Name: Derivação de culturas leptomeninges explantes de Postmortem Cérebro humano Doadores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Aprenda a técnica de cultura de explantes de leptomeninges de cérebro humano post-mortem para derivar fibroblastos meníngeos fibronectina-positivos. Este método permite estudar linhagens celulares de pacientes com doença de Parkinson.

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O desenvolvimento deste protocolo foi financiado por doações privadas direcionadas ao Programa de Doação de Cérebros do Instituto de Parkinson.

O registro de doação do cérebro inclui a documentação, o registando a sua intenção de doar. A permissão da autópsia para a recuperação do tecido é fornecido pelo parente mais próximo, conforme permitido por lei. Pesquisas utilizando amostras de autópsia recolhidos são analisados ​​pelo conselho de revisão institucional (IRB) para garantir o cumprimento Health Insurance Portability e Accountability Act normas (HIPAA). NOTA: As amostras leptomeninges são recolhidos pelo dissector cerebral ou neuropatologista durante uma dissecção cérebro e são armazenados em 50 tubos cônicos mL contendo 25-30 mL meninges meios de crescimento. A amostra é armazenada a 4 ° C até à preparação da amostra. O tratamento deve ser realizado tão rapidamente quanto possível, a viabilidade das células diminui com o tempo de pós-mortem. 1. Set-up antes de iniciar o leptomeninges Dissection NOTA: As etapas 1,1-1,3 devem ser executadas dentro de uma cabine de segurança biológica. <ol><li> Prepare meio de crescimento meninges através da combinação de 375 mL de Dulbecco Modified Eagle Media, 100 mL de soro bovino fetal, 5 ml 10 mM de aminoácidos não essenciais, 5 mL de 200 mM de L-alanil-L-glutamina, 5 mL de piruvato de sódio 100 mM, 5 ml 10000 U / mL de penicilina / estreptomicina e 5 ml de 250 ug / mL de anfotericina B, em 500 mL unidade de filtro. Filtrar e misturar. Use a mídia por até quatro semanas. </li><li> Coloque todos os materiais na cabine de segurança biológica, antes de iniciar a dissecção: pratos de Petri 4x, 2x placas de 6 poços, 2x escalpelos esterilizados, 15-20 lamelas de 15 mm, tampão fosfato salino (PBS), pipetas serológicas, aspirando pipetas. </li><li> Adicionar 1 ml de solução esterilizada por autoclave de gelatina a 0,1% a cada poço de uma placa de 6 poços. Colocou o prato de lado por 30-60 min. Prepare 2x placas de 6 poços. </li></ol> 2. Preparação de leptomeninges Amostra NOTA: As etapas 2,1-2,3 devem ser executadas dentro de uma cabine de segurança biológica. <ol><li> Adicionar aproximadamente 10 mL de PBS paraa 10 cm de placa de cultura de tecido estéril e colocar a amostra no prato meninges. Utilizando uma pinça, lavar cuidadosamente leptomeninges com PBS para remover o sangue. </li><li> Transferir as meninges para uma nova placa de cultura de tecidos de 10 cm contendo 10 ml de PBS fresco e continuar a lavar. Repita como necessário para remover o máximo de sangue possível. </li><li> Usando dois bisturis, cortados leptomeninges tecido em uma cerca de 6 cm x 6 cm grande pedaço. </li><li> Coloque a tampa sobre um prato de cultura e transferência para um microscópio de dissecação numa câmara de fluxo laminar horizontal. </li></ol> 3. Dissecção da leptomeninges Tissue NOTA: As etapas 3,1-3,3 devem ser executadas dentro de uma câmara de fluxo laminar horizontal usando um microscópio de dissecação. <ol><li> Remover os vasos sanguíneos a partir de uma região sobre a peça leptomeninges (passo 2.3) suficientemente grande para criar pelo menos 20-25 3 peças mm x 3 mm. Segure as leptomeninges em lugar com um bisturi e com a outra, usar um mo raspagem suave e superficialção para separar os vasos. </li><li> Cortar pequenos quadrados de tecido da região preparado. Corte em um processo passo a passo pela primeira confecção de peças maiores e, em seguida, cortando os em seções menores. </li><li> Usar um bisturi para manter o tecido no lugar e outra bisturi para cortar o tecido com um movimento de balanço. Devido à consistência do tecido, é difícil para deslizar os bisturis uns contra os outros. Isso só vai rasgar o tecido distante e resulta em bordas irregulares. </li><li> Continue cortando as peças pela metade até que haja cerca de 20-25 peças 3 mm x 3 mm. </li></ol> 4. Transmissão de dissecado meninges partes em placas de cultura de tecidos NOTA: Passo 4 deve ser efectuado dentro de uma cabine de segurança biológica. <ol><li> gelatina aspirado a partir da placa de 6 poços (a partir do passo 1.3). Adicionar 1 mL de meio de crescimento meninges a cada poço. Utilizando uma pinça estéril, colocar 3-4 peças de biópsia em cada poço. </li></ol> 5. A colocação de tampa desliza sobre Meninges Pieces NOTA: As etapas 5,1-5,2 devem ser executadas