Name: Análise integridade do DNA de células-Free em amostras de urina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprenda a analisar a integridade do DNA livre de células em amostras de urina para diagnóstico precoce não invasivo de câncer de bexiga e próstata. Este método oferece alta sensibilidade e especificidade.

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Os autores agradecem a Gráinne Tierney e Silvia Bellissimo por sua assistência editorial.

O protocolo segue as orientações do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos IRST. NOTA: Neste protocolo, isolado DNA a partir de amostras de urina para realizar uma análise de integridade do DNA UCF. LNCaP e células MRC linhas foram utilizados para construir padrões. Técnicas tais como a extracção de ADN, a quantificação de ADN (espectrofotómetro e PCR em tempo real para o gene de controlo, STOX1), e PCR em tempo real para oncogenes específicos foram realizados (Figura 1). 1. Recolha de urina e Processamento <ol><li> Obter uma de urina limpa primeira manhã amostra de urina em um copo limpo e seco, de plástico. Recolher pelo menos 50 ml da amostra de urina. </li><li> Manter a urina, a 4 ° C durante um máximo de 3 h e enviá-lo para o laboratório, à mesma temperatura. </li><li> Misture cada amostra invertendo-lo duas vezes imediatamente após a chegada no laboratório e transferência em dois tubos de polipropileno de fundo cónico de 50 ml. </li><li> Centrifugar os tubosa 850 xg durante 10 min a 4 ° C ou à temperatura ambiente. </li><li> transferir cuidadosamente 10 ml de a parte superior do sobrenadante de urina em dois tubos de 5 mL, deixando, pelo menos, 2 ml do sobrenadante acima da pelete de células. NOTA: Transferir a parte superior do sobrenadante reduz o risco de contaminação por células ou detritos celulares. Não há nenhuma clara delimitação entre as partes superior e inferior. </li><li> Desprezar o pelete e congelar imediatamente o sobrenadante a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol> 2. Isolamento de ADN a partir do sobrenadante de urina e linhas celulares NOTA: Isolar o ADN a partir de uma linha celular (por exemplo, LNCaP de cancro da próstata ou cancro da bexiga para MRC) usando um estojo comercial e seguindo as instruções do fabricante. Isolamento de ADN a partir do sobrenadante de urina deve ser realizado utilizando o protocolo comercial, modificado como se segue: <ol><li> Descongelar uma alíquota do sobrenadante de urina, à temperatura ambiente. &lt;/ Li&gt; <li> Vortex e misturar a amostra de urina e transferir 1 ml de sobrenadante a urina para um tubo de 5 mL claro. Congelar a urina residual à temperatura de -80 ° C. </li><li> Adicionar 100 ul de proteinase K directamente para a amostra. </li><li> Adicionar 1 mL de tampão AL à amostra e misturar bem por pipetagem. </li><li> Feche os tubos e incubar as amostras a 56 ° C durante 15 min. </li><li> Durante a incubação, preparar uma coluna para cada amostra e preparação dos tampões de lavagem, e AW1 AW2, conforme instruções do fabricante (adicionar a quantidade indicada de 100% de etanol). </li><li> Trazer as amostras de volta à temperatura ambiente e adicionar 1 ml de etanol absoluto. Misturar completamente por pipetagem. </li><li> Adicionar 650 ul da mistura obtida no passo 2.7 para a coluna e centrifugar-lo a 6,000 xg durante 1 min. </li><li> Descartar o tubo contendo o fluxo de passagem e colocar a coluna em um tubo de recolha de novo, limpo. Repita os passos 2.8 e 2.9 até que toda a mistura de amostra foi usado (5 vezes). </li><li> Adicionar 500 &amp;# 181; ul de tampão AW1 sem molhar a borda da coluna. Centrifugar-lo a 6,000 xg durante 1 min. </li><li> Descartar o tubo contendo o fluxo de passagem e substituí-lo por um novo tubo de recolha, limpo. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de AW2 sem molhar a borda da coluna. Centrifugar-lo à velocidade máxima (20000 x g) durante 3 min. </li><li> Descartar o tubo contendo o fluxo de passagem e substituí-lo por um novo tubo de recolha, limpo. </li><li> Repita o passo 2.12 para remover qualquer tampão de lavagem residual. </li><li> Colocar a coluna para um tubo limpo de 1,5 mL. Adicionar 50 ul de tampão de eluição AE e esperar 7 min para assegurar que os molha tampão da coluna. </li><li> Centrifugar a 8.000 xg lo durante 1 min. </li><li> Pipetar o eluente do passo 2.15 para o mini-coluna e centrifugar-lo à velocidade máxima durante 1 min para assegurar a máxima recuperação do DNA. </li></ol> 3. DNA Quantificação e Diluição <ol><li> Usando um espectrofotómetro, realizar a quantificação do ADN de both, a linha de células e as amostras de urina sobrenadante. Use 2 ul de amostra num espectrómetro de bancada, de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Diluir as amostras de DNA de UCF para obter uma concentração de 1 ng / mL e armazenar o ADN à temperatura de -20 ° C até que a análise da integridade do ADN. NOTA: Se a quantidade de ADN não é suficiente para prosseguir com PCR em tempo real (pelo menos 100 ng), realizar um novo processo de isolamento de DNA. </li><li> Dilui-se o ADN a partir de amostras de linha de células para obter seis padrões com diferentes concentrações: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 e 2 ng / mL, cada uma com um volume de 100 uL (ST1, ST2, ST3, sT4, ST5, e ST6). Armazenar os padrões de ADN da linha de células à temperatura de -20 ° C até que a análise da integridade do ADN. </li></ol> 4. DNA Integrity Test - PCR <ol><li> Descongelar os iniciadores (a concentração depende do tipo de ensaio), Supermix verde, padrões de ADN da linha de células, e amostras de DNA UCF diluídos em gelo. </li><li> Prepare tubos tira na placa de fou o disco do rotor 72 poços. Alíquota de 10 uL em duplicado para cada padrão e amostra diluída e 10 uL de água isenta de RNase para o controlo negativo. </li><li> Prepara-se uma mistura de 1 mL de cada iniciador (as concentrações são indicadas na Tabela 1), 12,5 uL de Supermix verde, e 6,5 mL de água isenta de RNase para cada amostra. Ao preparar a mistura, utilize o seguinte número de amostras: 6 padrões para 2 repetições, número de amostras por 2 repetições, controle negativo para 2 repetições, e 2 amostras extras. </li><li> Aliquota de 15 uL da mistura em cada cavidade. Não pipeta ou girar os tubos. </li><li> Inicie o protocolo com as condições de PCR indicados na Tabela 1. NOTA: Para obter o valor DNA UCF, 29 amostras de DNA foram processados ​​para cada experimento em tempo real usando o disco do rotor 72 poços: 29 x 2 amostras + 6 x 2 padrões + control x 2 = 72 (valor de DNA UCF) negativo. NOTA: O protocolo para a análise da integridade do ADN também pode ser UCFrealizada utilizando um outro instrumento de PCR em tempo real (quando se utiliza um outro dispositivo, ROX corante pode precisar de ser adicionado). </li></ol> 5. DNA Integrity Test - Análise de Dados e Interpretação NOTA: O valor de ADN UCF para cada amostra foi obtida por um software de sistema de detecção de instrumento em tempo real, utilizando uma construção curva padrão para cada avaliação individual do gene por PCR e utilizando interpolação curva padrão, tal como anteriormente descrito 7-9 (Figura 2). <ol><li> Avaliar as repetições; amostra replica com uma diferença ≥1 Ct deve ser descartado e re-avaliado em um segundo experimento. </li><li> Calcule o Ct mediana para cada amostra e considerar amostras com um valor de Ct ≤ 36. </li><li> Avaliar a especificidade dos produtos de PCR por meio de análise de fusão. </li><li> Avaliar a concentração de cada fragmento amplificado por interpolação com a curva padrão; obter um valor de concentração (ng / mL) para cada fragmento amplificado.</li>
</ol>

