Name: la culture de Caenorhabditis elegans En trois dimensions dans le laboratoire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Découvrez la culture tridimensionnelle de Caenorhabditis elegans pour étudier le comportement et la physiologie des nématodes dans des conditions naturelles. Cette méthode améliore les analyses de comportement comparées aux techniques bidimensionnelles standard.

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Ce travail a été soutenu par un nouveau chercheur Grant [2014R1A1A1005553] de la National Research Foundation de Corée (NRF) à JIL; et un futur chef de l&#39;Université Yonsei Défi Grant [2015-22-0133] pour JIL

1. Préparer des solutions pour NGT-3D et NGB-3D <ol><li> Préparer les solutions stériles suivantes: 1 L de solution 0,1454 M de NaCl, 1 L de 1 M CaCl 2, 1 L de 1 M MgSO 4, Lysogénie Broth (LB), 1 L de 1 M KPO 4 tampon (108,3 g de KH 2 PO 4 et 35,6 g de K 2 HPO 4 et H 2 O compléter à 1 L). Production de NGM utilisant ces solutions peuvent être trouvées dans un précédent protocole 10. </li><li> Solutions autoclave à 121 ° C, 15 min. </li><li> Préparer 50 ml d&#39;une / ml de solution stérile, 5 mg de cholestérol. Dans un tube conique de 50 ml, mélanger 0,25 g de cholestérol et de 50 ml de 99,99% d&#39;éthanol et bien mélanger. Ne pas autoclaver. Stériliser la solution de cholestérol à l&#39;aide d&#39;une seringue de 50 ml avec un filtre à seringue de 0,45 um. Cela permettra également de supprimer tout le cholestérol non dissous. </li><li> (Facultatif) Préparer 10 ml d&#39;une 150 mM de 2&#39;-désoxy-5-fluorouridine (FUdR) stock. Dans un tube conique de 15 ml, mélanger 0,3693 gde FUdR et 10 ml d&#39;eau distillée. Bien agiter. </li></ol> 2. Préparer les bactéries de la culture pour NGT-3D et NGB-3D <ol><li> Inoculer 10 ml LB bouillon avec des bactéries. Les bactéries standards utilisés pour C. elegans alimentation est la souche E. coli OP50. </li><li> La culture d&#39;inoculation bactérienne à 37 ° C dans un incubateur avec agitation pendant une nuit. </li><li> Dans la préparation d&#39;une dilution en série, aliquotes de 9 ml de la solution de NaCl dans 15 ml tubes coniques stériles. Par exemple, aliquote 9 ml dans un total de 7 tubes pour obtenir une dilution de la souche 10 -7 OP50 E. coli. </li><li> À l&#39;aide d&#39;une pipette stérile 1000 ul, pipette 1 ml de la culture bactérienne ou d&#39;une culture bactérienne diluée dans le nouveau tube stérile avec 9 ml de solution de NaCl et bien vortexer le mélange de 10 ml. Répétez jusqu&#39;à ce que la dilution bactérienne désirée soit atteinte. REMARQUE: La dilution bactérienne souhaitée dépend du type et de l&#39;état des bactéries, ainsi que les conditions expérimentales précises.Par exemple, un 10 -6 - 10 -8 dilution de la souche OP50 de E. coli a été suffisante pour produire à partir de 1 - 200 colonies bactériennes par 6,5 ml Tube NGT-3D. Worms fiable développé et reproduit normalement lorsque le nombre de colonies était de plus de 60, qui a eu lieu à une dilution de 10 -6 à 10 -7. Pour NGB-3D, utiliser une dilution de 10 -8. </li></ol> 3. Faire NGT-3D et NGB-3D (200 ml) <ol><li> Après la préparation de la culture bactérienne, mélanger 0,6 g de NaCl, 1 g de granulé de la gélose et la peptone 0,5 g dans un flacon de 500 ml. Insérez une barre d&#39;agitation magnétique dans le ballon. </li><li> Ajouter 195 ml d&#39;eau distillée et couvrir la bouche de la fiole avec une feuille d&#39;aluminium. </li><li> Autoclave à 121 ° C pendant 15 min. </li><li> Placer le ballon autoclavé chaud sur une plaque d&#39;agitation, et agiter à une vitesse modérée pendant au moins 2 h. Refroidir le ballon à 40 ° C. Assurez-vous de refroidir suffisamment en continuant d&#39;ici à des températures élevées peut conduire à opacification de l&#39;agar fini.Cependant, des températures plus basses peuvent conduire à un durcissement prématuré de la gélose. <ol><li> (Facultatif) Pour accélérer le processus de refroidissement, placer le ballon dans un 40 ° C bain d&#39;eau 15 min avant de le placer sur une plaque d&#39;agitation. </li></ol></li><li> Lorsque la température du milieu gélose atteint 40 ° C, ajouter 200 pi de 1 M CaCl2, 200 ul de 5 mg / ml de solution de cholestérol, 200 pi de 1 M MgSÛ4 et 5 ml de 1 M KPO 4 tampon que la solution continue d&#39;agiter à des concentrations finales de 1 mM de CaCl2, 5 ug / ml de cholestérol, 1 mM de MgSO 4, 1 mM KPO 4. <ol><li> (Facultatif) Pour l&#39; essai de durée de vie NGT-3D ajouter 80 ul de mM FUdR 150 à une concentration finale de 120 uM 12. </li></ol></li><li> Ajouter 6 ml des 10 ml de culture bactérienne diluée à l&#39;étape 2.4 dans le ballon directement. <ol><li> (Facultatif) Pour NGT-3D, retirez 6 ml de milieu agar avant l&#39;étape 3.6 et le