Name: Preparação e cultivo de células precursoras Miogênica / mioblastos primárias de músculo esquelético de Adulto e Idoso Humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar mioblastos primários de músculo esquelético humano adulto e idoso. Este protocolo reprodutível preserva o fenótipo celular para estudos funcionais de homeostase muscular e envelhecimento.

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Este trabalho é apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Biotecnologia e Ciências Biológicas (BBSRC; BB / L021668 / 1), o MRC e a Arthritis Research UK como parte do MRC - Arthritis Research UK Centre for Integrated Research into Musculoskeletal Ageing (CIMA) e do Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (097826 / Z / 11 / A). Os autores gostariam de agradecer à Dra. Dada Pisconti (Universidade de Liverpool) por sua experiência e conselhos no isolamento de células progenitoras musculares.

Todos experimentação envolvendo tecido humano aqui descrito foi previamente aprovado pela Universidade de Liverpool, Hospital Universitário de Aintree Hospital e Comitê de Ética South West Wales Research (Aprovação No: 13 / WA / 0374) e os experimentos foram realizados de acordo com orientações de boas práticas. A Universidade de Liverpool agiu como a ética patrocinar para este estudo. Todos os doadores deram consentimento informado para a inscrição deste estudo. Os músculos foram isolados de pessoas (IMC &lt;25): adultos: 30 ± 2,8 anos de idade e idade: 69 ± 5 anos de idade. 1. Preparação para a Cultura <ol><li> Revestimento de superfícies de cultura com laminina <ol><li> Preparar uma solução de trabalho de 10 ug / ml de laminina em 1X DPBS (Dulbecco Salina Tamponada com Fosfato). </li><li> Pipetar uma quantidade mínima de solução de laminina para cobrir completamente a superfície sobre a qual as células vão ser banhado (Tabela 1). incubar tele prato de cultura, pelo menos, 30 min numa atmosfera humidificada de 37 ° C, 5% de CO2 antes do plaqueamento das células. Lidar com laminina com cuidado, evitando o uso de vórtice. A solução de trabalho de 10 ug / ml de laminina diluída em DPBS pode ser armazenado a 4 ° C e re-utilizada várias vezes. </li><li> Usar um 60 milímetros (20 cm2) numa caixa de Petri ou 2 poços de uma placa de 6 poços (2 x 10 cm2) por ~ 18-19 mg de músculo esquelético a chapear as células (5,50 x 10 4 células no total). Realizar contagem de células em todos os momentos quando chapeamento células para estudos funcionais. NOTA: As amostras foram originalmente obtidas a partir de cirurgias no pé (extensor digitorum brevis, tibial anterior ou músculos abdutores hálux) de pacientes do sexo feminino (adulto: 30 ± 2,8 anos, idade: 69 ± 5 anos de idade, IMC &lt;25). </li></ol></li><li> Preparação da solução enzimática <ol><li> Prepare 250 mM CaCl solução de 2 de trabalho: 277 mg de estoque CaCl 2 em 10 mL 1x DPBS. Filtra-se a assimlução com uma membrana de filtro de 0,2 um e armazenar a 4 ° C. </li><li> Preparar uma solução de trabalho de 1,5 U / mL de colagenase D, 2,4 U / mL de Dispase II e CaCl 2 2,5 mM em DMEM isento de soro (de Dulbecco modificado por Eagle Médium) (Tabela 2). </li><li> Misturar bem e filtra-se a solução enzimática através de uma membrana de filtro de 0,2 um para esterilização. Preparar a solução enzimática com antecedência e congelar para baixo (-20 ° C) em alíquotas para utilização futura. </li></ol></li></ol> 2. Tissue Digestão: Mecânica e enzimática dissociação <ol><li> Após a recolha da amostra, manter músculo a 4 ° C em DPBS até a digestão. Preparar um volume mínimo de 2 ml de colagenase-dispase-CaCl2 por 18 - 19 mg de tecido do músculo e aquecê-la a 37 ° C antes da dissociação de tecidos. </li><li> Imergir a biópsia do músculo brevemente em etanol a 70%, lava-se com DPBS frescos e colocar o tecido sobre uma nova placa de Petri com 1 mL de enzimáticosolução. </li><li> Descarte tanto tecido fibrótico e gordura quanto possível e rasgar o músculo rapidamente, mas com cuidado em pequenos, mas distinguíveis peças (aproximadamente&gt; 0,5 mm2) com tesoura estéril ou um bisturi cirúrgico (lâmina n º 10). </li><li> Transferir a amostra para um tubo de 50 mL com os restantes 1 ml de colagenase-dispase-CaCl2. </li><li> Incubar o tecido a 37 ° C até 30 - 40 min. Mover os tecidos musculares, agitando suavemente o tubo a cada 5-10 min. </li><li> Revista as pipetas com meios para evitar a adesão das células libertadas para as paredes de plástico das pipetas. Adicionar 2 volumes de meio de crescimento estéril, por exemplo, 4 mL de meio DMEM 20% FBS (Soro Fetal Bovino), 1% de L-glutamina e 1% de P / S (Penicilina-Estreptomicina), para parar a digestão. </li><li> Pipetar cima e para baixo várias vezes com uma pipeta de 5 mL para ajudar a libertação das células a partir das fibras musculares. NOTA: A amostra é geralmente completamente dissociado devido ao seu pequeno tamanho. However, se fragmentos de músculos ainda permanecem, utilize uma segunda incubação com as peças restantes de músculo e com uma solução enzimática fresca. </li><li> Filtrar a solução através de músculo de um filtro celular de 70 pM ao longo de um tubo cónico de 50 mL. Lave as células restantes com mais meios e filtro através do filtro. </li><li> Centrifugar a 443 xg durante 5 min à temperatura ambiente para sedimentar as células. Elimine o sobrenadante com cuidado. </li><li> Dissolve-se o sedimento em F-12 media (-12 F mistura de nutrientes de Ham), 20% de FBS, 10% HS (Soro de Cavalo), 1% de P / S, 1% α-glutamina e 2,5 ng / mL de FGF-b ( recombinante humana de fibroblastos factor de Crescimento de base). Aqui, o uso de 4 ml de meio por 60 milímetros de Petri. </li></ol> 3. Sementeira de Células <ol><li> Recolhe-se o vaso de cultura previamente revestidos com 10 ng / ml de laminina da incubadora (secção 1.1). </li><li> remova cuidadosamente o excesso de laminina da placa de cultura, e evite tocar a superfície (ou ele vai perturbar a estrutura da proteína). lavara placa de cultura com DPBS (opcional). </li><li> Placa as células directamente sobre o recipiente revestido laminina e incubar durante 24 horas numa atmosfera humidificada a 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Visualizar as células sob um microscópio de campo brilhante (100X ampliação total) no dia seguinte. Redondo células pequenas ligado à superfície e detritos remanescentes podem ser vistos no meio de cultura. </li><li> Alterar a meios frescos para F-12 meios complementados com 20% de FBS, 10% HS, 1% de P / S, 1% α-glutamina e 2,5 ng / mL de FGF-b. </li></ol> 4. Cultura e Passaging de células <ol><li> Mudar os meios de comunicação a cada 2-3 d e dividir as células assim que os grupos de células são visíveis ao microscópio (ampliação de 100X total, o exemplo da Figura 2, as células de pessoas idosas, passagem 0, após 7 d), a fim de evitar espontânea diferenciação. </li><li> Na primeira passagem (P1), altere a mídia para DMEM alta concentração de glicose complementado com 20% de FBS, 10% HS, 1%P / S, 1% α-glutamina. Evitar o uso de FGF-b a partir de este ponto, como o FGF é um agente mitogénico potente e factor importante no início da cultura, mas pode promover o crescimento excessivo de fibroblastos se utilizado mais tempo em cultura. </li><li> Para passaging celular: <ol><li> Remova a mídia e lavar as células duas vezes com DPBS. </li><li> Adicionar um volume mínimo de 0,25% de EDTA-tripsina para cobrir a superfície das células. Rocha suavemente para assegurar que todas as células estão cobertos pela solução de descolamento, incubar durante 10 segundos à temperatura ambiente, e removê-lo. </li><li> Incubam-se as células numa atmosfera humidificada a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 3-5 min. Toque suavemente e verificar sob o microscópio de luz brilhante (100X ampliação total) que as células são arredondados, mas não completamente separado da superfície. Se nenhuma alteração é observada nas células, incubar durante mais 5 min. </li><li> Adicionar 5 ml de Meio de Crescimento (DMEM alta concentração de glicose complementado com 20% de FBS, 10% HS, 1% P / S, 1% α-glutamina) para recolher as células, misturabem e transferir as células com os novos meios de comunicação para um frasco T75. Lave as células restantes repetindo este passo com outro 5 ml de Meio de Crescimento (10 mL no total para um frasco T75). </li><li> Para preplate (preferível na primeira passagem), incubar as células numa atmosfera humidificada a 37 ° C, 5% de CO2 durante 40 min. Recolher o sobrenadante com as células que não ligam e incubar-los em um novo frasco T75. Isto deverá enriquecer a cultura em mioblastos, como a maioria dos fibroblastos deve ter anexado no primeiro balão. </li></ol></li><li> Mudar os meios de comunicação a cada 2-3 d e dividir as células de 1 a 4, o mais rapidamente à medida que atingem 70% de confluência para um rendimento máximo. </li><li> Para a diferenciação, uma vez que as células atingiram 70-80% de confluência, mudar o meio de cultura com a diferenciação médio (DM): DMEM-elevado teor de glucose complementado com 2% HS, 1% de P / S, 1% α-glutamina. As células devem ser diferenciados dentro de 5 - 7 d, dependendo da qualidade e pureza da c mioblastosultura. </li></ol> 5. Transfecï¿½es Protocolo <ol><li> Semente de 50.000 células / poço numa placa de 12 poços para ensaios MF 20, senescência e viabilidade. células de cultura em lamelas ou em um prato revestido com laminina. Para a coloração de Ki67, semente de 25.000 células / poço numa placa de 12 poços. </li><li> Para as transfecções, seguir o procedimento do fabricante, utilizando 5 mL de reagente de transfecção, 100 nM de controlo microARN imitar ou inibidor, 100 nM de microARN mímica ou 100 nM de inibidor de microARN por poço, com um volume total de 1 mL. </li><li> Alterar a diferenciação Meio 6 h após transfecção (DMEM-elevado teor de glucose complementado com 2% HS, 1% de P / S, 1% α-glutamina). Para as experiências de proliferação, corar as células 2 d após a transfecção; para a senescência, 7 d após a transfecção; e para a coloração MF20, sete dias após a transfecção. </li></ol> 6. imunocoloração das células <ol><li> Ki67, MyoD e MF 20 imunocoloração <ol><li> Prepare bloco 1 (10HS% e 0,1% de Triton X em PBS) e bloquear dois (10% HS e 0,05% de Triton-X em soluções de PBS). Utilizar 500 ul de reagente por poço para uma placa de 12 poços. NOTA: Execute os seguintes passos usando um agitador durante as etapas de incubação. </li><li> Remova a mídia a partir das células. </li><li> Lavar as células com PBS. </li><li> Fixar as células com metanol frio durante 10 minutos em uma cadeira de balanço. </li><li> Remover o metanol a partir das células e lavar 3x com PBS durante 5 min de cada vez. </li><li> Adicionar bloco de uma solução e incubar as células num agitador à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Adicionar solução de anticorpo primário: para a coloração Ki67, use mAb Coelho para Ki67 (diluição 1: 1.000 no bloco 2); para MyoD, use MyoD1 (D8G3) mAb XP coelho (diluição 1: 100 no bloco 2); para MF 20 coloração, o uso MYH1E (MF 20) anticorpo primário (DSHB, diluição 1: 1.000 no bloco 2). </li><li> Incubam-se as células com o anticorpo primário durante 1 h (RT) para S / N (4 ° C) num agitador rotativo. </li><li> Recolhe-se o AB primária (que pode ser re-utilizada várias vezes se stovermelho, a 4 ° C). </li><li> Lavar as células 3x com PBS, 5 min cada vez. </li><li> Adicionar o anticorpo secundário adequado: por coloração de Ki67 ou MyoD, IgG de cabra anti-coelho (H + L) anticorpo secundário, conjugado com Alexa Fluor 488 (diluição 1: 1000 em PBS); MF 20 para a coloração, de cabra anti-ratinho IgG (H + L) anticorpo secundário, conjugado com Alexa Fluor 488 (diluição 1: 1000 em PBS). </li><li> Envolva a placa que contém as células e incuba-se o anticorpo secundário durante 2 h no escuro num agitador à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as células 3x com PBS durante 5 min de cada vez. </li><li> Adicionar solução DAPI (1: 1000 de diluição em PBS) para as células e incuba-se no agitador à temperatura ambiente durante 5 - 10 min. </li><li> Lavar as células 3x com PBS durante 5 min de cada vez. </li><li> Adicionar 1 ml de PBS fresco. </li><li> Montar as células nas lamelas na solução de montagem ou selar a placa que contém as células em PBS com Parafilm para evitar a evaporação. </li><li> Armazenar a 4 ° C. </li><li> Visualizar as células como microscópio de fluorescência mais rapidamente possível (o mais tardar 2 semanas). </li></ol></li><li> ensaio de viabilidade <ol><li> Remova a mídia a partir das células. </li><li> Lavar as células em PBS. </li><li> Adicionar 1: 1000 de brometo de etídio e 1: 1000 de laranja acridina diluído em PBS. Cuidado: Tome cuidado e trabalhar dentro de normas de saúde e segurança - brometo de etídio é um agente cancerígeno. </li><li> Envolva a placa que contém as células em solução de coloração e incubar à temperatura ambiente no agitador durante 5 min. </li><li> Tome imagens das células com um microscópio de fluorescência: canal verde para laranja de acridina; canal vermelho para o brometo de etídio. </li></ol></li></ol>

