Microscopia de Luz Folha de fluorescência das raízes das plantas que crescem na superfície de um gel

O objetivo geral deste procedimento é adquirir observações de longo prazo do sistema radicular de uma planta usando microscopia de folha de luz. Para conseguir isso, é essencial ter um método de preparação de amostras suave, condições de cultivo controladas e uma técnica de imagem que não altere o desenvolvimento da planta, como a microscopia de folha de luz. Para começar, as plantas são cultivadas na superfície de uma camada fina de gel de dois milímetros.

O gel com uma muda de Aribidopsis é então cortado, recolhido e transferido para o suporte de amostra do microscópio. Dentro do microscópio, a planta cresce em sua posição vertical natural. As raízes crescem em meio líquido, enquanto as folhas permanecem no ar.

Um sistema de iluminação ilumina apenas as folhas. A superfície da água é coberta para manter as raízes na escuridão. Uma das principais vantagens dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a incorporação da raiz dentro do gel, é que estamos acostumados a cultivar plantas na superfície de um gel.

Portanto, podemos seguir o mesmo protocolo de cultivo de antes. E segundo, a raiz está em contato direto com o meio líquido, que pode ser trocado por tratamentos medicamentosos, por exemplo. Despeje 30 mililitros de meio MS semi-forte recém-autoclavado contendo 1,5% de fitogel em uma placa de Petri quadrada para criar uma camada de cerca de 2 milímetros.

Semeie sementes estéreis lado a lado com pelo menos um centímetro de espaço entre elas. Em seguida, enrole o prato com uma fita de microporos. Cultive a placa em sua incubadora de crescimento verticalmente por até 10 dias.

Neste experimento, usamos plantas de seis dias de idade para observar o desenvolvimento das raízes laterais. Fornecemos um modelo para impressão 3D do suporte de amostra. Testamos diferentes materiais.

As resinas transparentes foram mais adequadas em termos de rigidez e resistência à água. Uma descrição detalhada das dimensões para usinar um porta-amostras de material sólido é descrita no manuscrito. Corte o gel ao redor da planta usando um bisturi.

Em seguida, pegue o bloco de gel no qual a planta está crescendo e transfira-o cuidadosamente para o porta-amostras. Derreta 1% de aggros a 80 graus Celsius e resfrie até 33 graus Celsius. Cole o bloco de gel no porta-amostras e cole a planta no gel com cuidado.

Use um microscópio estéreo para verificar a posição da planta e certifique-se de que a região de interesse não esteja coberta por nenhum gel. Para evitar que a planta seque, deslize o porta-amostras em uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros sempre que possível. Coloque o suporte em uma caixa de pipeta e prepare mais amostras, se necessário.

Nosso microscópio é um clássico de rotação aberta sem grandes modificações. Implementamos um sistema de iluminação para cultura de plantas dentro do microscópio. Os LEDs vermelho e azul estão dispostos em um anel.

Pares de LEDs podem ser ligados e desligados individualmente para iluminação direcional. O espectro do sistema de iluminação corresponde ao de nossas câmaras de crescimento. Quase toda a iluminação proveniente dos LEDs é bloqueada pelo filtro de emissão para GFP.

Não conseguimos detectar nenhuma luz difusa atingindo a câmera. Assim, a luz pode ser mantida acesa durante a geração de imagens. A intensidade da luz pode ser ajustada, variando de 30 a 250 micro moles por metro quadrado por segundo.

Aparafuse ou cole o anel de LED na parte inferior do braço de giro aberto. Monte-o de volta ao microscópio e conecte os fios. Monte o sistema de profusão.

Conecte os tubos à câmara de amostra em um arranjo unidirecional. Ajuste a velocidade para um mililitro por minuto. Adicione três quadrados de milímetros de uma folha de plástico preta estéril e distribua-os na superfície da água.

Insira a amostra no microscópio. Verifique se não há folhas de plástico grudadas no porta-amostras. Feche a câmara com duas tampas feitas de papel alumínio preto.

Acenda a luz e ajuste a intensidade da luz. Apague a luz da sala e comece a gravar. Este método permite registrar o crescimento radicular ao longo de várias horas até dias, apresentado aqui pelo crescimento de uma raiz lateral.

Imagens de uma pilha z de um único ponto de tempo mostram boas propriedades seccionais ópticas. Captamos todo o processo de formação da raiz lateral em 3D, o que nos permite estudar a dinâmica desse processo. Olhar para uma única fatia desta gravação mostra uma boa resolução, mesmo no fundo da raiz.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão clara do método de preparação de amostras de plantas para microscopia de folha de luz. Seguindo este protocolo, agora podemos observar a localização de proteínas intracelulares ou padrões de expressão gênica durante a organogênese, tropismos de plantas ou adaptação de plantas. Isso nos ajudará a entender a regulação espaço-temporal do desenvolvimento das plantas.