Microscopia de Luz Folha de fluorescência das raízes das plantas que crescem na superfície de um gel
18 de janeiro de 2017
Este protocolo mostra um método de preparação de amostras de plantas para microscopia de folha de luz. A configuração é caracterizada pela montagem da planta verticalmente na superfície de um gel e deixando-a crescer em condições de luz controlada. Isso permite a observação a longo prazo do desenvolvimento dos órgãos das plantas em condições padronizadas.
O objetivo geral deste procedimento é adquirir observações de longo prazo do sistema radicular de uma planta usando microscopia de folha de luz. Para conseguir isso, é essencial ter um método de preparação de amostras suave, condições de cultivo controladas e uma técnica de imagem que não altere o desenvolvimento da planta, como a microscopia de folha de luz. Para começar, as plantas são cultivadas na superfície de uma camada fina de gel de dois milímetros.
O gel com uma muda de Aribidopsis é então cortado, recolhido e transferido para o suporte de amostra do microscópio. Dentro do microscópio, a planta cresce em sua posição vertical natural. As raízes crescem em meio líquido, enquanto as folhas permanecem no ar.
Um sistema de iluminação ilumina apenas as folhas. A superfície da água é coberta para manter as raízes na escuridão. Uma das principais vantagens dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a incorporação da raiz dentro do gel, é que estamos acostumados a cultivar plantas na superfície de um gel.
Portanto, podemos seguir o mesmo protocolo de cultivo de antes. E segundo, a raiz está em contato direto com o meio líquido, que pode ser trocado por tratamentos medicamentosos, por exemplo. Despeje 30 mililitros de meio MS semi-forte recém-autoclavado contendo 1,5% de fitogel em uma placa de Petri quadrada para criar uma camada de cerca de 2 milímetros.
Semeie sementes estéreis lado a lado com pelo menos um centímetro de espaço entre elas. Em seguida, enrole o prato com uma fita de microporos. Cultive a placa em sua incubadora de crescimento verticalmente por até 10 dias.
Neste experimento, usamos plantas de seis dias de idade para observar o desenvolvimento das raízes laterais. Fornecemos um modelo para impressão 3D do suporte de amostra. Testamos diferentes materiais.
As resinas transparentes foram mais adequadas em termos de rigidez e resistência à água. Uma descrição detalhada das dimensões para usinar um porta-amostras de material sólido é descrita no manuscrito. Corte o gel ao redor da planta usando um bisturi.
Em seguida, pegue o bloco de gel no qual a planta está crescendo e transfira-o cuidadosamente para o porta-amostras. Derreta 1% de aggros a 80 graus Celsius e resfrie até 33 graus Celsius. Cole o bloco de gel no porta-amostras e cole a planta no gel com cuidado.
Use um microscópio estéreo para verificar a posição da planta e certifique-se de que a região de interesse não esteja coberta por nenhum gel. Para evitar que a planta seque, deslize o porta-amostras em uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros sempre que possível. Coloque o suporte em uma caixa de pipeta e prepare mais amostras, se necessário.
Nosso microscópio é um clássico de rotação aberta sem grandes modificações. Implementamos um sistema de iluminação para cultura de plantas dentro do microscópio. Os LEDs vermelho e azul estão dispostos em um anel.
Pares de LEDs podem ser ligados e desligados individualmente para iluminação direcional. O espectro do sistema de iluminação corresponde ao de nossas câmaras de crescimento. Quase toda a iluminação proveniente dos LEDs é bloqueada pelo filtro de emissão para GFP.
Não conseguimos detectar nenhuma luz difusa atingindo a câmera. Assim, a luz pode ser mantida acesa durante a geração de imagens. A intensidade da luz pode ser ajustada, variando de 30 a 250 micro moles por metro quadrado por segundo.
Aparafuse ou cole o anel de LED na parte inferior do braço de giro aberto. Monte-o de volta ao microscópio e conecte os fios. Monte o sistema de profusão.
Conecte os tubos à câmara de amostra em um arranjo unidirecional. Ajuste a velocidade para um mililitro por minuto. Adicione três quadrados de milímetros de uma folha de plástico preta estéril e distribua-os na superfície da água.
Insira a amostra no microscópio. Verifique se não há folhas de plástico grudadas no porta-amostras. Feche a câmara com duas tampas feitas de papel alumínio preto.
Acenda a luz e ajuste a intensidade da luz. Apague a luz da sala e comece a gravar. Este método permite registrar o crescimento radicular ao longo de várias horas até dias, apresentado aqui pelo crescimento de uma raiz lateral.