dentro de uma câmara de fluxo laminar horizontal usando um microscópio de dissecação. <ol><li> Cubra os pedaços com 1-2 lamelas circulares de 15 mm estéreis por poço. </li><li> Pressionar firmemente com uma pinça para garantir que as peças são tocar no fundo da placa. Isto permite a fixação das peças de tecido para o fundo do poço. </li><li> Colocar a placa de 6 poços a uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. </li></ol> Manutenção Cultura 6. celular NOTA: As etapas 6,1-6,3 devem ser executadas dentro de uma cabine de segurança biológica. Lidar com placas de cultura com cuidado como lamelas não deve se mover e deslocar as peças meninges. <ol><li> Após 2 dias em cultura, adicionar um adicional de 1 ml de meio de crescimento fresco as meninges a cada poço. </li><li> No dia 7, aspirar cuidadosamente os meios de comunicação e adicionar 2 mL de meio fresco a cada poço. </li><li> Após o Dia 9, continuam a mudar meios de crescimento a cadaoutro dia até que a cultura se torna confluente. </li></ol> 7. Passaging NOTA: Todas as etapas devem ser executadas dentro de uma cabine de segurança biológica. Uma vez que os fibroblastos meníngeos ter migrado para fora dos pedaços de tecido das meninges e começam a crescer em direcção as bordas do recipiente de cultura, expandir fibroblastos meníngeos em maior placa de cultura. <ol><li> Antes de iniciar o Passaging, revestir a placa de cultura com 1% de gelatina durante 15-30 min. </li><li> media aspirado de 6 poços prato e lavar as células com 2 ml PBS. </li><li> Adicionar 1 ml de tripsina / EDTA a cada poço e incubar a 37 ° C durante 5-10 min. Não é necessário retirar as peças de cobertura ou do tecido meníngeo para este passo. </li><li> Quando as células são arredondadas e começar a destacar, adicionar 2 mL de meio de cultura. </li><li> células de pipeta cima e para baixo para interromper completamente todos os aglomerados e transferir a solução de célula para maior prato de cultura. </li><li> Usar uma proporção de 1: 3 a 1: 4 para combinar as células a partir de três pratos de 6 poços empara uma placa de cultura T75. </li><li> Uma vez que as células de fibroblastos meníngeas estão confluentes em frascos de cultura T75, trypsinize as células, e criopreservar em meios de criopreservação a 1x10 6 células / ml por frasco. Um balão de cultura T75 com fibroblastos meninges confluentes contém cerca de 5-7 milhões de células. </li></ol> 8. Caracterização dos fibroblastos Meníngeas por imunocoloração NOTA: Antes de iniciar o procedimento, preparar solução de paraformaldeído a 4%, soro de cabra normal a 5% em PBS (tampão de bloqueio), 0,3% de Triton X-100 em PBS (tampão de permeabilização), soluções de anticorpos primários e secundários, e 1 ug / mL de Hoechst 33342 diluído em PBS a partir de 10 mg estoque / mL. <ol><li> Semente de 15.000 a 30.000 fibroblastos meníngeos em slides câmara de 8 poços revestidos com gelatina a 0,1%. </li><li> Depois de 24 h, quando as células são ligadas, fixar as células em 100 uL de paraformaldeído a 4% por poço, durante 10 min à temperatura ambiente. Lavar os poços 3 vezes com PBS 1x. </li><li> Permeabilizar as células com 150 uL de 0,3% de Triton X-100 durante 5 min à temperatura ambiente. Lavar os poços 3 vezes com PBS 1x. </li><li> Adicionar 200 uL de solução de bloqueio (PBS + 5% de soro normal de cabra) durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar a solução de bloqueio e adicionar 150 uL de anticorpos primárias desejadas diluído em solução de bloqueio. Para double-coloração, prepare diluições de trabalho dos anticorpos primários em tubos de centrífuga separados no gelo como se segue: <ol><li> Prepare a diluição de 1: 300 de anti-fibronectina + 1: 200 de diluição de anti-nestina em solução de bloqueio. Prepare diluição 1: 250 de anti-SERPINH1 + 1: 1000 diluição de anti-TUJ1 em solução de bloqueio. Prepare 1: 250 de diluição de anti-SERPINH1 + 1: 100 de diluição de anti-SOX2 em solução de bloqueio </li></ol></li><li> Incubar a 4 ° C durante a noite. </li><li> Lavar os poços 3 vezes com PBS 1x. </li><li> Prepare um trabalho diluição 1: 400 de fluorescente etiquetado anticorpos secundários de cabra anti-coelho (verde; Ex / Em 2 </saté&gt; 495/519 nm) e de cabra anti-ratinho (vermelho; Ex / Em 590/617 nm 2) em solução de bloqueio e adicionar 100 uL a cada poço. Incubar durante 1 h, no escuro, à temperatura ambiente. Em seguida, lave os poços uma vez com PBS 1x. </li><li> Adicionar 100 uL de 1 ug / ml de Hoechst 33342 (azul; Ex / Em 358/461 nm 2) solução a cada poço e incuba-se no escuro durante 3 min. Lavar os poços 3 vezes com 1x PBS, deixando na final de lavagem 1x PBS no poço, e cobrir o slide com folha de alumínio. </li><li> Analise as células sob microscópio fluorescente. </li></ol>