<ol><li>Francis, G., Stein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Cell-Free+Tumour+DNA+in+the+Management+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Mol.Sci%22%5BJournal%5D)">Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer.</a> Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).</li>
<li>Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Nucleic+Acids+in+Urine%3A+Sources%2C+Structure%2C+Diagnostic+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential.</a> Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).</li>
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<li>Ishkanian, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+array+CGH+identifies+novel+regions+of+genomic+alteration+in+intermediate-risk+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer.</a> Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).</li>
<li>Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Her-2%2Fneu+oncogene+amplification+in+clinically+localised+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Patho%22%5BJournal%5D)">Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer.</a> J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).</li>
<li>Nord, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+amplifications+are+associated+with+high+grade+and+recurrences+in+stage+Ta+bladder+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma.</a> Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).</li>
<li>Tabach, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+the+20q+chromosomal+arm+occurs+early+in+tumorigenic+transformation+and+may+initiate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer.</a> PLoS One. 6 (1), e14632(2011).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

UCF análise da integridade do ADN é um método novo, não invasivo para avaliar a integridade do ADN na urina. Recentemente, foi proposto para o diagnóstico precoce da bexiga e próstata 9 7,8. Um certo número de vantagens e desvantagens do teste de integridade do DNA UCF são discutidos aqui, juntamente com perspectivas futuras. A principal vantagem do método é que ele oferece um método barato, não-invasivo e um protocolo simples para estudar urina como uma fonte potencial...

ADN livre de células pode ser detectado no sangue e na urina devido a morte celular por mecanismos apoptóticos ou necróticos. DNA livre de células no sangue tem sido amplamente estudada para fins de diagnóstico e prognóstico em várias doenças, especialmente câncer 1. No entanto, pouco se sabe sobre o papel do DNA urinário livre de células (UCF). DNA UCF podem ser originários de passagem de sangue através do sistema de filtração glomerular ou a partir de células que entram em contacto directo com este corpo fluido 2 (por exemplo, células uroteliais ou células prostáticas). A utilização de ADN UCF como uma fonte de biomarcadores tem sido principalmente investigado para o diagnóstico precoce de doença renal, da bexiga, e cancro da próstata, devido à elevada percentagem de ADN UCF vindo directamente a partir de células do tracto urinário 3,4. Pouco se sabe sobre DNA UCF e os melhores métodos para isolar e caracterizar-lo. Tendo em conta a hipótese de que as células tumorais libertar fragmentos de ADN mais longos do que as células normais, a avaliaçãoda integridade do ADN isento de células foi estudada na tentativa de elucidar a origem de ADN na circulação sanguínea 5. Alguns estudos demonstraram que a integridade do ADN isento de células no sangue representa um bom teste de diagnóstico para muitos tipos de cancro 6, e a mesma hipótese tem sido proposta em relação à urina 7-9. Este artigo descreve um novo método para a análise de integridade do DNA UCF com um potencial de aplicação para detecção de bexiga e câncer de próstata. Em particular, a integridade do ADN UCF fragmentos superiores a 250 pb foi testado em 4 regiões conhecidas por terem um aumento do número de cópias de ADN em tumores sólidos, incluindo o da próstata e cancro da bexiga: c-myc (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2) e AR (Xq12) 10-14. oncogenes específicos, em vez de seqüências aleatórias, foram escolhidos para aumentar a probabilidade de encontrá-los na fração livre de células de pacientes com câncer. Uma das principais vantagens deeste método é que é flexível e que outras regiões podem também ser seleccionada com base no tipo de tumor e características.

