Name: Microscopia de Luz Folha de fluorescência das raízes das plantas que crescem na superfície de um gel (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprenda microscopia de luz folha para observação de longo prazo do desenvolvimento radicular em Arabidopsis. Este método não invasivo preserva as condições naturais de crescimento e permite estudos de expressão gênica.

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Agradecemos Matyáš Fendrych para leitura / visualização crítica e Stephan Stadlbauer para o equipamento de áudio. Graças à Oficina Miba no IST Áustria por sua contribuição para o OpenSPIM. A investigação conducente a estes resultados beneficiaram de financiamento do Programa Pessoas (Acções Marie Curie) do Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7 / 2007-2013) ao abrigo do contrato de concessão REA n ° [291734] e do Conselho Europeu de Investigação (ERC projecto-2011 -StG-20101109-PSDP).

1. Arabidopsis A cultura antes da imagem <ol><li> Preparar o meio ½ MS (meia-força de Murashige e Skoog) por adição de 2,15 g MS-meio, 10 g de sacarose, 0,97 g de MES (ácido 2- (N-morfolino) etanossulfónico) e 1 L de ddH2O (água bidestilada ) numa garrafa de 1 L. Ajustar o pH para 5,8, utilizando KOH. </li><li> Adicionar 15 g / l de goma de gelano ao meio ½ MS e que autoclave durante 20 min a 121 ° C. </li><li> Pour 30 ml do meio quente em placas de Petri quadradas (245 x 245 x 25 mm) para criar uma camada de gel com uma espessura de cerca de 2 mm. Deixe os pratos de arrefecer até à temperatura ambiente para permitir que a forma a solidificar. </li><li> Coloque as sementes de Arabidopsis esterilizados num tubo de reacção de 1,5 ml contendo 1 ml de H 2 O. estéril pegar as sementes utilizando uma pipeta de vidro ou uma ponta de pipeta de 1000 mL e semear-los sobre a superfície do gel. Coloque as sementes separadamente cerca de 10 mm. Selar a placa com fita adesiva. </li><li> Incubar a placa durante 24 h a 4° C (estratificação). </li><li> Cultivar a placa numa incubadora de crescimento, por exemplo a 22 ° C em um / ciclo noite 16/8 h dias com 120-140 / m² / s quantidade umol de luz durante 6 dias. Até 10 dias de idade plantas pode ser utilizada. </li></ol> 2. Planta Sample Método de Preparação Nota: O suporte de amostras pode ser tanto 3D impressa ou mão feita em uma oficina da máquina usando as dimensões apresentadas na Figura 2C. O arquivo do modelo 3D é fornecida no material suplementar (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl). Veja o link para encomendar a impressão 3D na lista de materiais. <ol><li> Adicionar 5 g de agarose de baixa fusão em um frasco de 50 mL contendo 50 mL de meio MS e ½ autoclave durante 20 min a 121 ° C. </li><li> Alíquota da solução de agarose 1% baixo ponto de fusão em 1,5 tubos de reacção mL. Armazenar a 4 ° C (pode ser usado para, pelo menos, dois meses). </li><li> Derreter-se uma alíquota de 1 agarose %% baixo ponto de fusão a 80 ° C e deixe esfriar para33 ° C. </li><li> Limpe o suporte de amostras em uma unidade de ultra-som. Esterilizar o suporte de amostra com 70% de etanol e lava-se com água estéril. </li><li> Corte o gel ao redor da planta usando um bisturi. </li><li> Levante o bloco com uma espátula plana e deslize-o cuidadosamente no suporte de amostras usando um segundo espátula. </li><li> Cole o gel sobre o suporte de amostra com 1% de agarose (a 33 ° C), utilizando uma pipeta de 100 uL. </li><li> Cole a planta no gel com agarose a 1% utilizando uma pipeta de 10 mL. Usar um microscópio estéreo para verificar que as folhas não são cobertas com gel. Não posicionar o gel directamente sobre a região de interesse. </li><li> Para evitar que a planta de secagem para fora, trabalhar ininterruptamente. Insira o suporte da amostra em