<ol><li>Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meninges%3A+from+protective+membrane+to+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Meninges: from protective membrane to stem cell niche.</a> Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).</li>
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<li>Adler, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+clinical+diagnostic+accuracy+of+early+vs+advanced+Parkinson+disease%3A+clinicopathologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study.</a> Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).</li>
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<li>Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisystem+Lewy+body+disease+and+the+other+parkinsonian+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders.</a> Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> J Vis Exp. (77), e3779(2013).</li>
<li>Byers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNCA+triplication+Parkinson%27s+patient%27s+iPSC-derived+DA+neurons+accumulate+alpha-synuclein+and+are+susceptible+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SNCA triplication Parkinson's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress.</a> PLoS One. 6 (11), e26159(2011).</li>
<li>Sanders, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+mutations+cause+mitochondrial+DNA+damage+in+iPSC-derived+neural+cells+from+Parkinson%27s+disease+patients%3A+reversal+by+gene+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson's disease patients: reversal by gene correction.</a> Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).</li>
<li>Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+%28iPSC%29-derived+dopaminergic+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson's disease.</a> Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo descreve um protocolo simples e robusto para derivar de uma cultura de fibroblastos a partir de meninges leptomeninges postmortem humanos recolhidos em conjunto com uma doação cérebro. Há muito poucas descrições de protocolos para derivar culturas de células a partir de material humano post-mortem. Dois estudos descrevem culturas de fibroblastos 7, 8, derivados de pele 9, um estudo descreve amostras da dura <sup ...

