Name: cultivo de Caenorhabditis elegans Em três dimensões em Laboratório (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda a cultivar Caenorhabditis elegans em sistemas tridimensionais que simulam habitats naturais. Este método avança estudos de desenvolvimento, fisiologia e comportamento de nematoides em ambientes mais realistas que as técnicas 2D tradicionais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi apoiado por uma nova Investigator Grant [2014R1A1A1005553] da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) para JIL; e uma Universidade Yonsei líder futuro Desafio Grant [2015-22-0133] para JIL

1. Prepare Soluções para NGT-3D e NGB-3D <ol><li> Preparar as seguintes soluções esterilizadas: 1 L de solução de NaCl a 0,1454 M, 1 L de 1 M de CaCl2, 1 L de 1 M de MgSO4, Lisogenia Broth (LB), 1 L de 1 H KPO tampão 4 (108,3 g de KH 2 PO 4 e 35,6 g de K 2 HPO 4, e preencher H2O a 1 L). Produção de NGM usando essas soluções podem ser encontradas em um protocolo anterior 10. </li><li> soluções autoclave a 121 ° C, 15 min. </li><li> Preparar 50 ml de uma solução estéril a 5 mg / ml de colesterol. Em um tubo cónico de 50 mL, misturar 0,25 g de colesterol e 50 ml de 99,99% de etanol e misture bem. Não autoclave. Esterilizar a solução colesterol utilizando uma seringa de 50 ml com um filtro de seringa de 0,45 um. Isso também irá remover qualquer colesterol não dissolvido. </li><li> (Opcional) Preparar 10 ml de uma 150 mM de 2&#39;-desoxi-5-fluorouridina estoque (FUdR). Em um tubo cónico de 15 ml, 0,3693 g misturarde FUdR e 10 ml de água destilada. Agite bem. </li></ol> 2. Prepare Cultura das bactérias para NGT-3D e NGB-3D <ol><li> Inocular 10 ml de caldo LB com bactérias. As bactérias comuns usados para a C. elegans alimentação é a estirpe de E. coli OP50. </li><li> Cultura a inoculação bacteriana a 37 ° C num incubador com agitação durante a noite. </li><li> Na preparação para uma diluição em série, alíquotas de 9 ml da solução de NaCl em 15 ml estéreis tubos cónicos. Por exemplo, alíquotas de 9 ml em um total de 7 tubos para obter uma diluição de 10 -7 estirpe de E. coli OP50. </li><li> Utilizando uma pipeta estéril de 1.000 ul, pipeta de 1 ml da cultura bacteriana ou cultura bacteriana diluída para o novo tubo estéril com 9 ml de solução de NaCl e agitar com vortex a mistura de 10 ml bem. Repita até a diluição bacteriana desejada é atingida. NOTA: A diluição bacteriana desejada depende do tipo e condição de bactérias, bem como as condições experimentais exactos.Por exemplo, um 10 -6 - diluição da estirpe de E. coli OP50 10 -8 era suficiente para produzir a partir de 1 - 200 colónias bacterianas por 6,5 ml tubo NGT-3D. Worms desenvolvido e reproduzidos normalmente quando o número de colónias foi superior a 60, o que ocorreu a uma diluição de 10 -6 fiavelmente - 10 -7. Para NGB-3D, usar uma diluição de 10 -8. </li></ol> 3. Fazer NGT-3D e NGB-3D (200 ml) <ol><li> Depois de preparar a cultura bacteriana, misturar 0,6 g de NaCl, 1 g de agar granulado, e 0,5 g de peptona, em um balão de 500 ml. Inserir uma barra de agitação magnética para o balão. </li><li> Adicione 195 ml de água destilada e cobrir a boca do balão com folha de alumínio. </li><li> Autoclave de 121 ° C durante 15 min. </li><li> Colocar o balão autoclavada quente sobre uma placa de agitação, e agitar a uma velocidade moderada durante pelo menos 2 h. Arrefece-se o balão a 40 ° C. Certifique-se de arrefecer o suficiente como continuar a partir daqui a altas temperaturas pode levar a opacificação do agar acabado.No entanto, as temperaturas mais baixas podem resultar no endurecimento prematuro do agar. <ol><li> (Opcional) Para acelerar o processo de resfriamento, colocar o balão em um 40 ° C banho de água 15 min antes de colocar em uma placa de agitação. </li></ol></li><li> Quando a temperatura do meio de ágar atinge 40 ° C, adicionar 200 ul de 1 M de CaCl2, a 200 ul de 5 mg de solução de colesterol / ml, 200 ul de 1 M de MgSO 4 e 5 ml de 1 M de KPO tampão 4, tal como a solução continua a agitar para concentrações finais de 1 mM de CaCl2, 5 ug / ml de colesterol, MgSO 4 1 mM, KPO4 1 mM. <ol><li> (Opcional) Para o ensaio do tempo