uma ponta de pipeta de 1000 mL sempre que possível. Use a ponta da pipeta como uma tampa e deslize-o cuidadosamente sobre uma extremidade do suporte de amostras, onde a fábrica está localizada. </li><li> Coloque o suporte de amostras em uma caixa de ponta de pipeta e preparar mais plantas se necessário. As plantas podem ser direcTLY fotografada ou colocar de volta na incubadora crescimento. </li></ol> 3. Configure o microscópio NOTA: O sistema de iluminação LED é uma lâmpada custom-built. Os detalhes técnicos necessários para construir o anel de LED pode ser encontrada na Figura 3 e a lista de materiais. Consulte o arquivo de material suplementar (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd) para o projeto da placa. <ol><li> Parafuso ou cola (por exemplo, fita dupla face) do anel LED no lado inferior do braço OpenSPIM x / y / z / θ-stage. </li><li> Ligue o anel de LED com uma fonte de alimentação ajustável (0-30 V, max 2 A). </li><li> Ajustar a tensão para a intensidade da luz desejada (por Arabidopsis, 120-140 umol / m 2 / s, a Figura 3D). </li><li> Esterilizar a câmara de amostras com 70% de etanol e lava-se com água estéril. </li><li> Limpar a lente objetiva com o tecido benzina e lente de limpeza. Esterilizar a lente objectiva com 70% de etanol. </li><li> Ligue os perfusiem tubos para a câmara de amostras em um arranjo de uma via. Coloque uma garrafa de 1 L contendo MS meio fresco ½ e outra garrafa vazia ao lado da bomba de perfusão peristáltica. Ligue o frasco com meio com a entrada inferior da câmara de amostras usando um tubo de perfusão. Ligue a tomada superior da câmara de amostra com a garrafa vazia para o lixo o meio utilizado usando outro tubo de perfusão. </li><li> Defina a velocidade do fluxo de 1 mL / min. NOTA: Para não transbordamento da câmara da amostra, é importante ter uma saída maior que o fluxo de entrada. Ou aumentar a taxa de bombagem, ou utilizar um tubo com um diâmetro interno maior para o escoamento. </li><li> Corte uma folha de plástico preto no 3 mm quadrados pequenos, lavar com 70% de etanol e deixe-os secar antes de os colocar na câmara de amostra na superfície da água. </li><li> Retire a ponta da pipeta do porta-amostras e inserir o suporte de amostras na câmara de amostra. Se o titular da amostra recém-fabricados não se encaixa no braço fase, use uma areia finapapel para torná-lo mais fino ou usar um anel de vedação (∅ 6 mm) no caso de ser muito fino. </li><li> Para criar as tampas, cortar a folha de alumínio preto em duas 50 x 25 mm peças. Adicione a 5 mm cortados no meio de um lado de cada peça. Dobrar a criar uma reentrância triângulo (Figura 1D). Fechar a câmara de amostras com as duas tampas, colocando as tampas no topo da câmara de amostras com os entalhes triângulo virado para o suporte da amostra. Certifique-se de que as folhas de plantas não estão na sombra das pálpebras e receber a luz do sistema de iluminação. </li><li> Localizar a região de interesse, utilizando a fase de X / Y / Z e rotação para posicionar um raízes laterais emergente no campo de visão. </li><li> Antes de gravar, permitir que o sistema atinja o equilíbrio durante pelo menos 15 min. </li><li> Configuração da aquisição da imagem. <ol><li> Definir uma pilha de 217 imagens com 3 mm z-spacing (650 mm) e definir o lapso de tempo com intervalo de 15 min de imagem, por um período total de 17 h. NOTA: A documentação detalhada sobrecomo operar o software OpenSPIM pode ser encontrado em (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack). </li></ol></li><li> Comece a gravar. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Folha de luz microscopia de fluorescência tem a grande vantagem de combinar baixa fototoxicidade e a velocidade de aquisição ultra-rápida, que pode ser utilizado para capturar uma grande volume, com uma alta resolução espaço-temporal, mantendo a amostra em um estado fisiológico. A resolução de uma folha de microscópio de luz pode ser comparada com a de um microscópio confocal 9. No entanto, a dispersão de luz e absorção ocorre ao longo do caminho de excitação e de emissão individualmente e a qualidade da imagem global pode ser significativamente inferior no interior tecidos opacas em comparação com a superfície. Para contornar esta complicação pode-se usar a possibilidade de girar a amostra ao longo do eixo vertical e observar o mesmo volume a partir de diferentes direcções. Mas nem sempre é vantajosa, por exemplo, raízes laterais emergem de um lado da raiz e imagiologia por trás resulta em uma baixa qualidade de imagem sem ganhar mais informações. No entanto, a rotação pode ser principalmente utilizado para posicionar o SAMPle da melhor maneira. O arranjo horizontal clássica das lentes objetivas permite novas formas de montagem de amostra. Plantas beneficiar de uma posição vertical. Apresentado aqui, o &quot;sobre a superfície do gel&quot; método de montagem tem várias vantagens em comparação com outros métodos de fixação, tais como a incorporação da raiz no interior de um gel de 24,25. 1) O sistema radicular está em contato direto com o meio líquido. A câmara da amostra é ligado a um sistema de perfusão que fornece meio fresco continuamente. Ele também pode ser usado para trocar rapidamente a totalidade do volume da câmara de amostragem para aplicar diferentes meios ou drogas. 2) Antes da amostra de preparação de plantas crescer à medida que eles são utilizados para crescer em laboratórios. As plantas podem ser seleccionadas sob um microscópio de fluorescência e apenas as plantas desejadas precisam ser preparados. 3) A unidade é transferido da placa de Petri para o suporte de amostras, sem ser tocado. Deste modo, a planta pode desenvolver no mesmo gel foi crescendo em crescimento na incubatoR e tensão mecânica é reduzida a um mínimo. 4) A vista sobre o espécime é desobstruída e as aberrações ópticas são minimizados porque o espaço entre a amostra e o objectivo de detecção é apenas preenchido com meio e não há outros materiais com diferentes índices de refracção. A fim de realizar imagem de longo prazo, o sistema de iluminação planta é necessária para garantir a actividade fotossintética da planta. Na maior parte dos laboratórios de plantas crescem sobre um gel transparente, ou seja, as raízes são expostas à luz. Isso pode causar diferentes respostas ao seu ambiente e induz mudanças na sua bioquímica e desenvolvimento 26,27. A fim de reduzir a quantidade de luz sobre o sistema de raiz, folha de plástico preto foi usada para cobrir a superfície da água, bem como uma tampa feita de folha de alumínio preto coberto a câmara de amostras. A luz pode atingir a folhas de plantas através do orifício central na tampa. Nesta configuração, nenhum aumento de luz de fundo foi observado, suggesting que a quantidade de luz dispersa a partir dos LEDs vermelhos e azuis foi significativamente reduzida pelo filtro GFP e as abordagens de sombreamento. Isto permitiu manter a luz acesa durante a aquisição de imagem, sem aumentar o ruído de fundo da câmera. O suporte de amostras é projetado para impressão 3D. No entanto, a escolha do material é crucial como vários plásticos que foram testados não foram 100% estável, resultando em um desvio da amostra. Portanto, é recomendado o uso de resinas, em vez ou construir o suporte de amostra por moagem de uma haste (PEP) de polietileno. Quando se utiliza uma configuração de folha de luz do microscópio com sistema de iluminação de dupla face titular a amostra pode interferir com uma das folhas de luz em função do ângulo de