Meninges constituído por três membranas que protegem o cérebro: dura-máter máter, aracnóide e pia. Mais recentemente, tem sido reconhecido que as meninges também desempenham um papel importante no desenvolvimento do cérebro e do cérebro 1 homeostase. Meninges são derivadas de mesênquima e células derivadas da crista neural e interessantemente, foi mostrado que as células progenitoras que residem em meninges pode dar origem a neurónios in vitro e in vivo após o transplante 2, 3, 4. Culturas meninges foram também utilizados com sucesso como camadas alimentadoras, como eles possuem actividade indutora derivada de células de estroma para a diferenciação de células estaminais embrionárias em neurónios dopaminérgicos 5. Além disso, leptomeninges têm o potencial para se diferenciar em neurónios directamente, astrócitos, oligodendrócitos e sob condições isquémicas 6. Para este protocolo, as amostras de meninges pós-morte humanos são recolhidos a partir do aracnóide e pia, chamados coletivamente os leptomeninges, e são adquiridos como parte de uma doação cérebro humano para fins de pesquisa. Dissecção do cérebro é realizada dentro de 24 h da morte e da amostra leptomeninges é colocado em meio de cultura frio para posterior processamento dentro do próximo 6-8 h, conforme ilustrado aqui neste protocolo. Este protocolo descreve a dissecção e a preparação de amostras de meninges humanos para o desenvolvimento de culturas de células primárias leptomeninges paciente. O tecido é cortado em pedaços de aproximadamente 25-30 3 mm x 3 mm quadrados. Três peças são colocadas em cada poço de 6 poços e realizou-se com lamelas de vidro redondas revestidas com gelatina. A dissecção meninges leva cerca de 25-35 minutos. O principal desafio com esta cultura é a esterilidade como a aquisição cérebro, transporte e dissecção geralmente não são realizados em condições estéreis. Tor conseguinte, é importante para completar o meio de cultura com um cocktail de penicilina, estreptomicina, e anfotericina B e usar pratos de poços múltiplos para separadamente pedaços de tecido de cultura. Crescimento de fibroblastos meníngeos ocorre geralmente dentro da primeira semana. Meios é mudada a cada dois ou três dias até que as células estão confluentes, e as células são passadas enzimaticamente. Os fibroblastos meninges são criopreservadas em 1 milhão de células por mL / recipiente em mídia criopreservação. Com este protocolo, 20-30 milhões de fibroblastos meninges pode ser derivado de 6-8 semanas para a criopreservação. aplicações a jusante desses fibroblastos meninges são culturas primárias para a pesquisa da doença, a diferenciação neuronal direta ou derivação de células-tronco pluripotentes induzidas a partir das leptomeninges para a compreensão dos mecanismos da doença e para o desenvolvimento de drogas.

<table><tbody><tr><td>Placas de Petri Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Placa de 6 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-83 15CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>Bisturis, lâmina estéril, No. 15</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de ponta de precisão curva</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230490</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de fosfato Salino</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30264.02</td><td></td></tr><tr><td>Corning Unidade de filtro de 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>430770</td><td>Combine componentes de mídia e filtro.</td></tr><tr><td>Frascos Tratados com Cultura de Células Nunc com Tampas de Filtro, T175 cm2&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>178883</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Growth Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyclone DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30081.02</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>Fisher Solução de</td> Aminoácidos Não Essenciais Scientific <td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>MEM (100x)</td><td>Suplemento Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio (100 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B (Solução Amarela/250 &micro; g/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264520</td><td></td></tr><tr><td>Bambanker Freeze 120 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9582225</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Coloração de Fibronectina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 lâminas de câmara de poço&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1256518</td><td></td></tr><tr><td>20% de paraformaldeído&nbsp;</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>100% Glicerol&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>9455</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra 100% normal</td><td>Fisher Scientific</td><td>101098-382</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-fibronectina [F1]</td><td>Abcam</td><td>ab32419</td><td>diluição 1:300 em solução de bloqueio</td></tr><tr><td>Anti-SERPINH1</td><td>Sigma</td><td>S5950-200ul</td><td>diluição 1:250 em solução de bloqueio</td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Millipore</td><td>MAB4343</td><td>diluição 1:100 em solução de bloqueio</td></tr><tr><td>Anti-Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>1:200 diluição em solução de bloqueio</td></tr><tr><td>Anti-TUJ1</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>diluição 1:1.000 em solução de bloqueio</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-coelho</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11029</td><td>diluição 1:400 em solução de bloqueio; (canal verde; Ex/Em2 495/519 nm)&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 anti-mouse</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21424</td><td>diluição 1:400 em solução de bloqueio; (canal vermelho; Ex/Em2 590/617 nm)&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 mancha</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td>diluir a uma concentração final de 1,0 &mu; g/mL; (canal azul; Ex/Em2 358/461 nm)</td></tr><tr><td colspan="4">Fornecedores são sugestões, produtos similares de fornecedores alternativos também podem ser usados.</td></tr></tbody></table>

derivação de culturas leptomeninges explantes de postmortem cérebro humano doadores