de vida NGT-3D adicionar 80 ul de FUdR a 150 mM para uma concentração final de 120 pM 12. </li></ol></li><li> Adicionar 6 ml de 10 ml de cultura bacteriana diluído do passo 2.4 para dentro do frasco directamente. <ol><li> (Opcional) Para NGT-3D, retire 6 ml de ágar antes do passo 3.6 e mantê-lo aquecido separadamente. Este suporte vai ser utilizado para os livre de bactériascamada superior. </li></ol></li><li> Usando procedimentos de esterilização, dispensar a mídia em uma câmara de cultura estéril. Verifique se a tampa da câmara fecha hermeticamente. <ol><li> (Opcional) Para evitar a formação de colónias de bactérias na superfície superior do ágar, fazer uma camada de meio de ágar livre de bactérias a partir do passo 3.6.1 em cima antes que o material a partir do passo 3.7 endurece completamente. Isto irá criar uma zona livre de bactérias no topo da NGT-3D. </li><li> Para NGT-3D, despeje 6,5 ml de meio em 8 ml tubos de ensaio de plástico claras para fazer uma camada de agar de bactérias, e dispensar cuidadosamente 200 ul de meios de comunicação sem bactérias na parte superior do meio de cultura semi-endurecido 3D para fazer uma fina bacteria- camada livre no topo. </li><li> Para NGB-3D, despeje 65 ml de mídia na 25 centímetros garrafa de cultura celular 2 clara de plástico. Esta quantidade deve encher o corpo da garrafa de 25 centímetros de cultura 2 de células. </li></ol></li><li> Deixar câmaras verticalmente à temperatura ambiente durante uma semana para permitir que as colónias bacterianas a crescerpara um tamanho considerável de pelo menos 1 mm de diâmetro. <ol><li> (Opcional) Para o ensaio vida na NGT-3D, câmaras cubra com papel alumínio para evitar a degradação luz do FUdR. </li></ol></li></ol> 4. Medida da aptidão da População Sem-fim na NGT-3D (Brood Relativa Tamanho Assay) <ol><li> Escolha um verme estágio L4 usando um fio de platina pegar e transferência em uma placa NGM sem bactérias. Permitir worm para mover-se livremente ao redor por alguns minutos para remover bactérias aderidas ao corpo. </li><li> Repita o passo 4.1 e certificar-se de que o worm é livre de bactérias. Geralmente, duas repetições de 4.1 são suficientes. </li><li> Com cuidado, coloque o worm limpo na superfície da mídia 3D com uma picareta fio de platina. O worm deve eventualmente entrar no agar agar para a matriz 3D. </li><li> Feche a tampa solta permitindo um pouco de ar para entrar no tubo, mas impedindo a secagem do ágar. </li><li> Incubar durante 96 horas a 20 ° C. </li><li> Após 4 dias, a fechar as tampas hermeticamente e colocar ocâmara de cultura NGT-3D em um banho de água a 88 ° C para fundir o ágar. O calor mata vermes, mas seus corpos permanecem intactos. NOTA: Usando 8 ml tubos para NGT-3D, 20 - 30 minutos de incubação é geralmente suficiente. </li><li> Usando uma pipeta de vidro, transferir os meios derretido sobre de 9 cm de prato de petri de plástico. pipetas de plástico não são aconselhados, como vermes pode muitas vezes ficar com eles. </li><li> Usando um microscópio de dissecação transmissão estéreo, contar o número de vermes no L3, L4, e estágios adultos. Não conte vermes que estão fase L2 e mais jovens, como as gerações F1 e F2 podem ser confundidos aqui. Assim, este ensaio é um ensaio tamanho da ninhada em relação ao invés de um ensaio total de tamanho da ninhada. </li></ol> 5. Imagem e registrar o comportamento Worm na NGB-3D <ol><li> Escolha um verme estágio L4 usando um fio de platina escolher e remover qualquer bactéria coladas à superfície através da transferência a uma placa NGM sem bactérias e permitindo-lhe mover-se livremente para alguns min. </li><li> Repita o passo 5.1 para garantir que o worm é livre de bactérias. </li><li> Cuidadosamente colocar o verme limpo para o centro da superfície de agar do NGB-3D perto do gargalo da garrafa com uma escolha de fio de platina. O worm deve eventualmente entrar no agar agar para a matriz 3D. </li><li> Feche a tampa solta permitindo um pouco de ar para entrar no tubo, evitando a secagem do ágar. </li><li> Imagem ou gravar o worm sob um microscópio de dissecação transmissão estéreo. Ajuste o foco como o worm se move através da matriz 3D. </li></ol>