<table><tbody><tr><td>Mini Kit QIAamp DNA &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&nbsp; Supermix Verde, 100 x 50 &micro; L rxns, 2,5 mL (2 x 1,25 mL)</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>IDT oligos de DNA personalizados&nbsp;</td><td>IDT&nbsp;</td><td></td><td>Purificação da HPLC, espectrofotômetro oligo NanoDrop 1000 do ADN 100nMole</td></tr><tr><td></td><td>Thermo científico</td><td></td><td>Outros métodos espectrofotométricos podiam igualmente ser usados quantificar o</td></tr><tr><td>Rotor-Gene 6000</td><td>Corbett</td><td></td> do ADN <td>um outro instrumento do PCR do tempo real poderia igualmente ser centrifugador usado</td></tr> do <tr><td>microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>um para os tubos de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>50 mL<td>incubadora-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C freezer-20</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&graus; C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &#956; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &#956; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &#956; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &#956; Ponteiras de pipeta</td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>(10; 20; 200; 1.000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL Tubos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 50 mL Tubos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de<td>15 mL</td></tr><tr><td>Rotor-Disc 72 Rotor</td><td>Corbett</td><td>9018899</td><td></td></tr><tr><td>Tubos e tampas de tira, 0,1 mL (250)</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de coleta (2 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td></td></tr><tr><td>Tampão AL (264 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (10 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr></tbody></table>

análise integridade do dna de células-free em amostras de urina

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Embora a presença de ADN de circulação livre de células no plasma ou soro tem sido amplamente demonstrado ser uma fonte adequada de biomarcadores para muitos tipos de cancro, poucos estudos têm-se centrado na utilização potencial de ADN isento de células de urina (UCF). A partir das hipóteses de que as células em apoptose normais produzem DNA altamente fragmentado e que as células cancerosas liberam mais DNA, o papel potencial da integridade do DNA UCF foi avaliada como um marcador diagnóstico precoce capaz de distinguir entre os pacientes com câncer de próstata ou câncer de bexiga e indivíduos saudáveis. Uma análise da integridade do ADN UCF é proposta com base em quatro reacções de PCR quantitativo em tempo real de quatro sequências mais longas do que 250 pb: c-myc, BCAS1, HER2, e AR. As sequências que têm frequentemente um aumento do número de cópias de ADN na bexiga e cancros da próstata foram escolhidos para análise, mas o método é flexível, e estes genes podem ser substituídos por outros genes de intedescansar. A utilidade potencial de DNA UCF como fonte de biomarcadores já foi demonstrado para neoplasias urológicas, abrindo assim o caminho para novos estudos sobre a caracterização DNA UCF. O teste de integridade do DNA UCF tem a vantagem de ser não-invasivo, rápido, e fácil de executar, com apenas alguns mililitros de urina necessários para levar a cabo a análise.

A concentração total de ADN livre foi quantificado por espectrofotometria para todas as amostras analisadas, mostrando uma gama de entre 1,51 e 138 ng / mL. Cinco amostras de controlo foram utilizados para a reprodutibilidade dos dados: duas experiências independentes em tempo real foram realizados para c-myc, HER2, BCAS1, AR, e STOX1. Os coeficientes de variação (CV) foram então calculados para cada gene (Tabela 2), com um bo...

Um método para analisar a integridade do DNA na fração sobrenadante livre de células de amostras de urina é proposto. O método é adequado para a detecção precoce de neoplasias urológicas e provou ser preciso para o diagnóstico precoce do câncer de bexiga.

Análise integridade do DNA de células-Free em amostras de urina

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

O objetivo geral deste método é avaliar a integridade do DNA livre de células urinárias em sequências oncogênicas específicas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer urológico, como o diagnóstico precoce não invasivo de câncer de bexiga e próstata. A principal vantagem dessa técnica é que ela é fácil de fazer e analisar.As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de neoplasias urológicas, pois normalmente liberam células e ácidos nucléicos livres na urina. Embora esse método possa fornecer informações sobre amostras urinárias, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como soro ou plasma. Geralmente, indivíduos novos neste método teriam dificuldades porque a concentração de DNA livre de células de urina costuma ser baixa.Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando tentamos encontrar um método simples para detecção precoce não invasiva do câncer de bexiga. Para iniciar o procedimento, obtenha uma amostra de urina limpa de 50 mililitros na primeira manhã que foi armazenada a quatro graus Celsius por não mais de três horas. Inverter a amostra duas vezes e, em seguida, particioná-la em dois tubos de centrífuga cónica de 50 mi

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar com precisão a múltiplas alterações genéticas de uma região de destino em uma única reação usando ddPCR de entrega e um único par de testes de hidrólise.