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Não há nada a divulgar.

Aqui, apresentamos um método simples, robusto, barato, reprodutível e eficiente de isolar células progenitoras de músculo / mioblastos primários de adultos e idosos seres humanos de extensor brevis digitorium, tibial anterior ou hálux abdutores músculos. Este protocolo visa permitir estudos usando mioblastos primários humanos de adultos e idosos seres humanos, especialmente quando os métodos mais sofisticados, tais como FACS- ou MACS-ordenação, não são possíveis ou não prático. O método de isolamento apresentada neste manuscrito demora cerca de 2 horas. Durante o isolamento, músculo foi lavado em etanol a 70%, a fim de evitar a contaminação. Antes da dissociação enzimática do músculo, é importante para reduzir o músculo, mas em pequenos pedaços visíveis, e evitar danos nas células do excesso de picagem. Os resultados de digestão na dissociação de fibras musculares ea liberação de células satélites e células precursoras miogênicas. No nosso caso para ~ 20 mg de músculo esquelético, um de 60 mm(20 cm2) uma placa de Petri foi a área de superfície mais adequada para a colheita das células. As células plaqueadas sobre uma superfície maior mostrou proliferação reduzida, enquanto que as células plaqueadas sobre uma superfície menor mostraram um aumento da morte celular e a aglutinação. Após o isolamento, as células foram cultivadas e expandidas em placas cobertas de laminina. A utilização de superfícies não revestidas tenderam a diminuir o sucesso do isolamento. Por este motivo, as células podem ser colhidas de um modo preferido sobre uma superfície pré-revestido directamente após o isolamento. culturas de fibroblastos enriquecido predominará em vez de células de mioblastos-se derivados das células são colhidas sobre uma superfície não-revestido directamente após o isolamento. Além de laminina, a utilização de outras soluções, tais como a fixação das células de Matrigel e reagentes à base de colagénio podem ser usados. As soluções de revestimento podem incluir factores de crescimento e outros compostos que promovem o crescimento celular, mas estes poderiam alterar o comportamento das células e, por conseguinte, os resultados experimentais. Dentronossa experiência, 10 ug / ml de laminina é a concentração óptima e o reagente de revestimento apropriado para células satélite e de fixação de mioblastos e de proliferação, uma vez que carece de qualquer factor de crescimento ou outros complementos. Além disso, laminina está naturalmente presente na lâmina basal, directamente ligado ao sarcolema, que desempenha uma função chave na ligação de células satélite e migração através da fibra muscular esquelética. Os suplementos do meio de cultura pode também ter uma influência prejudicial sobre o comportamento do primário de mioblastos. Por exemplo grupos de fatores de crescimento, tais como FGF ou IGF, ter efeitos pleiotrópicos sobre culturas de mioblastos primário, com o FGF-2 controlando tanto da resposta mitogénica e morte celular programada 31. Por conseguinte, é necessário controlar rigorosamente as condições de cultura, especialmente porque as diferenças no comportamento de mioblastos primários isolados de músculo de adultos com idade e pessoas são muito provável que seja devido à pureza óf as culturas e a probabilidade de fibroblastos ultrapassagem do mioblastos em cultura durante culturas a longo prazo 35. Usámos uma hora de pré-plaqueamento das células durante a primeira divisão para uma superfície não-revestidos, a fim de diminuir a contaminação das culturas com fibroblastos. O método que descrevemos é apropriado para o isolamento de células progenitoras miogï¿½icas dos músculos de ambos os seres humanos com idades compreendidas entre adulto e. A cula isolada consiste de uma população miogénica representativos de células, tal como indicado por uma alta percentagem de células miogénicas (expressão MyoD e propriedades miogï¿½icas visualizadas por imunocoloração MF20 nas Figuras 1 e 2) e pode ser utilizado como um modelo in vitro para estudos funcionais de processos associados com a homeostase do músculo. Estudos anteriores caracterizaram o isolamento e diferenças nas propriedades, ou a falta dela, de mioblastos primários humanos a partir deadultos e idosos 6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 3 6, 37, 38. A existência de PPM humano geriátrica e / ou não-funcional tem sido demonstrada 6, 20, 22. No entanto, não houve diferença no comportamento de PPM humanos isolados de fresco também foi mostrado 27. Nosso protocolo permite o isolamento de mioblastos primários que retêm pelo menos parcialmente, o seu fenótipo, tal como um reduzido potencial proliferativo ou senescência de mioblastos primários isolados de músculo de idosos e permite a utilização de estescélulas para estudos funcionais dos mecanismos moleculares da homeostase do músculo durante o envelhecimento 22. Os mioblastos primários isolados usando o método aqui descrito pode ser utilizado não só para os estudos de diferenciação, mas também miogï¿½icas para investigar mudanças intracelulares, tais como alterações na expressão de genes que ocorrem em células precursoras miogï¿½icas humanos durante o envelhecimento. No entanto, as mudanças que ocorrem nas células durante a cultura prolongada ex vivo precisam ser considerados quando se analisa alterações fenotípicas e genotípicas ocorrem durante o envelhecimento. Recomendamos a utilização de células recém-isoladas para esta finalidade. Além disso, o método de cultura de mioblastos primários descritos aqui permite a expansão e relativamente cultura de longo prazo