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Consortium, C. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li>
<li>Choi, J. I., Yoon, K. H., Kalichamy, S. S., Yoon, S. S., Lee, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+natural+odor+attraction+between+lactic+acid+bacteria+and+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">A natural odor attraction between lactic acid bacteria and the nematode Caenorhabditis elegans.</a> ISME J. 10 (3), 558-567 (2016).</li>
<li>Gaertner, B. E., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+molecular+quantitative+genetics+and+the+systems+biology+of+natural+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Res+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation.</a> Genet Res (Camb). 92 (5-6), 331-348 (2010).</li>
<li>Cutter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+evolution+in+the+wild%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis evolution in the wild.</a> Bioessays. 37 (9), 983-995 (2015).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Felix, M. A., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+history+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The natural history of Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 20 (58), R965-R969 (2010).</li>
<li>Barriere, A., Felix, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+local+genetic+diversity+and+low+outcrossing+rate+in+Caenorhabditis+elegans+natural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations.</a> Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).</li>
<li>Lee, T. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGT-3D%3A+a+simple+nematode+cultivation+system+to+study+Caenorhabditis+elegans+biology+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">NGT-3D: a simple nematode cultivation system to study Caenorhabditis elegans biology in 3D.</a> Biol Open. 5 (4), 529-534 (2016).</li>
<li>Lewis, J. A., Flemming, J. T. Basic Culture Methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLewis%2C+JA+%22Caenorhabditis+elegans.%3A+Modern+Biological+Analysis+of+an+Organism%22">Caenorhabditis elegans.: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. Epstein, H. F., Shakes, D. C. 48, 4-27 (1995).</li>
<li>Choi, S. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I., Mitchell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Violacein%3A+Properties+and+Production+of+a+Versatile+Bacterial+Pigment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Violacein: Properties and Production of a Versatile Bacterial Pigment.</a> Biomed Res Int. , 465056(2015).</li>
<li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Kwon, N., Pyo, J., Lee, S. J., Je, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+worm+tracker+for+freely+moving+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">3-D worm tracker for freely moving C. elegans.</a> PLoS One. 8 (2), e57484(2013).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).</li>
<li>Kwon, N., Hwang, A. B., You, Y. J., SJ, V. L., Je, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+C.+elegans+behavioral+genetics+in+3-D+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Dissection of C. elegans behavioral genetics in 3-D environments.</a> Sci Rep. 5, 9564(2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O cultivo laboratorial de C. elegans utilizando as placas de meio de crescimento nematóide clássicos foi crucial para as centenas de descobertas importantes que a pesquisa em C. elegans tem prestado. Aqui, nós apresentamos novos métodos de cultivar C. elegans em um ambiente que reflete com mais precisão seus habitats tridimensionais naturais. Embora outros métodos têm sido utilizados para observar C. elegans em 3D 13, este é o primeiro protocolo que permite a cultura de ver...