rotação. Para reduzir a tensão mecânica durante a escavar a planta a partir da placa, usar um ângulo plano da espátula. A planta pode rapidamente secar e fluxo de experiência ar pela primeira vez. Tente evitar qualquer corrente de ar (movimentos rápidos, o fluxo de ar-condicionado), work ininterruptamente e deslize o suporte de amostras em uma ponta da pipeta de 1000 mL sempre que possível. Dentro do microscópio, é crucial para não molhar a planta inteira em líquido e manter as folhas secas. A técnica é ideal para imagens estágios iniciais de formação de raízes laterais. Ao realizar imagem de longo prazo de pontas de raízes maduras é preciso ter em mente que as raízes de Arabidopsis crescer com 100-300 mm / h rapidamente para fora do campo de visão. A futura aplicação muito útil poderia ser um algoritmo de acompanhamento automatizado, o que permitiria o crescimento ponta seguinte raiz ao longo de períodos prolongados de tempo. A capacidade de controlar as condições ambientais tais como a luz e a composição de nutrientes do meio durante o processo de aquisição permite investigar como as plantas se adaptar a alterações. A raiz está em contacto directo com o meio líquido, o qual pode ser usado para aplicar medicamentos para activar a expressão do gene quimicamente, por exemplo utilizando a dexametasona 28 induzível ou o β-estraadiol sistema inducible 29. No entanto, leva tempo para trocar todo o volume da câmara da amostra para lavar uma droga. A configuração pode ser melhorada através da minimização do volume da câmara da amostra para acelerar a troca de meio. No entanto, esta técnica tem um grande potencial. A combinação de procedimento de montagem, condições de crescimento padronizados ea aquisição de imagem suave usando microscopia de luz folhas permite estudos de longo prazo de desenvolvimento da planta com alta resolução a um nível fisiológico. Isso vai ajudar os pesquisadores a explorar mecanismos fundamentais do desenvolvimento da planta.

Uma das questões-chave no desenvolvimento da planta entendimento é como as células individuais se comportam durante a diferenciação de órgãos e crescimento. Idealmente, eventos celulares, como padrões de expressão de genes e localização da proteína intracelular, pode ser vista à luz de um contexto mais amplo do tecido. Este objectivo coloca desafios técnicos e requer observação de órgãos inteiros com uma alta resolução espacial, bem como a resolução temporal ao longo de períodos prolongados de tempo, que podem causar efeitos foto-toxicidade. Desde que as plantas se adaptar rapidamente às mudanças ambientais, as condições de crescimento deve ser rigidamente controlado. A fim de fazer imagiologia de longo prazo, sem interferir com o estado fisiológico da planta, três coisas têm que ser asseguradas condições, 1) que crescem na câmara da amostra, 2) amostra estável de montagem ao longo de grandes períodos de tempo, e 3) a imagem com baixas intensidades de luz para evitar a foto-dano e condições não fisiológicas. Fisiológica conditi crescenteons na câmara de microscópio amostras são cruciais para experimentos de longa duração. Há uma série de protocolos disponíveis que descrevem câmaras de crescimento de imagem para microscópios confocal 1 - 3. No entanto, a microscopia confocal introduz luz alta intensidade para a planta, que pode causar respostas ao estresse e, geralmente inibe o crescimento 4. Além disso, a maioria dos microscópios convencionais só permitem o posicionamento horizontal da amostra, que não é óptima para as plantas, uma vez que tentar reorientar-se e crescem em direcção do vector de gravidade. Ao longo dos últimos dez anos, a microscopia de luz folhas emergiu como uma ferramenta poderosa para captar o desenvolvimento de grandes espécimes em resolução