de mioblastos primários humanos, permitindo estudos funcionais in vitro robustos. Nós mostramos anteriormente que as células progenitoras miogï¿½icas isolado utilizando o nosso método pode ser utilizado tanto para perfil de expressão e Fuestudos nctional de processos associados ao envelhecimento muscular 22. Este método é também aplicável para os músculos do adulto e roedores velhos e permite o isolamento de uma cultura enriquecida de mioblastos que pode ser utilizado para perfis de alterações genéticas e epigenética durante o envelhecimento e estudos funcionais 22. As limitações deste método incluem a utilização de, até certo ponto, a população mista de células, em vez de uma população pura de células satélites, que pode ser obtido usando métodos mais sofisticados publicados 6, 28, 29, 39, 40, 41, 42, 43. Nós apresentamos um protocolo simplificado, acessível e reprodutível para o isolamento de células mioblastos primários de adultos e idososhumanos. Em nossa experiência, os métodos disponíveis, mais sofisticadas de isolamento e cultura de mioblastos primários humanos (como MACS- ou células satélites FACS-ordenadas) são ideais para alguns tipos de estudos, tais como perfis de mudanças transcriptomic ou proteômica nas células. No entanto, estes métodos são caros, requerem pelo menos algum nível de especialização, e pode revelar-se difícil devido à taxa proliferativa baixo de culturas e fibroblastos overgrowing mioblastos puros mioblastos primário. Apresenta-se um protocolo reprodutível, que permite o isolamento e cultura simples de mioblastos humanos primários para utilização em estudos funcionais. Além disso, propomos a utilização da laminina 42 e o uso limitado de bFGF como factores-chave para uma cultura de sucesso 44. Propomos também evitando o estresse gerado por centrifugação quando a divisão das células e uma etapa de pré-metalização na primeira passagem 45. Para resumir, temosoptimizado um protocolo eficiente para o isolamento e cultura de mioblastos primários / PPM a partir dos músculos do adulto e seres humanos envelhecidos que também é aplicável para os músculos de roedores e permite a expressão e estudos funcionais da homeostase do músculo.

perda de doença- e relacionada com a idade progressiva de massa e função resultados músculo esquelético em fragilidade, a diminuição da força e diminuição da qualidade de vida das pessoas idosas. O músculo esquelético é responsável por aproximadamente 40% de massa corporal 1. Durante o envelhecimento e a doença, atrofia progressiva de miofibras individuais e redução da qualidade do músculo devido à infiltração de gordura e fibrose ocorre 1, 2, 3, 4, 5, 6. Recentemente, tem sido proposto que as diferenças específicas de espécies em envelhecimento do músculo esquelético ocorrer, especificamente que a perda de fibra muscular que ocorre em roedores, não pode ocorrer em humanos 7. No entanto, as restantes fibras musculares de mamíferos com idades são caracterizadas por um aumento da susceptibilidade a danos e a regeneração deficiente <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 8. Reparação muscular adulto e manutenção é mediada por células satélites 9, 10. Após a lesão muscular e outras pistas relevantes, as células satélites são ativados e proliferar. Um subconjunto das células retorna para o estado de repouso e o restante progride em mioblastos (células progenitoras Miogênica - PPM). Estes contribuem para reparar da myofiber existente 11. A funcionalidade das células satélite determina o sucesso da regeneração do músculo e as mudanças na disponibilidade de células satélites com o envelhecimento tem sido demonstrada 12, 13, 14, 15. Além disso, as células satélites do músculo de seres humanos velhos e roedores mostram um interruptor perfil transcricional e reduziu o potencial regenerador 16, 17, </sup&gt; 18, 19. Células satélites do músculo a partir de ratinhos de idade e seres humanos também foram exibidas para submeter a senescência resultando na sua funcionalidade reduzida 20. A linha de células mais estabelecido permitindo o estudo da homeostase muscular é linha de células C2C12 de murino 21. Uma quantidade significativa de estudos também têm utilizado mioblastos primários de murino 22. Estas culturas levaram a uma compreensão significativa de murino e miogénese vertebrado, bem como de regeneração muscular, atrofia de miotubos / fibra muscular, e hipertrofia processos que ocorrem durante a doença muscular e envelhecimento 23, 24, 25, 26. Mais recentemente, vários grupos têm descrito usando mioblastos primários humanos para estudar myogenesis e envelhecimento muscular. No entanto, há falta de consenso com regarDS para diferenças entre mioblastos primários isolados do músculo de adultos e seres humanos com idades entre 27, 28, 29, 30, 31. Apesar das diferenças, caracterizado por o meio ambiente sistémica e local que ocorrem durante o desenvolvimento, o envelhecimento e a doença 6, 32, 33, 34, In vitro de mioblastos e de miotubos culturas continuam a ser as ferramentas mais acessíveis para o estudo dos mecanismos moleculares associados com o desenvolvimento muscular, crescimento e atrofia. Além disso, estes estudos fornecem não apenas um robusto, mas também uma elevada taxa de transferência-relativamente rápida, de baixo custo e com a ferramenta vitro. Além disso, as implicações éticas associadas com estudos de músculos humanos significa que para experiências funcionais que envolvem manipulações de expressão gênica <em&gt;, In vitro humanos mioblastos e miotubos culturas continuam a ser a única alternativa disponível para organismos modelo vertebrados. Aqui, mostramos um protocolo experimental simples para o isolamento robusto, barato e reprodutível de mioblastos primários, ou PPM, a partir do músculo do adulto e as pessoas com idade e descrevem as condições padronizadas de cultura in vitro (Figura 1). Como culturas primárias de músculo geralmente contêm fibroblastos, além de mioblastos, recomendamos um passo preplating visando uma melhor pureza e qualidade de mioblastos primários. Para resumir, nós estabelecemos um protocolo que permite o isolamento eficiente e reprodutível, da cultura e estudos funcionais de PPM / mioblastos primários enriquecidos e funcionais do músculo esquelético de adultos e idosos.