garder au chaud séparément. Ce média sera utilisé pour les bactéries librescouche supérieure. </li></ol></li><li> En utilisant des procédures stériles, distribuer les médias dans une chambre de culture stérile. Assurez-vous que le couvercle de la chambre se ferme hermétiquement. <ol><li> (Facultatif) Pour éviter des colonies bactériennes de se former à la surface supérieure de la gélose, faire une couche de bactéries libres-média agar de l&#39;étape 3.6.1 sur le dessus avant que les médias de l&#39;étape 3.7 durcit complètement. Cela va créer une zone exempte de bactéries dans le haut de la NGT-3D. </li><li> Pour NGT-3D, versez 6,5 ml de milieu dans les 8 ml claires tubes à essai en plastique pour faire une couche de gélose bactéries, et distribuer soigneusement 200 pi des médias exempt de bactéries sur le dessus du support semi-durci 3D pour faire une aux bactéries mince couche libre sur le dessus. </li><li> Pour NGB-3D, versez 65 ml de milieu dans les 25 cm 2 plastique transparent flacon de culture cellulaire. Ce montant doit remplir le corps de la 25 cm 2 de culture cellulaire bouteille. </li></ol></li><li> Laissez chambres verticalement à la température ambiante pendant une semaine pour permettre des colonies bactériennes de croîtred&#39;une taille considérable d&#39;au moins 1 mm de diamètre. <ol><li> (Facultatif) Pour l&#39;essai de durée de vie dans NGT-3D, les chambres de couverture avec une feuille d&#39;aluminium pour empêcher la dégradation de la lumière de FUdR. </li></ol></li></ol> 4. Mesurer Fitness de la population de Ver sur NGT-3D (Brood relative Taille Assay) <ol><li> Choisissez un ver de stade L4 en utilisant un fil de platine sélectionner et transfert sur une plaque NGM exempt de bactéries. Laisser un ver de se déplacer librement autour pendant quelques minutes pour éliminer les bactéries attachées à son corps. </li><li> Répétez l&#39;étape 4.1 et assurez-vous que le ver est exempt de bactéries. En règle générale, deux répétitions de 4,1 suffisent. </li><li> Placez délicatement le ver propre sur la surface du support 3D avec un pic de fil de platine. Le ver devrait finalement entrer dans l&#39;agar dans la matrice d&#39;agar 3D. </li><li> Fermez le couvercle permettant lâche un peu d&#39;air d&#39;entrer dans le tube, mais empêchant le séchage du milieu agar. </li><li> Incuber pendant 96 heures à 20 ° C. </li><li> Après 4 jours, fermez le couvercle hermétiquement et placer lechambre de culture NGT-3D dans un bain d&#39;eau C 88 ° pour faire fondre l&#39;agar-agar. La chaleur tue les vers mais leurs corps restent intacts. NOTE: L&#39;utilisation de 8 ml tubes pour NGT-3D, 20 - 30 minutes d&#39;incubation est généralement suffisant. </li><li> En utilisant une pipette en verre, transférer les médias fondus sur un plat en plastique de Pétri de 9 cm. pipettes en plastique ne sont pas informés, que les vers peuvent souvent tenir à eux. </li><li> En utilisant un microscope à dissection transmission stéréo, compter le nombre de vers à la L3, L4 et stades adultes. Ne pas compter les vers qui sont stade L2 et les plus jeunes, les générations F1 et F2 peuvent être confondus ici. Ainsi, cette analyse est une analyse de la taille des couvées par rapport au lieu d&#39;un dosage de la taille totale du couvain. </li></ol> 5. image et enregistrement Worm Comportement sur NGB-3D <ol><li> Choisissez un ver de stade L4 en utilisant un fil de platine sélectionner et éliminer toutes les bactéries collées à la surface par le transfert à une plaque NGM exempt de bactéries et de lui permettre de se déplacer librement pendant quelques minutes. </li><li> Répétez l&#39;étape 5.1 pour vous assurer que le worm est exempt de bactéries. </li><li> Placez délicatement le ver propre sur le centre de la surface de la gélose de la NGB-3D à proximité du col de la bouteille avec un pic de fil de platine. Le ver devrait finalement entrer dans l&#39;agar dans la matrice d&#39;agar 3D. </li><li> Fermez le couvercle permettant lâche un peu d&#39;air d&#39;entrer dans le tube, tout en empêchant le séchage du milieu agar. </li><li> Image ou enregistrer le ver sous un microscope binoculaire transmission stéréo. Réglez la mise au point que le ver se déplace à travers la matrice 3D. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La culture en laboratoire de C. elegans en utilisant les plaques de milieu de croissance des nématodes classiques était cruciale pour les centaines de découvertes importantes que la recherche en C. elegans a fourni. Ici, nous présentons de nouvelles méthodes pour cultiver C. elegans dans un environnement qui reflète plus fidèlement leurs habitats naturels en trois dimensions. Bien que d&#39; autres méthodes ont été utilisées pour observer C. elegans 13 en 3D, ceci est le pr...