O estudo do nematóide Caenorhabditis elegans em laboratório levou a descobertas seminais no campo da biologia nas últimas cinco décadas1. C. elegans foi o primeiro organismo multicelular a ter seu genoma sequenciado em 19982, e tem sido inestimável na compreensão das contribuições de genes individuais para o desenvolvimento, fisiologia e comportamento de um organismo inteiro. Os cientistas agora estão procurando entender melhor como esses genes podem contribuir para a sobrevivência e aptidão reprodutiva dos organismos em seus ambientes naturais, fazendo perguntas sobre ecologia e evolução no nível genético3-5. 
C. elegans mais uma vez pode fornecer um excelente sistema para responder a essas perguntas. No entanto, pouco se sabe sobre a biologia de C. elegans em habitats naturais de nematóides, e não existem métodos atuais para simular condições naturais controladas de C. elegans em laboratório. No laboratório, C. elegans é cultivado na superfície de placas de ágar semeadas com bactérias E. coli 6. Na natureza, no entanto, C. elegans e nematóides relacionados podem ser encontrados esparsamente habitando solos em todo o mundo, mas são especificamente encontrados prosperando em frutas podres e matéria vegetativa7,8. Esses ambientes complexos tridimensionais (3D) são bem diferentes dos ambientes 2D simples aos quais os vermes são expostos em laboratório. 
Para começar a responder a perguntas sobre a biologia dos nematóides em um ambiente 3D mais natural, projetamos um habitat 3D para cultivo de nematóides em laboratório que chamamos de Nematode Growth Tube 3D ou NGT-3D para abreviar9. O objetivo era projetar um sistema de crescimento 3D que permitisse crescimento, desenvolvimento e fertilidade comparáveis às placas padrão de meios de crescimento de nematóides 2D (NGM)10. Este sistema suporta o crescimento de bactérias e nematóides ao longo de todo o seu ciclo de vida em 3D, permite que os vermes se movam e se comportem livremente em três dimensões e é fácil e barato de fabricar e empregar. 
No estudo atual, fornecemos um método passo a passo para fabricar NGT-3D e avaliar o desenvolvimento e a fertilidade do verme. Além de avaliar a aptidão do verme em 3D, procuramos obter imagens, vídeos e avaliar o comportamento e a fisiologia do verme no cultivo 3D. Assim, além do NGT-3D, apresentamos aqui um método alternativo chamado Nematode Growth Bottle 3D ou NGB-3D, para a imagem microscópica de C. elegans durante o cultivo 3D. Isso será especialmente importante para o estudo de comportamentos conhecidos identificados em 2D e a identificação de novos comportamentos exclusivos do cultivo 3D.

<table><tbody><tr><td>Caldo LB, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Difco</td><td>224620</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>DAEJUNG</td><td>7548-4400</td><td>58,44 MW</td></tr><tr><td>Ágar, Granulado</td><td>Difco</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Peptona</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio, di-hidratado</td><td>Bio Basic</td><td>CD0050</td><td>2*H2O; 147,02 MW</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Bio Básico</td><td>CD0122</td><td>386,67 MW</td></tr><tr><td>Álcool etílico</td><td>B& J</td><td>RP090-1</td><td>99,99%; 46,07 MW</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio, anidro</td><td>Bio Basic</td><td>MN1988</td><td>120,37 MW</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico, anidro</td><td>Bio Basic</td><td>PB0445</td><td>136,09 MW</td></tr><tr><td>2'-desoxi-5-fluorouridina</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>D2235</td><td>246,19 MW</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico anidro</td><td>Bio Basic</td><td>PB0447</td><td>174,18 MW</td></tr><tr><td>Tubos de ensaio multiuso</td><td>Stockwell Scientific</td><td>ST.8570</td> 8 <td>ml</td></tr><tr><td>Tampas de tubo de ensaio</td><td>Stockwell Scientific</td><td>ST.8575</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de cultura de células</td><td>SPL Lifescience</td><td>70125</td><td>25 cm2</td></tr><tr><td>Research Stereo Microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>Cabeça de câmera colorida de alta definição</td><td>Nikon</td><td>DS-Fi2</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de controle baseada em PC</td><td>Nikon</td><td>DS-U3</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Basic Research, Software de imagem de microscópio</td><td>Nikon</td><td>MQS32000</td><td></td></tr></tbody></table>

cultivo de<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; em três dimensões em laboratório