celular durante períodos de tempo de até vários dias 5 - 9. A microscopia de luz folhas permite posicionar a amostra verticalmente e é cada vez mais utilizado na investigação de plantas estudando o desenvolvimento radicular 10-21, revisto recentemente por Berthet e Maizel 22. Muitos dos estudos mencionados 10,13 - 18,21 foram optimizadas e conduzidos em laboratório de Ernst HK Stelzer empregando uma forma especial da amostra de montagem caracteriza-se por crescimento da raiz na superfície de um gel de 17. Nestes estudos, foi utilizado um microscópio feito por medida, no qual a planta é realizada a partir do fundo. Em contraste, a maioria dos microscópios luz folhas amplamente disponíveis manter a amostra a partir do topo. Assim, este método de preparação particular pode não ser prontamente aplicado. O método aqui apresentado fornece um protocolo para o método de montagem bem estabelecida on-superfície aplicável para a OpenSPIM 23, uma plataforma de acesso aberto para aplicar e melhorar seletiva Avião Illumination Microscopy (SPIM). O objetivo geral deste protocolo é permitir imaging longo prazo de raízes de Arabidopsis na OpenSPIM microscópio de luz folhas. Isto é conseguido por crescimento de uma planta na vertical sobre o Surface de um gel com as raízes em um meio líquido, enquanto as folhas permanecem no ar. A fim de assegurar a actividade fotossintética da planta, um sistema de iluminação feito por encomenda ilumina as folhas, mas não as raizes (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Agarose, baixo ponto de fusão</td><td>VWR</td><td>AFFY3282125GM</td><td></td></tr><tr><td>Folha de alumínio preta</td><td>Thorlabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>Folha de plástico preta</td><td>Carl Roth</td><td>HT83.2</td><td></td></tr><tr><td>LED azul (453 nm)</td><td>OSRAM</td><td>LD&nbsp; CN5M-1R1S-35-1</td><td></td></tr><tr><td>LED vermelho (625 nm)</td><td>OSRAM</td><td>LR T66F-ABBB-1-1</td><td></td></tr><tr><td>Placa de LED - software de design de PCB</td><td>Cadsoft Eagle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES monohidratado</td><td>Duchefa</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>Fita cirúrgica micropore</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog Medium (MS-Medium)</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Porta-amostras Impressão 3D</td><td>i.materialise</td><td><a href="https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1">https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1</a></td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri quadradas (245 x 245 x 25 mm)</td><td>VWR</td><td>734-2179</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia de luz folha de fluorescência das raízes das plantas que crescem na superfície de um gel

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Uma das questões-chave para entender o desenvolvimento da planta é como as células individuais se comportam em um contexto mais amplo do tecido. Portanto, requer a observação de todo o órgão com alta resolução espacial e temporal por períodos prolongados de tempo, o que pode causar efeitos fototóxicos. Este protocolo mostra um método de preparação de amostras de plantas para microscopia de folha de luz, que se caracteriza pela montagem da planta verticalmente na superfície de um gel. A planta é montada de forma que as raízes fiquem submersas em meio líquido enquanto as folhas permanecem no ar. Para garantir a atividade fotossintética da planta, um sistema de iluminação personalizado ilumina as folhas. Para manter as raízes na escuridão, a superfície da água é coberta com folhas de papel alumínio preto. Este método permite imagens de longo prazo do desenvolvimento de órgãos vegetais em condições padronizadas.