<table><tbody><tr><td>Placas de Petri de 60 mm</td><td>Greiner Bio One</td><td>628160</td><td>Cellstar Placa de cultura de células, PS, 60/15 MM, VENTS.</td></tr><tr><td>Placas de cultura de células (6 poços)</td> <td>Placas de cultura de células Sigma-Aldrich</td><td>CLS3516</td><td>Corning Costar. 6 poços, fundo plano (Embalado individualmente) .&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de cultura de células (12 poços)</td><td>Greiner bio-one</td><td>657 160</td><td>Cellstar Placas de cultura de células multipoços.&nbsp;</td></tr><tr><td>Frascos de cultura</td><td>Greiner Bio One</td><td>&nbsp; 690175 (25 cm2); 658175 (75 cm2).</td><td>Frascos de Cultura de Células com Tampa de Filtro Cellstar.</td></tr><tr><td>Bisturi Descartável Padrão</td><td>Granton</td><td>91310</td><td>Lâmina de aço inoxidável estéril, padrão: 10.&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Greiner bio-one</td><td>606 180 (5 mL); 607 180 (10 mL); 760 180 (25 mL)</td><td>Pipetas sorológicas Cellstar.&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetas de plástico Pasteur</td><td>Starlab</td><td>E1414-0311</td><td>Pipeta Pasteur graduada de 3,0 mL (estéril), Ind. Embalado.</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>BD</td><td>300613</td><td>seringa de ponta excêntrica BD de 20 mL.&nbsp;</td></tr><tr><td>0,2 &micro; m filters</td><td>Gilson</td><td>ALG422A</td><td>Filtros de Seringa Estéril CA 0.2 &micro; m 33 mm Pk50.</td></tr><tr><td>Filtros de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>11597522</td><td>Filtro de cultura de células estéril embalado individualmente 70 &micro; m polipropileno.</td></tr><tr><td>colagenase D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td>colagenase D; Atividade: &ge; 0,15 U/mg&nbsp;</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4693</td><td>Dispase II Protease de Bacillus polymyx. Atividade: &ge; 0,5 U/mg sólido.</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td>Cloreto de cálcio, anidro, contas, &menos; 10 mesh, &ge; 99,9% de base de metais vestigiais</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114956-81-9&nbsp;</td><td>Laminina da membrana basal do sarcoma murino de Engelbreth-Holm-Swarm. 1 mg/mL.</td></tr><tr><td>DMEM-glicose alta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Glicose média - alta. Com 4.500 mg/L de glicose e bicarbonato de sódio, sem L-glutamina e piruvato de sódio.</td></tr><tr><td>Mídia F-12</td><td>Gibco</td><td>21765029</td><td>Mistura de Nutrientes F-12 da Ham. 1x + L-glutamina.</td></tr><tr><td>FGF-b</td><td>PetroTech</td><td>100-18B&nbsp;</td><td>Fator de crescimento básico de fibroblastos humanos recombinantes.</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Soro Fetal Bovino.</td></tr><tr><td>Soro de cavalo (HS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1270</td><td>Horse Serum. Rebanho doador, origem dos EUA, filtrado estéril.</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>Penicilina-estreptomicina com 10.000 unidades de penicilina e 10 mg de estreptomicina por mL em NaCl a 0,9%, filtrado estéril.</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>Solução de L-glutamina. 200 mM, solução, filtrada estéril.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td>Solução de tripsina-EDTA. 0,25%, filtrado estéril.</td></tr><tr><td>TrypLE Express&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12604-013</td><td>Enzima TrypLE Express (1x), sem vermelho de fenol.</td></tr><tr><td>DPBS (cultura de células)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato. Modificado, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio.</td></tr><tr><td>PBS (imunocoloração)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td>Comprimido salino tamponado com fosfato. Um comprimido por 200 mL de água deionizada (tampão fosfato 0,01 M, cloreto de potássio 0,0027 M e cloreto de sódio 0,137 M, pH 7,4).&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>M / 4000 / PC17</td><td>Reagente Analítico de Metanol Grau Triton</td></tr><tr><td>X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100 para biologia molecular.</td></tr><tr><td>anticorpo anti-MF 20</td><td>DSHB</td><td>MF20-c 2ea 211 &micro; g/ml.</td><td>MYH1E (MF 20) Mouse mAb.</td></tr><tr>mAb do coelho da tecnologia <td>13812P</td><td>MyoD1 (D8G3) XP da</td> <td>sinalização de pilha</td> do <td>anticorpo do anti-MyoD</td>.</tr><tr><td>anticorpo anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td>Coelho mAb para Ki67 [SP6].</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-camundongo 488&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td>Anticorpo secundário anti-camundongo IgG (H + L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 488.</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho 488 Anticorpo secundário</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>Cabra anti-coelho IgG (H + L), conjugado Alexa Fluor 488.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato)</td></tr><tr><td>Senescência &beta;-Galactosidase Kit de</td><td>Coloração Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>9860</td><td>Senescência &beta;-Kit de Coloração de Galactosidase.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41639</td><td>Dimetilsulfóxido. BioUltra, para biologia molecular, &ge; 99,5% (GC).&nbsp;</td></tr><tr><td>Acridina Laranja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8097</td><td>Solução de cloridrato de acridina laranja, 10 mg/ml em H2O.