Imagens de uma pilha z de um único ponto de tempo mostram boas propriedades seccionais ópticas. Captamos todo o processo de formação da raiz lateral em 3D, o que nos permite estudar a dinâmica desse processo. Olhar para uma única fatia desta gravação mostra uma boa resolução, mesmo no fundo da raiz.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão clara do método de preparação de amostras de plantas para microscopia de folha de luz. Seguindo este protocolo, agora podemos observar a localização de proteínas intracelulares ou padrões de expressão gênica durante a organogênese, tropismos de plantas ou adaptação de plantas. Isso nos ajudará a entender a regulação espaço-temporal do desenvolvimento das plantas.
Visão geral
Este protocolo demonstra um método de preparação de amostra de plantas para microscopia de luz em folha, permitindo a observação a longo prazo do desenvolvimento dos órgãos das plantas. A configuração envolve o cultivo de plantas em uma superfície de gel sob condições controladas, permitindo imagens detalhadas sem alterar o crescimento das plantas.
Componentes principais do estudo
Área da ciência
- Biologia vegetal
- Técnicas de microscopia
- Biologia do desenvolvimento
Fundo
- A microscopia de luz em folha fornece uma técnica de imagem não invasiva.
- Métodos tradicionais podem alterar o desenvolvimento das plantas.
- Condições controladas são cruciais para observações precisas.
- Plântulas de Arabidopsis são comumente usadas para tais estudos.
Propósito do estudo
- Adquirir observações a longo prazo de sistemas radiculares de plantas.
- Desenvolver um método de preparação de amostra suave.
- Utilizar técnicas de imagem que não interfiram no crescimento das plantas.
Métodos utilizados
- As plantas são cultivadas em uma fina camada de gel.
- O bloco de gel é transferido para um suporte de amostra do microscópio.
- Um sistema de iluminação é implementado para condições ideais de crescimento.
- As imagens capturam a dinâmica do crescimento das raízes ao longo do tempo.
Principais resultados
- Imagem bem-sucedida da formação de raízes laterais em 3D.
- Boas propriedades ópticas observadas em imagens de z-stack.
- O método permite o estudo de processos intracelulares.
- Facilita a compreensão da regulação espacial-temporal nas plantas.
Conclusões
- Este método melhora a capacidade de observar o desenvolvimento das plantas.
- Apoia pesquisas sobre expressão gênica e localização de proteínas.
- Fornece uma abordagem padronizada para estudos futuros.
Perguntas frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables long-term, high-resolution imaging of plant root systems under controlled conditions, supporting mechanistic studies of organogenesis and developmental dynamics. By preserving natural growth while allowing liquid medium exchange, it facilitates compound screening and target validation in plant-based model systems. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking cellular phenotypes to tissue-level responses in a reproducible, scalable format.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct observation of cellular dynamics during organogenesis.
- Operational Value: Supports biological de-risking by visualizing target engagement in intact, developing tissues.
- Predictive Value: Links molecular perturbations to phenotypic outcomes in a physiologically relevant context.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation with liquid medium exchange capability.
- Quantitative Outputs: Generates 3D temporal datasets enabling precise measurement of structural and functional changes.
- Platform Reuse: Standardized sample holder design allows scalability across multiple experimental campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Provides a disease-relevant system for studying root tropisms and adaptive responses to environmental stimuli.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase imaging with preclinical validation through consistent, non-invasive readouts.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target validation by correlating molecular changes with structural development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling iterative refinement of biological targets based on dynamic phenotypic data.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing cellular processes in real time within native tissue architecture.
- Screening: Enables reliable compound evaluation through standardized mounting and liquid medium perfusion.
- Analytics: Delivers high-resolution spatial-temporal readouts that facilitate comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects early mechanistic insights to preclinical models via conserved developmental processes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform adaptable to diverse plant species and experimental variables.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized gel-based mounting and controlled illumination.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct visualization of biological responses to perturbations.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through quantitative, longitudinal phenotypic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant biology, microscopy, and microfluidic sample handling.
- Depends on light-sheet microscopy infrastructure with customizable LED lighting and environmental control.
- Necessitates standardization of gel preparation, sample transfer, and illumination protocols across teams.
- Involves adaptation considerations for different plant species, growth media, and compound solubility profiles.
- Limited by the need for optical transparency and compatibility between gel materials and imaging wavelengths.