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Apesar de grandes progressos foram feitos na caracterização clínico da doença de Parkinson, vários estudos relatam que o diagnóstico da doença de Parkinson não é patologicamente confirmada em até 25% da doença clinicamente diagnosticada de Parkinson. Portanto, o tecido coletadas de pacientes com diagnóstico clínico de doença de Parkinson idiopática pode ter uma alta taxa de erros de diagnóstico; portanto, os estudos in vitro a partir de tais tecidos para estudar a doença de Parkinson como um modelo pré-clínico pode tornar-se inútil. Através da recolha leptomeninges humanos pós-mortem com um diagnóstico neuropatológico confirmado de doença de Parkinson e caracteriza-se por perda de células nigroestriatal e inclusões de proteínas intracelulares denominadas corpos de Lewy, pode-se ter a certeza de que o parkinsonismo clinicamente observada não é causado por um outro processo de doença subjacente (por exemplo, de tumores, arteriosclerose). Este protocolo presents a dissecação e preparação de leptomeninges humanos pós-morte para derivação de uma cultura de fibroblastos meníngea. Este processo é robusto e tem uma elevada taxa de sucesso. O desafio da cultura é esterilidade como a aquisição cérebro geralmente não é realizado sob condições estéreis. Portanto, é importante para completar o meio de cultura com um cocktail de penicilina, estreptomicina, e anfotericina B. A derivação de fibroblastos meninges de casos de autópsia-confirmadas com a doença de Parkinson fornece a base para a modelagem in vitro da doença de Parkinson. fibroblastos meninges aparecem 3-9 dias após a preparação da amostra e cerca de 20-30 milhões de células podem ser criopreservados em 6-8 semanas. A cultura de fibroblastos meníngea é homogéneo e as células expressam fibronectina, um marcador comumente usado para identificar as meninges.

Quando o protocolo de processamento tem sido bem sucedida leptomeninges, crescimento de fibroblastos meníngeos primeiro se observa três a nove dias após a dissecação, embora isso possa depender do comprimento do intervalo pós-mortem de cérebro. A Figura 1 demonstra culturas de fibroblastos meninges de quatro doadores diferentes. A Figura 1A mostra um pedaço leptomeninges pressionada por uma lamela de vidro (linha diagonal escuro) e crescimento de fibrobl...

O protocolo de cultura leptomeninges explante a partir de cérebro pós-morte humana é uma forma tecnicamente robusta e simples para derivar fibroblastos meninges fibronectina-positiva dentro de 6-8 semanas e criopreservação de aproximadamente 20-30 milhões de células.

Derivação de culturas leptomeninges explantes de Postmortem Cérebro humano Doadores