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

O uso de organismos modelo genéticos, como Caenorhabditis elegans, levou a descobertas seminais em biologia nas últimas cinco décadas. A maior parte do que sabemos sobre C. elegans é limitada ao cultivo em laboratório dos nematóides que podem não refletir necessariamente os ambientes que normalmente habitam na natureza. O cultivo de C. elegans em um habitat 3D que é mais semelhante à matriz 3D que os vermes encontram em frutas podres e composto vegetativo na natureza pode revelar novos fenótipos e comportamentos não observados em 2D. Além disso, experimentos em 3D podem abordar como os fenótipos que observamos em 2D são relevantes para o verme na natureza. Aqui, um novo método no qual C. elegans cresce e se reproduz normalmente em três dimensões é apresentado. O cultivo de C. elegans em Nematoid Growth Tube-3D (NGT-3D) pode nos permitir medir a aptidão reprodutiva de cepas de C. elegans ou diferentes condições em um ambiente 3D. Também apresentamos um novo método, denominado Garrafa de Crescimento de Nematóides-3D (NGB-3D), para cultivar C. elegans em 3D para análise microscópica. Esses métodos permitem que os cientistas estudem a biologia de C. elegans em condições que refletem mais os ambientes que encontram na natureza. Isso pode nos ajudar a entender a relevância evolutiva subjacente da fisiologia e do comportamento de C. elegans que observamos em laboratório.

A construção de NGT-3D é um protocolo simples e directo que resulta em um tubo de ensaio de agar-enchido com pequenas colónias bacterianas espaçadas ao longo do ágar (Figura 1A). Worms pode circular livremente através da matriz de agar, encontrar e consumir as colónias de bactérias. Para confirmar se o C. elegans podem se reproduzir e crescer normalmente na NGT-3D, comparou fertilidade e desenvolvimento larval em 3D com placas padrão 2D NGM. No ensaio de tamanho...

Nós apresentamos um método simples para a construção de sistemas de cultivo nematóide 3D chamado NGT-3D e NGB-3D. Estas podem ser usadas para estudar a aptidão nematóide e comportamentos em habitats que são mais semelhantes aos naturais Caenorhabditis elegans habitats do que as placas padrão 2D cultura elegans laboratório C..

cultivo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Em três dimensões em Laboratório

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

O objetivo geral deste procedimento é fabricar um sistema de cultivo tridimensional para nematóides que possa simular melhor as condições naturais. Este método pode responder a questões-chave no campo do desenvolvimento, fisiologia e comportamento de C elegans. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos estudando o comportamento natural dos nematóides em frutas podres, que é um ambiente 3D.Esta técnica é vantajosa em comparação com as técnicas de cultivo bidimensional padrão porque os nematóides residem em habitats 3D na natureza. Embora este método tenha sido desenvolvido cultivo de C elegans, ele também pode ser aplicado a outros nematóides. Demonstrando este procedimento estará Tong Young Lee, um estudante de pós-graduação em meu laboratório.Para iniciar este procedimento, Otto Clave as soluções preparadas a 121 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, prepare 50 mililitros da solução estéril de colesterol a 5 miligramas por mililitro. Em um tubo cônico de 50 mililitros, adicione 0,25 gramas de colesterol e 50 mililitros de etanol 99,99% e misture bem.Em seguida, esterilize a solução de colesterol usando uma seringa de 50 mililitros com um filtro de seringa

cultivation-caenorhabditis-elegans-three-dimensions

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Petersen, C. et. al., Isolamento e Caracterização da Microbiota Natural do Nematoide Modelo Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra o isolamento e o cultivo de espécies bacterianas associadas a Caenorhabditis elegans. Uma lise baseada em contas de C. elegans, seguida de cultivo seletivo, permite o isolamento de diversas cepas microbianas para análise posterior.