L’étude en laboratoire du nématode Caenorhabditis elegans a conduit à des découvertes fondamentales dans le domaine de la biologie au cours des cinq dernières décennies1. C. elegans a été le premier organisme multicellulaire à avoir son génome séquencé en 19982, et il a été inestimable pour comprendre les contributions des gènes individuels au développement, à la physiologie et au comportement d’un organisme entier. Les scientifiques cherchent maintenant à mieux comprendre comment ces gènes peuvent contribuer à la survie et à la capacité de reproduction des organismes dans leur environnement naturel, en posant des questions sur l’écologie et l’évolution aux niveaux génétiques3 à 5. 
C. elegans peut une fois de plus fournir un excellent système pour répondre à ces questions. Cependant, on sait peu de choses sur la biologie de C. elegans dans les habitats naturels des nématodes, et il n’existe actuellement aucune méthode pour simuler les conditions naturelles contrôlées de C. elegans en laboratoire. En laboratoire, C. elegans est cultivé à la surface de plaques de gélose ensemencées de bactéries E. coli 6. Dans la nature, cependant, C. elegans et les nématodes apparentés peuvent être trouvés peuplant dans les sols du monde entier, mais on les trouve spécifiquement prospères dans les fruits en décomposition et la matière végétale7,8. Ces environnements complexes tridimensionnels (3D) sont très différents des environnements 2D simples auxquels les vers sont exposés en laboratoire. 
Pour commencer à répondre aux questions sur la biologie des nématodes dans un cadre 3D plus naturel, nous avons conçu un habitat 3D pour la culture en laboratoire des nématodes que nous avons appelé Nematode Growth Tube 3D ou NGT-3D en abrégé9. L’objectif était de concevoir un système de croissance 3D qui permette une croissance, un développement et une fertilité comparables aux plaques standard 2D de milieux de croissance des nématodes (NGM)10. Ce système soutient la croissance des bactéries et des nématodes tout au long de leur cycle de vie en 3D, permet aux vers de se déplacer et de se comporter librement en trois dimensions, et est facile et peu coûteux à fabriquer et à utiliser. 
Dans l’étude actuelle, nous proposons une méthode étape par étape pour fabriquer NGT-3D et évaluer le développement et la fertilité des vers. En plus d’évaluer la fitness des vers en 3D, nous avons cherché à imager, filmer et évaluer le comportement et la physiologie des vers en culture 3D. Ainsi, en plus de NGT-3D, nous présentons ici une méthode alternative appelée Nematode Growth Bottle 3D ou NGB-3D, pour l’imagerie microscopique de C. elegans lors de la culture 3D. Cela sera particulièrement important pour l’étude des comportements connus identifiés en 2D, et l’identification de nouveaux comportements uniques à la culture 3D.