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Eu sou Birgitt Schule, diretora do Programa de Doação de Cérebro do Instituto e Centro Clínico de Parkinson. Neste vídeo, descrevemos uma técnica para cultura de células de explante e duração de fibroblastos primários de leptomeninges do cérebro humano post-mortem de pacientes com doença de Parkinson. Esses fibroblastos podem ser usados para uma variedade de aplicações, incluindo ensaios baseados em células.Isso é importante, porque podemos estudar linhagens celulares de casos comprovados por autópsia de doença de Parkinson esporádica com patologia de corpos de Lewy. Comece colocando todos os materiais necessários na capa de cultura de tecidos. Todos os objetos que entram no capô devem ser borrifados com etanol 70% e limpos.O primeiro passo é transferir as meninges do tubo para a placa de corte. Comece despejando aproximadamente 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato em uma placa de corte estéril de 10 centímetros. Aqui você pode ver as meninges.Usando uma pinça estéril, transfira cuidadosamente as meninges para a placa de corte. Execute esta etapa lentamente para evitar rasgos. O próximo passo é lavar as meninges em PBS para remover o máximo de sangue possível.Se sua amostra estiver muito ensanguentada, você pode considerar transferi-la para outro prato de corte. Adicione mais 10 mililitros de PBS em um prato fresco de 10 centímetros. Repita esta lavagem para continuar removendo o sangue das meninges.Por fim, transfira as meninges para um prato fresco de 10 centímetros contendo PBS. Quando terminar, cubra o prato e transfira-o para o microscópio de dissecação na capela de fluxo laminar. O próximo passo é continuar seccionando as meninges em pedaços menores.Usando dois bisturis estéreis, separe suavemente os vasos sanguíneos das meninges com um movimento de raspagem superficial. Prepare uma região grande o suficiente para cortar cerca de 18 pedaços de 3 milímetros por 3 milímetros, como mostrado nesta imagem. Em seguida, pegue o bisturi e, usando um movimento de balanço, corte a região preparada em pedaços de 3 milímetros por 3 milímetros.É mais fácil fazer isso em um processo gradual, primeiro cortando as meninges em pedaços maiores e depois cortando esses pedaços em seções menores. Cubra a placa de corte e transfira-a de volta para a capa de cultura de tecidos. Em seguida, prepare-se para transferir as meninges para uma placa de cultura de tecidos de seis poços que foi bastante revestida com 1 mililitro de gelatina a 0,1% por 30 a 60 minutos.Adicione um mililitro de meninges médias em cada poço. Em seguida, com uma pinça estéril, transfira de três a quatro pedaços de meninges para o centro de cada poço. As células cultivadas nesta placa serão uma passagem zero.A próxima etapa usa lamínulas para garantir que as peças de meninges fiquem estacionárias e permaneçam em contato com a placa de cultura. Coloque uma lamínula circular estéril de 15 milímetros sobre as peças de meninges. Se necessário, reposicione as peças de meninges com uma lamínula.Em seguida, usando a pinça, pressione firmemente a lamínula para garantir que as peças estejam tocando a placa. Esta imagem mostra as peças de meninges mantidas no lugar com uma lamínula. Coloque a tampa sobre a placa de seis poços e transfira cuidadosamente a placa para uma incubadora ajustada para 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Após dois dias de cultura, adicione mais um mililitro de meninges médias frescas a cada poço. Aos sete dias, aspire a mídia. Em seguida, reabasteça cada poço com 2 mililitros de mídia fresca.Após o sétimo dia, continue a reabastecer os poços com 2 mililitros de meio fresco a cada dois dias. Esta imagem mostra o dia inicial das peças de meninges e cultura em microscópio invertido. Após cerca de seis a nove dias, a ligação celular no primeiro crescimento pode ser observada.Entre 15 a 19 dias, o número de células aumenta e o crescimento torna-se mais denso. Os fibroblastos meníngeos são caracterizados pela expressão de fibronectina. Essas imagens mostram células meníngeas cultivadas que foram coradas e são positivas para fibronectina.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como derivar culturas de explante de leptomeninges de doadores de cérebro humano post-mortem. Essa técnica fornece uma maneira simples e robusta de derivar fibroblastos meníngeos dentro de três a seis semanas e permite armazenar de 15 a 20 milhões de células em um número de passagem baixo.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este artigo descreve métodos para derivar populações enriquecidas de células precursoras de oligodendrócitos murino (OPCs) em cultura primária, que se diferenciam para produzir oligodendrócitos maduros (MQO). Além disso, este relatório descreve as técnicas para produzir murino myelinating co-culturas semeando OPCs do mouse sobre uma cama de neurite do mouse neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRGNs).

Derivação de Enriquecido Culturas oligodendroglial e Neuron / oligodendroglial Myelinating Co-culturas de tecidos pós-natais murino

Este protocolo descreve a derivação de gliais Precursores restritos a partir de medulas espinais fetais e mantido in vitro, quer para transplantação ou para o estudo da linhagem oligodendrocytic.

Derivação da glia Precursores restritos de camundongos E13

Este vídeo demonstra uma técnica para preparar culturas de fatias flutuantes a partir do cérebro humano adulto. Fatias finas são geradas a partir de uma seção do cérebro usando um vibratome. Essas fatias são então suspensas em um meio de cultura suplementado com fatores de crescimento para manter a viabilidade do tecido.

