Um Modelo para Perineural Invasion em cabeça e pescoço carcinoma espinocelular

O objetivo geral deste protocolo experimental é avaliar rapidamente várias condições de tratamento que afetam a invasão perineural no câncer escamoso de cabeça e pescoço com taxas de sucesso e reprodutibilidade de ensaio muito altas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da oncologia de cabeça e pescoço, como quais são os fatores que influenciam a invasão perineural de células cancerígenas de cabeça e pescoço. A principal vantagem dessa técnica é que um grande número de ensaios pode ser realizado de forma rápida e reprodutível a partir de um camundongo em um período de tempo relativamente curto.

Antes de iniciar o procedimento de dissecção do gânglio da raiz dorsal, ou DRG, adicione meio fresco à temperatura ambiente a pelo menos 40 poços de uma placa de 96 poços com fundo em V. Em seguida, use uma tesoura fina para fazer uma incisão longitudinal ao longo da coluna vertebral, da raiz da cauda até a cabeça do camundongo. E divida transversalmente o tecido abaixo da coluna sacral, dissecando ambos os lados da coluna, até a base do crânio.

Transfira a amostra ao microscópio e observe a extremidade cervical da coluna vertebral em baixa potência. A medula espinhal branca é aparente no meio de um anel ósseo, que é cercado por quantidades variáveis de músculos periespinhais e tecidos moles. Usando uma tesoura de mola microscópica, divida o aspecto dorsal ou superior dos primeiros dois a três corpos vertebrais.

Em seguida, use a ação da mola da tesoura para abrir esse corte ósseo inicial, para garantir que a dissecção do corpo vertebral ocorra na linha média. Continue em pequenos incrementos em direção à coluna sacral, dividindo a coluna com cortes idênticos no aspecto ventral ou inferior dos corpos vertebrais. Colocando uma hemiespinha de lado, transfira a outra metade da coluna voltada para baixo em uma placa estéril com a medula espinhal no lugar.

E use duas agulhas de calibre 18 para prender as duas extremidades da hemiespinha na plataforma de dissecação de poliestireno. Em seguida, começando na extremidade cervical mais estreita, retire suavemente a medula espinhal de cerca de quatro níveis vertebrais. Na região onde os nervos sensoriais se inserem no DRG, segure suavemente a fáscia circundante com uma pinça microscópica e use uma tesoura de mola microscópica para aparar essa fáscia e outros tecidos nervosos para liberar o DRG.

Sob ampliação aumentada, use a tesoura de mola para cortar o nervo periférico o mais próximo possível do DRG para liberar o tecido e apare os ramos proximais. Em seguida, apare o DRG de quaisquer fibras nervosas perdidas ou anexos fasciais e coloque o tecido isolado em um poço da placa de fundo em V de 96 poços. Para preparar as gotículas de matriz semissólida, transfira uma placa de fundo de poço de vidro do gelo para um bloco de gelo sob o microscópio operacional.

Coloque a ponta de uma pipeta de no máximo 10 microlitros diretamente no vidro em um ângulo de 45 graus e dispense cuidadosamente uma gota de matriz de 1,5 microlitro no vidro. Afaste lentamente a ponta da pipeta do vidro à medida que a matriz se encaixa na placa. Deposite uma gota de matriz em cada um dos quatro cantos da placa e transfira a placa para uma superfície em temperatura ambiente por cerca de um minuto.

Quando a matriz estiver ligeiramente endurecida, retorne a placa ao bloco de gelo e use uma pinça microscópica fechada para colher o DRG suavemente com a mão esquerda. Usando a mão direita, transfira cuidadosamente o tecido nervoso para a ponta de uma agulha de calibre 21 e use a agulha para inserir suavemente o DRG no meio da gota da matriz. O DRG deve ser liberado facilmente na matriz para posicionamento central com a agulha.

Depois de inserir uma peça de DRG em cada uma das quatro gotículas, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius por três minutos. Quando todo o DRG estiver embutido, segure as placas uma de cada vez, em um pequeno ângulo e adicione lentamente quatro mililitros de DMEM suplementado com 10% de FBS às placas, de modo que o meio só gradualmente entre em contato com as unidades DRG da matriz. Devolva as placas à incubadora por mais 48 a 72 horas.

Quando os neuritos atingirem pelo menos 75% do caminho até a borda da matriz, aspire o meio dos poços sem remover as unidades DRG da matriz. Em seguida, usando uma pipeta de 200 microlitros, com um gatilho suave, coloque duas gotas de três vezes 10 elevado ao quinto de células por mililitro de meio sobre cada ensaio DRG da matriz. E devolva as placas à incubadora.

Após uma hora, adicione suavemente quatro mililitros de DMEM com 10% de FBS ao longo da parede lateral da placa com fundo de vidro e retorne as placas à incubadora até a próxima avaliação microscópica. Após sua dissecção e colocação dentro das gotículas da matriz, a aparência do ensaio deve se assemelhar ao DRG incorporado à matriz mostrado aqui. Observe que o DRG não é perfeitamente redondo, mas está centrado dentro da gota da matriz, permitindo o crescimento de neuritos em 360 graus.

Imediatamente após o plaqueamento, as células cancerígenas escamosas de cabeça e pescoço formam um anel circunferencial ao redor da matriz, expandindo-se ao longo dos neuritos nos próximos dois a três dias. As células revestidas em gotículas de controle em branco contendo a matriz sozinha se dividem ativamente em torno das matrizes, mas não entram ou se estendem por cima. Para quantificação da invasão perineural das células cancerígenas, as imagens dos ensaios são divididas em quatro quadrantes por meio de uma linha vertical e outra horizontal.

Uma série de pontos é então marcada para cada extensão de invasão perineural observada em cada quadrante, permitindo a comparação dos crescimentos de células cancerígenas ao longo dos neuritos entre diferentes linhagens de células cancerígenas. Uma vez dominada, a técnica de isolamento dos gânglios da raiz dorsal pode ser concluída em menos de duas horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante minimizar o manuseio excessivo dos gânglios da raiz dorsal, pois a lesão por esmagamento é o motivo mais comum para a falha do ensaio.

Após esse procedimento, os mecanismos de invasão perineural podem ser estudados, potencialmente levando ao desenvolvimento de terapias direcionadas contra esse tipo de invasão de tecidos moles. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar os gânglios da raiz dorsal de um camundongo e configurar um ensaio para examinar a invasão perineural.