</td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Solução de brometo de etídio. BioReagent, para biologia molecular, 10 mg/ml em H2O.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td></tr><tr><td>Scramble control para transfecções</td><td>Qiagen</td><td>1027271</td><td>miScript Inhibitor Neg. Controle (5 nmol)</td></tr><tr><td>Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay</td><td>Qiagen</td><td>218300</td><td>Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (alvos de miRNA maduro: has-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC</td></tr><tr><td>Anti-has-miR-378a-3p Inibidor de miRNA miScript</td><td>Qiagen</td><td>219300</td><td>Inibidor de miRNA anti-has-miR-378a-3p miScript (tem como alvo miRNA maduro: has-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC</td></tr><tr><td>Centrífuga Megafuge 2.0 R</td><td>Heraeus</td><td>75003085</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Rotor de centrífuga</td><td>Heraeus</td><td>3360</td><td>Heraeus Sepatech Megafuge Rotor de centrífuga BS4402/A. Raio: 15,5 cm.</td></tr><tr><td>Sistema de Microscópio Invertido Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Oculares: CFI 10X/22; Ampliação total: 100X (MF20, vivo/morto e Ki67).</td></tr><tr><td>Microscópio invertido Axiovert 200</td><td>Carl Zeiss</td><td>n/a</td><td>Oculares: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10X/25; Ampliação total: 100X (Senescência &beta;-Coloração de galactosidase).</td></tr><tr><td>Microscópio invertido Axiovert 25</td><td>Carl Zeiss</td><td>n/a</td><td>Oculares: E-PL 10X/20. Ampliação total: 100X (campo claro).</td></tr><tr><td>Microscópio de Cultura de Tecidos Invertido Diaphot</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Ocular: CFWN 10X/20. Ampliação total: 100X (campo claro).</td></tr><tr><td></td><td>Hydromount Diagnóstico Nacional</td><td>HS-106</td><td>Hydromount</td></tr></tbody></table>

preparação e cultivo de células precursoras miogênica / mioblastos primárias de músculo esquelético de adulto e idoso humanos

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

homeostase músculo esquelético depende do crescimento muscular (hipertrofia), atrofia e regeneração. Durante o envelhecimento e em várias doenças, perda de massa muscular ocorre. Perda de massa e função muscular está associada com o tipo de fibra muscular atrofia, tipo de fibra de comutação, regeneração muscular com defeito associado à disfunção das células satélites, células-tronco musculares e outros processos fisiopatológicos. Estas alterações estão associadas com alterações na intracelular, bem como nichos locais e sistémicos. Além dos modelos de roedores mais vulgarmente utilizados de envelhecimento muscular, existe uma necessidade de estudar a homeostase do músculo e desperdiçando utilizando modelos humanos, os quais devido às implicações éticas, consistem predominantemente de culturas in vitro. Apesar da ampla utilização de células humanas Miogênica progenitoras (PPM) e mioblastos primárias em myogenesis, há poucos dados sobre o uso de humanos mioblastos primário e miotubos culturas para estudar os mecanismos moleculares que regulam diferentes aspectos da mus associada à idadeemaciação CLE, auxiliando na validação dos mecanismos de envelhecimento proposto no músculo de roedores. O uso de PPM humanos, mioblastos primários e miotubos isoladas de adultos e idosos, pessoas fornece um modelo fisiologicamente relevante dos mecanismos moleculares dos processos associados com o crescimento muscular, atrofia e regeneração. Aqui descrevemos em pormenor um protocolo robusto, barato, eficiente e reprodutível para o isolamento e manutenção de PPM humanos e sua progénie - mioblastos e de miotubos de amostras de músculo humanas utilizando digestão enzimática. Além disso, foi determinado o número de passagens a que mioblastos primários de adultos e idosos submetidos a senescência em uma cultura in vitro. Finalmente, que mostram a capacidade de transfectar estas mioblastos e a capacidade de caracterizar a sua capacidade proliferativa e de diferenciação e propor a sua aptidão para a realização de estudos funcionais de mecanismos moleculares de miogénese e desgaste muscular in vitro. </p&gt;

PPM / mioblastos primários deve ser visível 24 h após a semeadura sobre a superfície revestida com laminina (Figura 2). As células devem adoptar uma forma fusiforme e deve expressar MyoD ainda na passagem 4 (Figura 1A, B). Os fibroblastos podem ser distinguidos pela sua morfologia semelhante a estrela e a falta de expressão de MyoD (Figura 1B, C). Uma vez que as células são ligadas no dia seguinte, os meios devem ser substituídos por meios frescos de bFGF. Os meios de cultura deve ser substituído a cada 48 h. Os resultados representativos aqui mostrados e os dados publicados do nosso laboratório 22 objectivo de apoiar o nosso protocolo de isolamento e cultura e demonstram as diferentes técnicas que podem ser utilizadas para estudos funcionais de mioblastos primários humanos. a proliferação de mioblastos podem ser estudadas usando Ki67 imunocoloração e viabilidade usando staining para o ensaio de viabilidade celular (Figura 3). Para a diferenciação, os meios de cultura deve ser alterado para meios de diferenciação. Miotubos deve formar em 5-7 d e ser cadeia pesada de miosina positivo (Figura 3). Note-se que a formação de miotubos pode ser menos eficiente quando mioblastos são isoladas a partir do músculo de idosos (Figura 3). A senescência (SA-β-galactosidase) coloração também pode ser realizada a fim de estabelecer a percentagem de células senescentes na cultura (Figura 3). Observou-se que as culturas com mais longos (Figura 3, 4) de passagem, mais mioblastos isolados de músculo de idosos mostram senescência. Para estudos funcionais, do gene e microARN expressão pode ser manipulado usando entrega de transfecção mediada por lipofílico reagentes de vectores de expressão, siRNAs, e imita antimiRs microRNA (Figura 4). Isto permite a 40 -70% de eficácia de transfecção com o gene de níveis / microRNA ser positiva ou negativa regulada dentro de uma gama fisiológica (Figura 4; 22). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> recipiente de cultura </td><td> Aprox. Área (por poço) </td><td> Volume de 10 ug / ml de laminina </td></tr><tr><td> prato de 35 milímetros </td><td> 10 cm 2 </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> prato 60 milímetros </td><td> 20 cm 2 </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> prato 100 milímetros </td><td> 60 cm 2 </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> placa de 24 poços </td><td> 2 cm 2 </td><td> 200 ^ l / poço </td></tr><tr><td> placa de 12 poços </td><td> 4 cm 2 </td><td> 500 ^ l / poço </td></tr><tr><td> placa de 6 poços </td><td> 10 cm 2 </td><td> 1 mL / poço </td></tr><tr><td> T25 </td><td> 25 cm 2 </td><td> 3 ml </td></tr><tr><td> T75 </td><td> 75 cm 2 </td><td> 5 ml </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Recomendados volumes mínimos de laminina-DPBS Solution (10 ug / mL) para a Cultura Revestimento de superfície. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Atividade específica / Massa molar </td><td> concentração final </td><td> Massa ou volume necessário para a solução de 10 ml </td></tr><tr><td> colagenase D </td><td> 0,15 U / mg </td><td> 10 mg / ml (1,5 U / ml) </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> dispase II </td><td> 0,5 U / mg </td><td> 4,8 mg / mL (2,4 U / ml) </td><td> 48 mg </td></tr><tr><td> 250 mM de CaCl2 </td><td> 1100,98 g / mol </td><td> 2,5 mm </td><td> 100 uL </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Preparação da Enzima para Muscle digestão. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig1.jpg" /> Figura 1. Gráfico Resumo Resumindo os passos do protocolo. A dissociação da biópsia do músculo humano com uma tesoura ou com um bisturi cirúrgico (I). A incubação com a solução enzimática a 37 ° C durante 30 - 40 min (II). Final da digestão através de adição de meio de crescimento e filtrar a solução através de um filtro de membrana de 70 ^ M para um tubo de centrífuga (III). A centrifugação a 443 xg durante 5 min (IV). Descartar o sobrenadante e ressuspender em meio de crescimento contendo 2,5 ng / ml de FGF (V). Plaqueamento das células em um prato revestido com 1081; g / ml de laminina e mudando a mídia após 24 h (VI). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig2.jpg" /> Figura 2. Os mioblastos isolados de músculo de Adultos e seres humanos com pelo passagens diferentes. Uma. Imagens representam mioblastos isolados de extensor curto dos dedos, tibial anterior ou abdutores hálux músculos de pacientes do sexo feminino (adulto: 30 ± 2,8 anos, idade: 69 ± 5 anos de idade, IMC &lt;25). Na passagem 0 e depois de 5 dias de ser banhado, células ainda são redondos e pequenos, mas visíveis sob o microscópio de luz brilhante (A). Mioblastos, então, adotar uma forma alongada, como mostrado na passagem 2 (A). MyoD é expresso em mioblastos, mas não em fibroblastos<html> (B). A quantificação de células positivas MyoD é mostrado; barras de erro mostram o desvio padrão; n = 3 (B). Imagem representativa demonstrar as diferenças entre a morfologia de fibroblastos e mioblastos (C). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig3.jpg" /> Figura 3. Os mioblastos primários humanos podem ser caracterizados utilizando diferentes técnicas de coloração. A viabilidade das células pode ser visualizada usando coloração por ensaios de viabilidade celular, a proliferação pode ser avaliada utilizando Ki67 imunocoloração, a diferenciação pode ser avaliada utilizando MF20 (cadeia de miosina pesada) imunocoloração e senescência pode ser visualizada utilizando SA-beta-gal (SA-β-galactosidase ) coloração.<html> ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig4.jpg" /> Figura 4. Os mioblastos primários humanos podem ser usados para estudos funcionais da homeostase Muscle In Vitro. A. MF20 (miosina de cadeia pesada) imunocoramento miotubos primários diferenciados de seres humanos adultos que mostram os efeitos da sobre-expressão ou inibição de miR-378 em miotubos tamanho e número. B. qPCR que mostra a expressão relativa de miR-378 e IGF1R, validado gene alvo de miR-378, a seguir o miR-378 sobre-expressão ou inibição em mioblastos primários humanos. Expressão em relação ao Rnu-6 e β-2-microglobulina, respectivamente, é mostrada. As barras de erro mostram SEM; n = 3, * - p &lt;0,05, teste t de Student.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este protocolo descreve um método robusto, simples e reprodutível de isolamento e cultivo de células progenitoras a partir de mioblastos de músculo esquelético de adultos e idosos. Os músculos usados ​​aqui incluem músculos do pé e da perna. Esta abordagem permite o isolamento de uma população enriquecida de mioblastos primários para estudos funcionais.