Este método de preparação da amostra permite que o cultivo da planta para dentro da câmara de amostras microscópio enquanto observa o sistema de raiz com um microscópio de luz folhas (Figura 1). A planta cresce na superfície de uma camada de gel (½ meio MS contendo 1,5% de goma de gelano) montado sobre um suporte de amostra projetado (Figura 2). O suporte de amostras é 3D impresso usando uma resina transparente quanto material. Uma versão fabricado com destaque para as dimensões é representado na Figura 2C. As raízes são imersos em líquido (½ meio MS), que é continuamente refrescado por um sistema de perfusão. As folhas permanecem no ar e são continuamente iluminada com uma intensidade de luz de 130 umol / m² / s vinda dos LEDs vermelho e azul, que são dispostos num anel acima da planta (Figura 1A, B e A Figura 3A-C). O anel LED é fabricado em nossa oficina de máquinas enós fornecemos detalhes técnicos sobre como construir o anel LED na Figura 3 e a lista de material. A intensidade de luz pode ser ajustada variando continuamente 30-250 umol / m 2 / s (Figura 3D). O sistema radicular é sombreada por pequenas folhas de uma folha de plástico preto cobrindo a superfície da água (Figura 1). Qualquer luz difusa da iluminação que é recolhida pela lente de detecção é filtrado pelo filtro GFP (Figura 3E). Com esta configuração, um lapso de tempo de uma crescente Arabidopsis raízes laterais foi gravado durante 17 h usando uma lente de 20x / 0,5 (Figura 4). A raiz lateral tem sua origem na camada de células periciclo, que está localizado no fundo da raiz primária. A fim de demonstrar as capacidades de imagem ainda mais profundas no interior de um tecido por um período de tempo prolongado, uma ampliação maior (40x / 0.75) foi utilizado para capturar a formação de um ro lateraisOT a partir da primeira fase primórdio até o aparecimento da raiz principal dentro de um período de tempo de 38 h (Figura 5). Uma fatia 2D exemplificativa do conjunto de dados é mostrado na Fig. 5B. Esta gravação permite-nos acompanhar a dinâmica de formação de raízes laterais em 3D (Figura 5A) com uma resolução celular. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig1.jpg" /> Figura 1: Crescimento condições no interior da câmara de amostra OpenSPIM. A) Esboço da câmara de imagem. A planta está a crescer na vertical, sobre a superfície de um gel, montado num suporte de amostra construído sob encomenda (ver também a Figura 2). As raízes estão crescendo num meio líquido, que é continuamente trocadas por um sistema de perfusão. A folhas de plantas crescem em ar e são iluminados por LEDs vermelhos e azuis (ver também a Figura 3). O sistema radicular é sombreada wit<html> h folhas pequenas de uma folha de plástico preto cobrindo a superfície da água. Uma tampa feita de duas peças de folha de alumínio preto reduz ainda mais a quantidade de luz por baixo da superfície da água e mantém a humidade na câmara de amostra. O painel da direita ampliada em evidencia a planta que cresce na superfície de um bloco de gel de imerso no meio líquido. Uma gota de agarose monta a raiz sobre o gel. A caixa a tracejado indica a região de interesse observado pelo microscópio. B) Fotografia da câmara de imagem (sem tampa). Os números (1) - (10) em A e B representam: (1): X / Y / Z / θ-fase com anel de LED, (2): suporte de amostra, (3): tampa, (4): Arabidopsis thaliana , (5): folhas de folha de plástico preto, (6): sistema de perfusão, (7): detecção de lente objectiva, (8): meio líquido, (9): câmara de amostras, (10): iluminação lente objectiva. C) A tampa é feita de duas peças de folha de alumínio preto.<html> target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig2.jpg" /> Figura 2: O suporte de amostras. A) modelo 3D. O arquivo do modelo 3D é fornecido no material suplementar. B) Fotografia de impressões em 3D usando diferentes materiais (1) - (3): plástico transparente de acrílico, (4) e (5): resina, (6): resina transparente. C) Desenho técnico de suporte da amostra, números representam milímetro. D) Fotografia do suporte de amostra do fabricado com uma planta montada. A área a tracejado pode ser observado pelo microscópio. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <html> carregar / 55044 / 55044fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Instalação de iluminação Plant. A) diagrama de circuito esquemático da lâmpada. Pares de LEDs pode ser ligado / desligado individualmente para um raio direcional. LED: diodo emissor de luz, R: Resistência, T: transistor, JP: cabeça de alfinete. B) O desenho final da lâmpada de iluminação foi tirado usando uma PCB-software (PCB: placa de circuito impresso). Nós fornecemos o arquivo projeto da placa no material suplementar. A placa foi então fabricados e montados na oficina mecânica MIBA do nosso instituto. C) A fotografia do anel LED ligado. Quatro pares de vermelho e um LED azul estão dispostos em um anel. D) A gama de tensão pode ser ajustado entre 3,5 V e 14,0 V. Resistências foram usadas para atingir a quantidade de luz que varia de 30-250 mmol / m 2 / s (R1-8: 220 Ohm, R9-12: 1.220 Ohm ). E) O espectro de emissão da lâmpada, GFP e YFP.<html> tp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig4.jpg" /> Figura 4: Tempo de gravação de lapso de Arabidopsis thaliana raiz lateral. Os 5 dias de idade mudas expressa um marcador de membrana (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) e um repórter nuclear (pGATA23 :: nls-GUS-GFP) especificamente marcação periciclo células que se desenvolvem em uma raiz lateral. Uma pilha de 217 imagens (3 mm z-espaçamento) foi capturada a cada 15 minutos durante 17 horas de gravação usando uma lente de 20x / 0,5. A) Quatro pontos de tempo de 69 são mostrados numa projecção de intensidade máxima. B) Seis em cada 217 fatias individuais de um z-stack de um ponto de tempo são mostrados. Barras de escala em A e B representam 100 mm.carga / 55044 / 55044fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig5.jpg" /> Figura 5: Tempo de gravação de lapso de Arabidopsis thaliana raiz lateral. A 6 dias de idade plântulas expressa um marcador de membrana (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) e um repórter nuclear (NLS-pGATA23 :: GUS-GFP) especificamente marcação periciclo células que se desenvolvem em um raízes laterais. Uma pilha de 200 imagens (1,5 um z-espaçamento) foi capturada a cada 15 minutos por 38 h de gravação usando uma lente de 40x / 0,75. A) A rendição 3D de quatro pontos no tempo, os números na grade representam um, B) única fatia através do plano central da raiz principal. A barra de escala representa 50 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig5large.jpg" target="_blank">Por favor</a>clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. O arquivo do modelo 3D é fornecido. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-3D_Sample_Holder.stl" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.</a> Suplementar Arquivo LED Anel Board.brd. O arquivo de projeto da placa é fornecida. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-LED_Ring_Board.brd" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.</a>

Este protocolo mostra um método de preparação de amostras de plantas para microscopia de folha de luz. A configuração é caracterizada pela montagem da planta verticalmente na superfície de um gel e deixando-a crescer em condições de luz controlada. Isso permite a observação a longo prazo do desenvolvimento dos órgãos das plantas em condições padronizadas.

Microscopia de Luz Folha de fluorescência das raízes das plantas que crescem na superfície de um gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

O objetivo geral deste procedimento é obter observações de longo prazo de um sistema radicular de planta utilizando microscopia de folha de luz. Para alcançar isso, é essencial contar com um método de preparação de amostra suave, condições controladas de crescimento e uma técnica de imagem que não altere o desenvolvimento da planta, como a microscopia de folha de luz. Para começar, as plantas são cultivadas na superfície de uma camada fina de gel com dois milímetros de espessura.O gel com uma plântula de Aribidopsis é então recortado, coletado e transferido para o suporte da amostra do microscópio. Dentro do microscópio, a planta cresce em sua posição natural ereta. As raízes crescem em um meio líquido, enquanto as folhas permanecem no ar.Um sistema de iluminação ilumina apenas as folhas. A superfície da água é coberta para manter as raízes no escuro. Uma das principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes, como