<table><tbody><tr><td>LB bouillon, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Difco</td><td>224620</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>DAEJUNG</td><td>7548-4400</td><td>58.44 MW</td></tr><tr><td>Agar, granulé</td><td>Difco</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium, dihydraté</td><td>Bio Basic</td><td>CD0050</td><td>2*H2O ; 147.02 MW</td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Bio Basic</td><td>CD0122</td><td>386.67 MW</td></tr><tr><td>Alcool éthylique</td><td>B& J</td><td>RP090-1</td><td>99,99 %; 46,07 MW</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium anhydre</td><td>Bio Basic</td><td>MN1988</td><td>120,37 MW</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique anhydre</td><td>Bio Basic</td><td>PB0445</td><td>136,09 MW</td></tr><tr><td>2'-désoxy-5-fluorouridine</td><td>Tokyo Industrie chimique</td><td>D2235</td><td>246,19 MW</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique anhydre</td><td>Bio Basic</td><td>PB0447</td><td>174,18 MW</td></tr><tr><td>Tubes à essai polyvalents</td><td>Stockwell Scientific</td><td>ST.8570</td> 8 <td>ml</td></tr><tr><td>Bouchons pour tubes à essai</td><td>Stockwell Scientific</td><td>ST.8575</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture cellulaire</td><td>SPL Lifescience</td><td>70125</td><td>25 cm2</td></tr><tr><td>Research Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>Tête de caméra couleur haute définition</td><td>Nikon</td><td>DS-Fi2</td><td></td></tr><tr><td>Unité de commande basée sur PC</td><td>Nikon</td><td>DS-U3</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Recherche fondamentale, Logiciel d’imagerie microscope</td><td>Nikon</td><td>MQS32000</td><td></td></tr></tbody></table>

la culture de<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; en trois dimensions dans le laboratoire