Preparação e cultivo de células precursoras Miogênica / mioblastos primárias de músculo esquelético de Adulto e Idoso Humanos

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um procedimento robusto, reprodutível e simples para o isolamento de mioblastos primários de humanos adultos e idosos. Este protocolo propõe um fluxo de trabalho otimizado para o isolamento de mioblastos humanos primários como um modelo in vitro para estudos funcionais de processos associados à homeostase muscular durante o envelhecimento. Este protocolo mantém o comportamento natural das células ao evitar estressores como a centrifugação, e permite o isolamento e o cultivo prolongado de mioblastos primários para retenção do fenótipo.Inicie este procedimento preparando uma placa de Petri de 60 mililitros ou duas cavidades de uma placa de seis poços. Em seguida, pipete uma quantidade mínima de solução de laminina para cobrir completamente a superfície da placa. Incube então a placa de cultura por pelo menos 30 minutos em um incubador umidificado a 37 graus Celsius, antes de semear as células.Em seguida, prepare a solução enzimática em DMEM livre de soro. Misture bem e filtre a solução enzimática através de uma membrana de filtro de 0,2 micrômetros para esterilização. Após a coleta da amostra, mantenha o músculo a quatro graus Celsius em DPBS até a digestão.Prepare pelo menos dois mililitros de solução enzimática para 18 a 20 miligramas de tecido muscular e aqueça-a a 37 graus Celsius antes da dissociação do tecido. Em seguida, imerja brevemente a biópsia muscular em etanol a 70 por cento. Lave-a com DPBS fresco e depois com etanol a 70 por cento, e então coloque o tecido em uma nova placa de Petri em quantidade suficiente de solução enzimática para cobrir a amostra.Descarte o máximo possível de tecido fibroso e gorduroso e rasgue suavemente o músculo em pedaços pequenos, mas distinguíveis. Em seguida, transfira a amostra para um tubo de 50 mililitros com pelo menos um mililitro de solução enzimática. Incube o tecido a 37 graus Celsius por até 30 ou 40 minutos, movimentando o tecido muscular com agitação suave do tubo a cada cinco a 10 minutos.Em seguida, recubra as pipetas com meio para evitar a adesão das células liberadas à parede de plástico das pipetas. Então, adicione quatro mililitros de meio de crescimento estéril para interromper a digestão. Pipete para cima e para baixo várias vezes para ajudar na liberação das células das fibras musculares.Em seguida, filtre a solução muscular através de um filtro celular de 70 micrômetros sobre um tubo cônico de 50 mililitros. Lave as células restantes com mais meio e filtre novamente através do filtro.Em seguida, centrifugue a amostra por cinco minutos à temperatura ambiente para sedimentar as células. Após cinco minutos, despreze cuidadosamente o sobrenatante. Em seguida, dissolva o sedimento no meio de crescimento F12.Nesta etapa, colete o recipiente de cultura previamente revestido com laminina do incubador. Remova cuidadosamente o excesso de laminina do recipiente de cultura, evitando tocar a superfície. Em seguida, lave o recipiente de cultura suavemente com DPBS.Em seguida, plaque as células diretamente no recipiente revestido com laminina. Incube-as por 24 horas em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius. Visualize as células ao microscópio de campo claro no dia seguinte.Células pequenas e redondas aderem à superfície e os resíduos remanescentes devem ser observados no meio de cultura. Em seguida, substitua o meio por meio F12 fresco. Neste procedimento, troque o meio a cada dois ou três dias e divida as células assim que grupos de células forem visíveis ao microscópio, a fim de evitar diferenciação espontânea.Para a repicagem celular, remova o meio e lave as células duas vezes com DPBS. Adicione a menor quantidade necessária de tripsina com EDTA a 0,25 por cento para cobrir a superfície das células. Agite suavemente para garantir que todas as células fiquem cobertas pela solução de destacamento e, em seguida, incube por 10 segundos à temperatura ambiente antes de removê-la.Em seguida, incubar as células em uma estufa umidificada a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Bater suavemente e verificar ao microscópio de luz brilhante se as células estão arredondadas, mas ainda não completamente destacadas da superfície. Então, adicionar cinco mililitros de meio de crescimento para coletar as células, misturar bem e transferir as células com o novo meio para um frasco T75.Posteriormente, lave as células restantes com mais 5 mililitros de meio de crescimento. Para o pré-plaqueamento na primeira passagem, incube as células a 37 graus Celsius por 40 minutos a uma hora. Em seguida, colete o sobrenadante contendo as células não aderidas e incube-as em um novo frasco T75.Isso deve enriquecer o cultivo e os mioblastos, pois a maioria dos fibroblastos deverá ter aderido ao primeiro frasco. Troque o meio a cada dois ou três dias. E divida as células assim que atingirem 70 por cento de confluência.Para a diferenciação, quando as células atingirem 70 a 80 por cento de confluência, troque o meio de cultura pelo meio de diferenciação. As células devem ser diferenciadas em cinco a sete dias, dependendo da qualidade e da pureza da cultura de mioblastos. No passagem zero e após cinco dias de semeadura, as células ainda são arredondadas e pequenas, mas visíveis ao microscópio de luz brilhante.Os mioblastos adotarão então uma forma alongada, como em passagem. Como mostrado aqui, MyoD é expresso em mioblastos, mas não em fibroblastos. Mioblastos primários humanos podem ser caracterizados utilizando coloração para viabilidade celular, imunocoloração para Ki67 para proliferação, imunocoloração para MF20 para diferenciação e coloração para betagalactosidase associada à senescência para ensaios de senescência.Os mioblastos primários podem ser utilizados em ensaios funcionais. Nesta figura, a imunomarcação com MF20 dos miótubos primários diferenciados de humanos adultos mostra os efeitos da superexpressão ou inibição do miR-378 no tamanho e número de miótubos. Análises de QPCR mostram que as transfeções com o mimetizador do miR-378 e com o anti-miR foram bem-sucedidas e resultaram em alterações na expressão relativa do miR-378 e do LGF1R, um gene-alvo validado do miR-378, após superexpressão ou inibição do miR-378 em mioblastos primários humanos.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de duas horas. Este protocolo robusto e reprodutível é particularmente útil quando outros métodos, mais sofisticados e caros, como a classificação celular, não são possíveis ou práticos. Esta técnica simplificada é útil para pesquisadores na área muscular investigarem o fenômeno do envelhecimento em modelos experimentais humanos in vitro.Em resumo, este método proposto permite o isolamento de células progenitoras miogênicas a partir do músculo de humanos adultos e também idosos, para estudos funcionais in vitro que podem ser aplicados igualmente a modelos animais.

preparation-culture-myogenic-precursor-cellsprimary-myoblasts-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Preparação de Primário Miogênica de Células Precursoras / Culturas de mioblastos de Vertebrados basais Linhagens

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