cultivo de Caenorhabditis elegans Em três dimensões em Laboratório

O objetivo geral deste procedimento é fabricar um sistema de cultivo tridimensional para nematóides que possa simular melhor as condições naturais. Este método pode responder a questões-chave no campo do desenvolvimento, fisiologia e comportamento de C elegans. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos estudando o comportamento natural dos nematóides em frutas podres, que é um ambiente 3D.

Esta técnica é vantajosa em comparação com as técnicas de cultivo bidimensional padrão porque os nematóides residem em habitats 3D na natureza. Embora este método tenha sido desenvolvido cultivo de C elegans, ele também pode ser aplicado a outros nematóides. Demonstrando este procedimento estará Tong Young Lee, um estudante de pós-graduação em meu laboratório.

Para iniciar este procedimento, Otto Clave as soluções preparadas a 121 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, prepare 50 mililitros da solução estéril de colesterol a 5 miligramas por mililitro. Em um tubo cônico de 50 mililitros, adicione 0,25 gramas de colesterol e 50 mililitros de etanol 99,99% e misture bem.

Em seguida, esterilize a solução de colesterol usando uma seringa de 50 mililitros com um filtro de seringa ventilado 0,45 e remova qualquer colesterol não desenvolvido. Em seguida, inocule 10 mililitros de caldo de lisogenia com bactérias. Cultive a inoculação bacteriana a 37 graus Celsius em uma incubadora agitada durante a noite.

Em preparação para uma diluição em série, aloque nove mililitros da solução de cloreto de sódio em sete tubos cônicos estéreis de 15 mililitros. Para fazer uma tenda da diluição sétima vezes da cepa E Coli Opi 50. Depois, retire um mililitro da cultura bacteriana ou cultura bacteriana diluída para um novo tubo com nove mililitros de solução de cloreto de sódio.

E vortex a mistura bem. Depois de preparar a cultura bacteriana, adicione 0,6 gramas de cloreto de sódio, um grama de trado granulado e 0,5 gramas de peptona em um frasco de 500 mililitros. Coloque uma barra de agitação magnética no balão.

Em seguida, adicione 195 mililitros de água destilada e cubra o frasco com papel alumínio. Em seguida, Otto Clave a amostra a 121 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, coloque o balão Otto Claved quente em uma placa de agitação, agite em velocidade moderada por pelo menos duas horas até atingir 40 graus Celsius.

Alternativamente, o frasco pode ser resfriado a 40 graus Celsius, colocando-o em banho-maria a 40 graus Celsius por 15 minutos antes de transferi-lo para uma placa de agitação. Certifique-se de esfriar o suficiente para continuar a partir daqui. Uma temperatura alta pode levar à turvação do sem-fim acabado, mas a temperatura muito baixa pode resultar no endurecimento prematuro do sem-fim.

Quando a temperatura do meio helicoidal atingir 40 graus Celsius, adicione cloreto de cálcio, solução de colesterol, sulfato de magnésio e tampão de fosfato de potássio e continue a agitar a solução. Para o ensaio de vida útil do NGT-3D, adicione 80 microlitros de FUDR de 150 milímetros ao meio para resultar em uma concentração final de 120 micromolares. Em seguida, remova seis mililitros de meio helicoidal em um tubo cônico estéril e mantenha-o aquecido em uma incubadora.

Este meio será usado para a camada superior livre de bactérias. Em seguida, adicione seis mililitros da cultura de bactérias diluídas no frasco diretamente em uma bancada esterilizada. Para NGT-3D, despeje 6,5 mililitros de mídia nos tubos de ensaio de plástico transparente de oito mililitros para formar uma camada de trado de bactérias.

E dispense cuidadosamente 200 micro litros da mídia livre de bactérias em cima da mídia 3D semi-dura para fazer uma fina camada livre de bactérias na parte superior. Em seguida, feche bem a tampa da câmara. Para NGB-3D, despeje 65 mililitros de mídia em um frasco de cultura de células de plástico transparente de 25 centímetros quadrados.

Em seguida, posicione a câmara verticalmente em temperatura ambiente por uma semana para permitir que as colônias bacterianas cresçam até um tamanho considerável de pelo menos um milímetro de diâmetro. Neste procedimento, pegue um verme L de quatro estágios e transfira-o para uma placa NGM livre de bactérias. Em seguida, permita que o verme se mova livremente por alguns minutos para remover as bactérias de seu corpo.

E repita o procedimento mais duas vezes. Depois, coloque cuidadosamente o verme limpo na superfície da mídia 3D. O worm deveria ter entrado na broca na matriz da broca 3D.

Em seguida, feche a tampa frouxamente para incubar por 96 horas a 20 graus Celsius. Após quatro dias, feche bem a tampa e coloque a câmara de cultura NGT-3D em banho-maria a 88 graus Celsius para derreter a broca. Usando uma pipeta de vidro, transfira a mídia derretida para uma placa de Petri de plástico de nove centímetros.

Depois, usando um microscópio de dissecação estéreo de transmissão, conte o número de vermes nos estágios L3, L4 e adulto. Como mostrado aqui, a construção do NGT-3D é um protocolo simples e direto que resulta em um tubo de ensaio cheio de broca com pequenas colônias bacterianas espaçadas por toda a broca. Para confirmar se C elegans pode reduzir e crescer normalmente em NGT-3D, a fertilidade e o desenvolvimento da larva são comparados em 3D com as placas NGM 2D padrão.

No ensaio de tamanho relativo da ninhada, os hermafroditas adultos de C elegans em NGT-3D se reproduziram tão bem quanto os hermafroditas nas placas MGM 2D padrão quando as colônias bacterianas são abundantes com pelo menos 60 colônias. Além disso, o desenvolvimento da larva no NGT-3D também ocorre normalmente quando há muitas colônias bacterianas com a maioria dos vermes no estado adulto após 96 horas. No entanto, se as colônias bacterianas forem esparsas na matriz 3D, tanto o tamanho relativo da ninhada quanto o desenvolvimento da larva serão afetados negativamente.

Aqui está uma curva de sobrevivência dos elegans selvagens do tipo C em placas NGT-3D ou NGM. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três horas se executada corretamente. Seguindo este procedimento, outros métodos como ensaios de vida útil e análise de comportamento podem ser realizados para responder a perguntas sobre envelhecimento e comportamento em 3D.

Após seu desenvolvimento, essa técnica pode abrir caminho para pesquisadores nas áreas de genética explorarem questões sobre ecologia e evolução em C elegans. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar nematóides em um ambiente de laboratório 3D.