Isolamento e Cultivo de Caenorhabditis elegans - Bactérias Associadas

Descrevemos aqui um protocolo revisto para a cultura em grande escala de embrionário C. elegans células. Embryonic C. elegans células cultivadas in vitro utilizando este método, parece diferenciar e recapitular a expressão de genes de uma forma específica de célula. As técnicas que necessitem de acesso directo para as células ou o isolamento de tipos específicos de células a partir de outros tecidos podem ser aplicadas em C. elegans células cultivadas.

Um Método para o cultivo embrionário<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans é normalmente cultivadas em placas de agar sólido ou em meio líquido semeadas com E. coli. Para evitar subprodutos bacterianos de confundir os estudos toxicológicos e nutricionais, utilizamos um meio líquido axênico, CEHR, para crescer e sincronizar um grande número de vermes para uma gama de aplicações a jusante.

A cultura Caenorhabditis elegans Em Axenic Liquid Media e Criação de transgênicos Worms por bombardeamento com micropartículas

Aqui, apresentamos o nemátodo Caenorhabditis elegans como modelo de acolhimento versátil para estudar a interação microbiana.

O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio

Este protocolo descreve um método para o cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans em meios sólidos. Como alternativa à cultura líquida, este protocolo permite a obtenção de parâmetros de diferentes escalas sob cultivo baseado na placa. Isto aumenta a comparabilidade dos resultados, omitindo as diferenças morfológicas e metabólicas entre cultura de meios líquidos e sólidos.

Baseados na placa de cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes

Foi apresentado um protocolo para a imagem dos microtúbulos dinâmicos in vivo usando proteína de ligação final rotulada fluorescente. Descrevemos os métodos para rotular, imagem e analisar os microtúbulos dinâmicos no neurônio de microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

In vivo Avaliação da Dinâmica e Orientação em Caenorhabditis elegans Neurônios

O protocolo descreve um projeto de chip microfluídico simples e metodologia de microfabricação usada para cultivar C. elegans na presença de um suprimento contínuo de alimentos por até 36 h. O dispositivo de crescimento e imagem também permite imagens intermitentes de alta resolução a longo prazo de processos celulares e subcelulares durante o desenvolvimento por vários dias.

Um chip microfluídico simples para crescimento a longo prazo e imagem de Caenorhabditis elegans

Os microcosmos de composto trazem a diversidade microbiana encontrada na natureza para o laboratório para facilitar a pesquisa do microbioma em Caenorhabditis elegans. Aqui são fornecidos protocolos para a criação de experimentos de microcosmos, com os experimentos demonstrando a capacidade de modular a diversidade microbiana ambiental para explorar as relações entre a diversidade microbiana ambiental e a composição do microbioma intestinal do verme.

Microcosmos de composto como ambientes microbianamente diversos e naturais para pesquisa de microbioma em Caenorhabditis elegans

Apresentamos aqui um protocolo otimizado para o cultivo de nematoides individuais isolados em meios sólidos em dispositivos microfabricados de múltiplos poços. Essa abordagem permite que animais individuais sejam monitorados ao longo de suas vidas para uma variedade de fenótipos relacionados ao envelhecimento e à saúde, incluindo atividade, tamanho e forma corporal, geometria do movimento e sobrevivência.

Cultura de Longa Duração e Monitoramento de Caenorhabditis elegans Isolados em Meio Sólido em Dispositivos Multipoços

Aqui, apresentamos um protocolo para cultura de isolados de nematoides individuais em meio sólido para rastreamento de parâmetros fisiológicos ao longo da vida e quantificação de fluorescência. Este sistema de cultura inclui uma barreira de ácido palmítico ao redor de poços de verme único para evitar a fuga de animais, permitindo o uso de intervenções aversivas, incluindo bactérias patogênicas e estressores químicos.

Cultura de Longo Prazo de Caenorhabditis elegans Individuais em Meio Sólido para Monitoramento Longitudinal de Fluorescência e Intervenções Aversivas

Aprenda a cultivar Caenorhabditis elegans em sistemas tridimensionais que simulam habitats naturais. Este método avança estudos de desenvolvimento, fisiologia e comportamento de nematoides em ambientes mais realistas que as técnicas 2D tradicionais.

cultivo de

Explorar mais vídeos