Preparando culturas de fatias flutuantes a partir de um cérebro humano adulto

Este vídeo demonstra uma técnica para estabelecer uma cultura tridimensional de células gliais. As células gliais derivadas do cérebro de rato são encapsuladas em uma matriz polimérica fotoreticulável contendo componentes da matriz extracelular. Ao incubar em um meio de crescimento, as células gliais proliferam dentro da matriz de suporte para criar uma cultura tridimensional.

Estabelecendo uma cultura tridimensional de células gliais derivadas do cérebro de rato

O ventricular líquido cefalorraquidiano (LCR) banha os neuroepiteliais e cerebral células progenitoras corticais durante o desenvolvimento do cérebro no início do embrião. Aqui descrevemos o método desenvolvido para isolar CSF ventricular de embriões de roedores de idades diferentes, a fim de investigar a sua função biológica. Além disso, podemos demonstrar o nosso dissecção explante cerebral cortical e técnica de cultura que permite o crescimento de explantes com volumes mínimos de meio de...

Isolamento de fluido cerebrospinal de embriões de roedores para uso com dissecados Cerebral Cortical Explantes

Este protocolo descreve um método para rastrear trajetórias individuais de envelhecimento cerebral através de um programa de doação cerebral e caracterização adequada de cérebros. Doadores cerebrais estão envolvidos em um estudo longitudinal de longo prazo, incluindo avaliações multidimensionais em série. O protocolo contém uma descrição detalhada do processamento cerebral e uma metodologia de diagnóstico precisa.

Protocolo do Banco Cerebral Abbiategrasso para coleta, processamento e caracterização de cérebros envelhecidos

Descrevemos uma injeção intracisternal que emprega uma agulha dobrada na ponta que pode ser estabilizada no crânio, eliminando assim o risco de dano ao parênquima subjacente. A abordagem pode ser usada para mapeamento do destino genético e manipulações de células leptomeningeais e para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano.

Indução da Modificação das Células Leptomenínias via Injeção Intracisternal

Este artigo apresenta dois protocolos otimizados para examinar células imunes residentes e derivadas periféricas dentro do sistema nervoso central, incluindo cérebro, medula espinhal e meninges. Cada um desses protocolos ajuda a determinar a função e a composição das células que ocupam esses compartimentos em condições de estado estacionário e inflamatório.

Isolando Tecidos do Sistema Nervoso Central e Meninges Associadas para Análise a Jusante de Células Imunes

Este protocolo apresenta uma maneira única de gerar culturas de células do sistema nervoso central a partir de cérebros embrionários de camundongos do dia 17 para pesquisa em neuro(imuno)logia. Este modelo pode ser analisado usando várias técnicas experimentais, incluindo RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria de fluxo.

Estabelecendo culturas mistas de células neuronais e gliais de cérebros embrionários de camundongos para estudar infecção e imunidade inata

As células endoteliais linfáticas leptomeníngeas (LLECs), um tipo de célula intracraniana recentemente identificado, têm funções pouco compreendidas. Este estudo apresenta um protocolo reprodutível para a colheita de LLECs de camundongos e estabelecimento de culturas primárias in vitro . Este protocolo é projetado para permitir que os pesquisadores se aprofundem nas funções celulares e potenciais implicações clínicas de LLECs.

Colheita e Cultura Primária de Células Endoteliais Linfáticas Leptomeníngeas

Este artigo descreve um protocolo para a propagação de células tumorais circulantes do líquido cefalorraquidiano (LCR-CTCs) coletadas de pacientes com doença leptomeníngea associada ao melanoma (M-LMD) para desenvolver modelos pré-clínicos para estudar M-LMD.

Ex Vivo Cultura de Células Tumorais Circulantes no Líquido Cefalorraquidiano de Pacientes com Melanoma para Estudo da Doença Leptomeníngea Associada ao Melanoma

Aprenda a técnica de cultura de explantes de leptomeninges de cérebro humano post-mortem para derivar fibroblastos meníngeos fibronectina-positivos. Este método permite estudar linhagens celulares de pacientes com doença de Parkinson.

Derivação de culturas leptomeninges explantes de Postmortem Cérebro humano Doadores

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