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

L’utilisation d’organismes modèles génétiques tels que Caenorhabditis elegans a conduit à des découvertes fondamentales en biologie au cours des cinq dernières décennies. La plupart de ce que nous savons sur C. elegans se limite à la culture en laboratoire des nématodes qui ne reflètent pas nécessairement les environnements qu’ils habitent normalement dans la nature. La culture de C. elegans dans un habitat 3D plus similaire à la matrice 3D que les vers rencontrent dans les fruits pourris et le compost végétal dans la nature pourrait révéler de nouveaux phénotypes et comportements non observés en 2D. De plus, les expériences en 3D peuvent aborder la pertinence des phénotypes que nous observons en 2D pour le ver dans la nature. Ici, une nouvelle méthode dans laquelle C. elegans grandit et se reproduit normalement en trois dimensions est présentée. La culture de C. elegans dans le tube de croissance des nématodes 3D (NGT-3D) peut nous permettre de mesurer la capacité de reproduction des souches de C. elegans ou de différentes conditions dans un environnement 3D. Nous présentons également une nouvelle méthode, appelée Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), pour cultiver C. elegans en 3D à des fins d’analyse microscopique. Ces méthodes permettent aux scientifiques d’étudier la biologie de C. elegans dans des conditions qui reflètent davantage les environnements qu’ils rencontrent dans la nature. Ceux-ci peuvent nous aider à comprendre la pertinence évolutive sous-jacente de la physiologie et du comportement de C. elegans que nous observons en laboratoire.

La construction de NGT-3D est un protocole simple et direct qui se traduit par un tube d&#39;essai d&#39; agar-rempli avec de petites colonies bactériennes espacées tout au long de l&#39;agar - agar (figure 1A). Les vers peuvent se déplacer librement à travers la matrice d&#39;agar, la recherche et la consommation des colonies bactériennes. Pour vérifier si C. elegans peuvent se reproduire et se développer normalement dans NGT-3D, nous avons comparé la fertilité...

Nous présentons une méthode simple pour construire 3D systèmes de culture de nématodes appelés NGT-3D et NGB-3D. Ceux - ci peuvent être utilisées pour étudier le nématode fitness et des comportements dans des habitats qui sont plus semblables à Caenorhabditis elegans naturelles habitats que les laboratoires C. plaques de culture elegans 2D standard.

la culture de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; En trois dimensions dans le laboratoire

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

L’objectif global de cette procédure est de fabriquer un système de culture tridimensionnel pour les nématodes qui pourrait mieux simuler les conditions naturelles. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine du développement, de la physiologie et du comportement de Célégan. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous étudiions le comportement naturel des nématodes dans les fruits en décomposition, qui est un environnement 3D.Cette technique est avantageuse par rapport aux techniques de culture bidimensionnelles standard car les nématodes résident dans des habitats 3D dans la nature. Bien que cette méthode ait été développée pour la culture de C elegans, elle peut également être appliquée à d’autres nématodes. La démonstration de cette procédure sera faite par Tong Young Lee, un étudiant diplômé de mon laboratoire.Pour commencer cette procédure, Otto Clave a préparé les solutions à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, préparez 50 millilitres de la solution de cholestérol stérile à 5 milligrammes par millilitre. Dans un tube conique de 50 millilitres, ajoutez 0,25 gramme de cholestérol et 50 millilitres d’éthanol à 99,99 %

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Source : Petersen, C. et al., Isolement et caractérisation du microbiote naturel du nématode modèle Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)Cette vidéo montre l’isolement et la culture d’espèces bactériennes associées à Caenorhabditis elegans. Une lyse par billes de C. elegans, suivie d’une culture sélective, permet d’isoler diverses souches microbiennes pour une analyse ultérieure.

Isolement et culture de Caenorhabditis elegans - Bactéries associées

Nous décrivons ici un protocole révisé pour la culture à grande échelle de l'embryon C. elegans cellules. Embryonnaire C. elegans cellules cultivées in vitro à l'aide de cette méthode, semblent différencier récapituler et l'expression de gènes d'une manière spécifique de la cellule. Les techniques qui nécessitent un accès direct à des cellules ou à l'isolement de types de cellules spécifiques à partir d'autres tissus peuvent être appliquées sur C. elegans cellules cultivées.

