliestireno. Em seguida, começando na extremidade cervical mais estreita, retire suavemente a medula espinhal de cerca de quatro níveis vertebrais. Na região onde os nervos sensoriais se inserem no DRG, segure suavemente a fáscia circundante com uma pinça microscópica e use uma tesoura de mola microscópica para aparar essa fáscia e outros tecidos nervosos para liberar o DRG.Sob ampliação aumentada, use a tesoura de mola para cortar o nervo periférico o mais próximo possível do DRG para liberar o tecido e apare os ramos proximais. Em seguida, apare o DRG de quaisquer fibras nervosas perdidas ou anexos fasciais e coloque o tecido isolado em um poço da placa de fundo em V de 96 poços. Para preparar as gotículas de matriz semissólida, transfira uma placa de fundo de poço de vidro do gelo para um bloco de gelo sob o microscópio operacional.Coloque a ponta de uma pipeta de no máximo 10 microlitros diretamente no vidro em um ângulo de 45 graus e dispense cuidadosamente uma gota de matriz de 1,5 microlitro no vidro. Afaste lentamente a ponta da pipeta do vidro à medida que a matriz se encaixa na placa. Deposite uma gota de matriz em cada um dos quatro cantos da placa e transfira a placa para uma superfície em temperatura ambiente por cerca de um minuto.Quando a matriz estiver ligeiramente endurecida, retorne a placa ao bloco de gelo e use uma pinça microscópica fechada para colher o DRG suavemente com a mão esquerda. Usando a mão direita, transfira cuidadosamente o tecido nervoso para a ponta de uma agulha de calibre 21 e use a agulha para inserir suavemente o DRG no meio da gota da matriz. O DRG deve ser liberado facilmente na matriz para posicionamento central com a agulha.Depois de inserir uma peça de DRG em cada uma das quatro gotículas, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius por três minutos. Quando todo o DRG estiver embutido, segure as placas uma de cada vez, em um pequeno ângulo e adicione lentamente quatro mililitros de DMEM suplementado com 10% de FBS às placas, de modo que o meio só gradualmente entre em contato com as unidades DRG da matriz. Devolva as placas à incubadora por mais 48 a 72 horas.Quando os neuritos atingirem pelo menos 75% do caminho até a borda da matriz, aspire o meio dos poços sem remover as unidades DRG da matriz. Em seguida, usando uma pipeta de 200 microlitros, com um gatilho suave, coloque duas gotas de três vezes 10 elevado ao quinto de células por mililitro de meio sobre cada ensaio DRG da matriz. E devolva as placas à incubadora.Após uma hora, adicione suavemente quatro mililitros de DMEM com 10% de FBS ao longo da parede lateral da placa com fundo de vidro e retorne as placas à incubadora até a próxima avaliação microscópica. Após sua dissecção e colocação dentro das gotículas da matriz, a aparência do ensaio deve se assemelhar ao DRG incorporado à matriz mostrado aqui. Observe que o DRG não é perfeitamente redondo, mas está centrado dentro da gota da matriz, permitindo o crescimento de neuritos em 360 graus.Imediatamente após o plaqueamento, as células cancerígenas escamosas de cabeça e pescoço formam um anel circunferencial ao redor da matriz, expandindo-se ao longo dos neuritos nos próximos dois a três dias. As células revestidas em gotículas de controle em branco contendo a matriz sozinha se dividem ativamente em torno das matrizes, mas não entram ou se estendem por cima. Para quantificação da invasão perineural das células cancerígenas, as imagens dos ensaios são divididas em quatro quadrantes por meio de uma linha vertical e outra horizontal.Uma série de pontos é então marcada para cada extensão de invasão perineural observada em cada quadrante, permitindo a comparação dos crescimentos de células cancerígenas ao longo dos neuritos entre diferentes linhagens de células cancerígenas. Uma vez dominada, a técnica de isolamento dos gânglios da raiz dorsal pode ser concluída em menos de duas horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante minimizar o manuseio excessivo dos gânglios da raiz dorsal, pois a lesão por esmagamento é o motivo mais comum para a falha do ensaio.Após esse procedimento, os mecanismos de invasão perineural podem ser estudados, potencialmente levando ao desenvolvimento de terapias direcionadas contra esse tipo de invasão de tecidos moles. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar os gânglios da raiz dorsal de um camundongo e configurar um ensaio para examinar a invasão perineural.

a-model-for-perineural-invasion-head-neck-squamous-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Uma visão abrangente das técnicas envolvidas na geração de um modelo do rato de câncer oral e monitorização quantitativa de invasão tumoral dentro da língua por meio de microscopia multi-fotão de células marcadas é apresentado. Este sistema pode servir como uma plataforma útil para a avaliação molecular e eficácia de drogas anti-invasivos compostos.

Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

Neste vídeo, descrevemos o método de co-cultura de gânglios da raiz dorsal e células cancerígenas na membrana corioalantóide de pintinho ou CAM para estudar a invasão perineural.

Membrana corioalantóide de pintinho ou modelo de tumor CAM: um método in ovo para simular a invasão perineural de células tumorais

Neste vídeo, demonstramos o procedimento para desenvolver um modelo de invasão de células cancerígenas perineurais in vitro por co-cultura de gânglio da raiz dorsal de camundongos e células cancerígenas neurotrópicas. O modelo pode ser utilizado para realizar ensaios de câncer, produzindo resultados rápidos e reprodutíveis.

Estabelecendo um modelo tridimensional de co-cultura de gânglios da raiz dorsal murina e células cancerígenas: um modelo in vitro para estudar a invasão de células cancerígenas perineurais

Neste vídeo, desenvolvemos um modelo de camundongo in vivo para invasão perineural injetando células cancerígenas pancreáticas no nervo ciático. Este modelo ajuda a quantificar a extensão da invasão e estudar as interações entre células cancerígenas e nervos.

Modelo de Invasão Perineural Murina: Gerando um Modelo In Vivo para Simular a Invasão Perineural no Nervo Ciático de Camundongo

Neste vídeo, descrevemos o procedimento para estabelecer um modelo murino de invasão perineural injetando células cancerígenas no nervo ciático. O modelo pode ajudar a obter uma compreensão da magnitude da invasão nervosa para avaliação subsequente de medicamentos anticâncer.

Modelo de Invasão Perineural do Nervo Ciático Murino ou PNI: Extração e Processamento do Nervo Ciático para Entender a Invasão por Células Cancerígenas

A invasão dos tecidos normais circundantes é uma característica definidora dos tumores malignos. Fornecemos aqui um ensaio simples e semi-automatizado de microplacas de invasão em uma biomatriz 3D natural que foi exemplificada com vários modelos de cânceres humanos avançados.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Este artigo em vídeo mostra o uso do modelo de células cancerígenas (DRG)/gânglios da raiz dorsal no adenocarcinoma ductal pancreático.

In Vitro Modelagem de Cancerous Neural Invasion: o gânglio Modelo de raiz dorsal

Descrevemos no vivo modelo murino de invasão perineural injetando células de câncer pancreático syngeneic no nervo ciático. O modelo permite a quantificação da extensão da invasão do nervo e apoia a investigação dos mecanismos celulares e moleculares de invasão perineural.

Um modelo murino de nervo ciático na Vivo de invasão Perineural

Descrevemos a evolução de um modelo tridimensional, esferoide-baseado em vitro que permite-nos testar o padrão atual de regimes de terapia experimental para cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas na linha de celular, com o objetivo de avaliar a terapia susceptibilidade e resistência em células primárias de espécimes humanos no futuro.

Terapia de testes em um modelo de cultura celular 3D baseado no Spheroid para cabeça e pescoço Carcinoma de células escamosas

Aqui nós apresentamos um método reprodutível para desenvolver um modelo murino ortotópico de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas. Tumores demonstram clinicamente relevantes características histopatológicas da doença, incluindo necrose, pobre diferenciação, metástases nodais e infiltração imune. Tumor-rolamento ratos desenvolvem sintomas clinicamente relevantes, incluindo disfagia, deslocamento da mandíbula e perda de peso.

Intramucosal inoculação de células de Carcinoma de células escamosas em ratos para perfil imune de Tumor e tratamento avaliação de resposta

A invasão perineural é um phenotype agressivo para carcinomas de pilha Squamous da cabeça e da garganta e outros tumores. O modelo de membrana corioalantoica de pintinho tem sido usado para estudar angiogênese, invasão de câncer e metástase. Aqui nós demonstramos como este modelo pode ser utilizado para avaliar a invasão perineural in vivo.

A membrana Chorioalantoica Chick in vivo modelo para avaliar invasão perineural em câncer de cabeça e pescoço

Aprenda a avaliar rapidamente condições de tratamento para invasão perineural em carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço usando ganglios da raiz dorsal de camundongos. Este método oferece alta reprodutibilidade.

Um Modelo para Perineural Invasion em cabeça e pescoço carcinoma espinocelular

Explorar mais vídeos