o encapsulamento da raiz no interior do gel, é que estamos acostumados a cultivar plantas na superfície de um gel.Portanto, podemos manter exatamente o mesmo protocolo de cultivo de antes. E em segundo lugar, a raiz está em contato direto com o meio líquido, que pode ser trocado para tratamentos com fármacos, por exemplo. Despeje 30 mililitros de meio MS com metade da concentração, recém-autoclavado, contendo 1,5 por cento de fitogel, em uma placa de Petri quadrada para criar uma camada de cerca de 2 milímetros.Semeie sementes estéreis lado a lado, com pelo menos um centímetro de espaço entre elas. Em seguida, enrole a placa com fita micro-poro. Cultive a placa verticalmente no incubador de crescimento por até 10 dias.Neste experimento, utilizamos plantas com seis dias de idade para observar o desenvolvimento de raízes laterais. Fornecemos um modelo para impressão 3D do suporte de amostra. Testamos diferentes materiais.As resinas transparentes foram as mais adequadas em termos de rigidez e resistência à água. Uma descrição detalhada das dimensões para usinar um suporte de amostra a partir de material sólido está descrita no manuscrito. Corte o gel ao redor da planta usando um bisturi.Em seguida, retire cuidadosamente o bloco de gel no qual a planta está crescendo e transfira-o com cuidado para o suporte da amostra. Derreta 1 por cento de aggros a 80 graus Celsius e resfrie até 33 graus Celsius. Cole o bloco de gel no suporte da amostra e, cuidadosamente, cole a planta sobre o gel.Utilize um microscópio estereoscópico para verificar a posição da planta e certifique-se de que a região de interesse não esteja coberta por qualquer gel. Para evitar que a planta seque, deslize o suporte da amostra para dentro da ponteira de uma pipeta de 1.000 microlitros sempre que possível. Coloque o suporte sobre uma caixa de ponteiras e prepare mais amostras, se necessário.Nosso microscópio é um modelo aberto de rotação clássico, sem modificações significativas. Implementamos um sistema de iluminação para o cultivo de plantas dentro do microscópio. LEDs vermelhos e azuis estão dispostos em um anel.Pares de LEDs podem ser ligados e desligados individualmente para iluminação direcional. O espectro do sistema de iluminação corresponde ao dos nossos câmaras de crescimento. Quase toda a iluminação proveniente dos LEDs é bloqueada pelo filtro de emissão para GFP.Não conseguimos detectar nenhuma luz dispersa atingindo a câmera. Portanto, a luz pode permanecer acesa durante a aquisição de imagens. A intensidade da luz pode ser ajustada, variando de 30 a 250 micromols por metro quadrado por segundo.Parafuse ou cole o anel de LED no lado inferior do braço do estágio giratório aberto. Recoloque-o no microscópio e conecte os fios. Monte o sistema de perfusão.Conecte os tubos à câmara de amostra em um arranjo unidirecional. Ajuste a velocidade para um mililitro por minuto. Adicione três quadrados de milímetro de uma folha plástica preta estéril e distribua-os sobre a superfície da água.Insira a amostra no microscópio. Verifique se não há folhas de plástico aderidas ao porta-amostras. Feche a câmara com duas tampas feitas de folha de alumínio preta.Ligue a luz e ajuste a intensidade luminosa. Desligue a luz do ambiente e inicie a gravação. Este método permite registrar o crescimento da raiz ao longo de várias horas até dias, apresentado aqui pelo crescimento de uma raiz lateral.Imagens de um z-stack de um único ponto temporal mostram boas propriedades de seção óptica. Capturamos todo o processo de formação de raízes laterais em 3D, o que nos permite estudar a dinâmica desse processo. Observar uma única fatia dessa gravação revela boa resolução, mesmo profundamente no interior da raiz.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão clara do método de preparação de amostras vegetais para microscopia de folha de luz. Seguindo este protocolo, agora somos capazes de observar a localização intracelular de proteínas ou padrões de expressão gênica durante a organogênese, tropismos vegetais ou adaptação de plantas. Isso nos ajudará a compreender a regulação espaço-temporal do desenvolvimento vegetal.

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Biology

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