Un procédé de culture embryonnaire<em&gt; C. elegans</em&gt; Cellules

C. elegans est généralement cultivées sur des plaques de gélose solide ou dans des cultures liquides ensemencés avec E. coli. Pour éviter des sous-produits bactériens de confondre les études toxicologiques et nutritionnels, nous avons utilisé un milieu liquide axénique, CEHR, de croître et de synchroniser un grand nombre de vers pour une gamme d'applications en aval.

Culture Caenorhabditis elegans En Axenic Liquid Media et création d'transgéniques Worms par bombardement de microparticules

Nous présentons ici le nématode Caenorhabditis elegans comme un modèle d’hôte polyvalent pour étudier l’interaction microbienne.

Le nématode Caenorhabditis Elegans - un modèle polyvalent In Vivo pour étudier les Interactions hôtes-microorganismes

Ce protocole décrit une méthode pour la culture à grande échelle de Caenorhabditis elegans , sur des milieux solides. Comme alternative à la culture liquide, ce protocole permet d’obtenir les paramètres de différentes échelles en culture axée sur la plaque. Cela augmente la comparabilité des résultats en omettant les différences morphologiques et métaboliques entre culture des médias liquides et solides.

Axée sur la plaque de culture à grande échelle de Caenorhabditis elegans: préparation des échantillons pour l’étude des modifications métaboliques dans le diabète

Le protocole décrit une conception simple de puces microfluidiques et une méthodologie de microfabrication utilisées pour cultiver C. elegans en présence d’un approvisionnement alimentaire continu jusqu’à 36 heures. Le dispositif de croissance et d’imagerie permet également une imagerie intermittente à haute résolution à long terme des processus cellulaires et sous-cellulaires pendant le développement pendant plusieurs jours.

Une puce microfluidique simple pour la croissance à long terme et l’imagerie de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans est l’une des principales espèces modèles en biologie, mais presque toutes les recherches sont effectuées en l’absence de ses microbes naturellement associés. Les méthodes décrites ici aideront à améliorer notre compréhension de la diversité des microbes associés comme base pour les futures recherches fonctionnelles sur C. elegans.

Isolement et caractérisation du microbiote naturel du nématode modèle Caenorhabditis elegans

Les microcosmes de compost apportent la diversité microbienne trouvée dans la nature en laboratoire pour faciliter la recherche sur le microbiome chez Caenorhabditis elegans. Voici des protocoles pour la mise en place d’expériences de microcosme, les expériences démontrant la capacité de moduler la diversité microbienne environnementale pour explorer les relations entre la diversité microbienne environnementale et la composition du microbiome intestinal du ver.

Microcosmes de compost en tant qu’environnements naturels diversifiés sur le plan microbien pour la recherche sur le microbiome chez Caenorhabditis elegans

Un protocole optimisé pour la culture de nématodes individuels isolés sur des milieux solides dans des dispositifs multipuits microfabriqués est présenté ici. Cette approche permet de surveiller chaque animal tout au long de sa vie pour une variété de phénotypes liés au vieillissement et à la santé, y compris l’activité, la taille et la forme du corps, la géométrie du mouvement et la survie.

Culture à long terme et surveillance de Caenorhabditis elegans isolés sur des milieux solides dans des dispositifs multipuits

Ici, nous présentons un protocole de culture de nématodes individuels isolés sur des milieux solides pour le suivi des paramètres physiologiques tout au long de la vie et la quantification de la fluorescence. Ce système de culture comprend une barrière d’acide palmitique autour des puits à ver unique pour empêcher les animaux de fuir, ce qui permet l’utilisation d’interventions aversives, y compris des bactéries pathogènes et des facteurs de stress chimiques.

Culture à long terme de Caenorhabditis elegans individuelle sur milieu solide pour la surveillance longitudinale de la fluorescence et les interventions aversives

Découvrez la culture tridimensionnelle de Caenorhabditis elegans pour étudier le comportement et la physiologie des nématodes dans des conditions naturelles. Cette méthode améliore les analyses de comportement comparées aux techniques bidimensionnelles standard.

la culture de

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