Reação em Cadeia da Polimerase Digital de Gota Única para Detecção Abrangente e Simultânea de Mutações em Regiões de Hotspot

O kit de DNA de DIAGNÓSTICO apresentado é um método de economia de tempo e fácil de usar para determinar a probabilidade confiável da presença de lesões de câncer colorretal.

Avaliação do Risco e Prevalência de Câncer Colorretal por Detecção de Integridade do DNA das fezes

Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar mutações somáticas do tumor no ADN de circulação atual nos líquidos biológicos pacientes (biofluids). Nosso método baseado da reacção em cadeia digital do polymerase da gota (dpcr)-permite a quantificação da freqüência alélicas da mutação de tumor (MAF), facilitando um complemento minimamente invasor ao diagnóstico e à monitoração temporal da resposta do tumor.

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Nós descrevemos aqui métodos para a quantificação sensível e exata das lesões 8-oxo-7,8-dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,n6-dAdo) e 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-DGUO) no ADN. Os métodos foram aplicados na avaliação dos efeitos da matéria particulada fina ambiente (PM2,5) nos tecidos (pulmão, fígado e rim) de camundongos a/J expostos.

Quantificação de três lesões de DNA por espectrometria de massas e avaliação de seus níveis em tecidos de camundongos expostos a material particulado fino ambiente

Neste artigo apresentamos um protocolo detalhado para a técnica de biópsia líquida não invasiva, incluindo coleta de sangue, separação de plasma e casaco buffy, extração de DNA cfDNA e germinal, quantificação de DNA cfDNA ou germinal, e análise de enriquecimento de fragmentos cfDNA.

Detecção de DNA livre de células em amostras de plasma de sangue de pacientes com câncer

Um método não-rótulo, não-isotópico não-radio-isotópico para avaliar a atividade uracil-DNA glicosylase foi desenvolvido usando espectrometria de massa MALDI-TOF para análise direta do produto que contém local apurinic/apyrimidinic. O ensaio provou ser bastante simples, específico, rápido e fácil de usar para a medição de glicosilase de DNA.

Ensaio de Glicosylase Uracil-DNA por Desorção a Laser Assistida por Matriz/Análise de Espectrometria de Massa

O ensaio de cometa é um meio popular de detectar danos ao DNA. Este estudo descreve uma abordagem para a execução de lâminas em variantes representativas do ensaio do cometa. Essa abordagem aumentou significativamente o número de amostras, diminuindo o tempo de execução do ensaio, o número de manipulações de lâminas e o risco de danos aos géis.

Uma abordagem de ensaio de cometa de alto rendimento para avaliar danos ao DNA celular

A biópsia líquida revolucionou nossa abordagem para estudos translacionais em oncologia, com coleta de amostras, qualidade e armazenamento sendo passos cruciais para sua aplicação clínica bem sucedida. Aqui descrevemos um protocolo padronizado e validado para aplicações de DNA sem circulação a jusante que podem ser aplicados na maioria dos laboratórios de pesquisa translacional.

Um protocolo pré-analítico de biópsia líquida padronizada para aplicações de DNA sem circulação a jusante

Este protocolo descreve um teste de biomarcador sintético de urina multianalito mediado por CRISPR-Cas que permite o diagnóstico de câncer no ponto de atendimento por meio da análise ex vivo das atividades de protease associadas ao tumor.

Teste de Biomarcador Sintético de Urina Multianalito Mediado por CRISPR-Cas para Diagnóstico Portátil

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de sequenciamento de próxima geração automatizado e credenciado pela ISO15189 para detectar alterações genômicas direcionáveis em tecidos embebidos em parafina fixados em formalina de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).

Detecção de alterações direcionáveis no câncer de pulmão de células não pequenas usando sequenciamento de última geração

Aprenda a analisar a integridade do DNA livre de células em amostras de urina para diagnóstico precoce não invasivo de câncer de bexiga e próstata. Este método oferece alta sensibilidade e especificidade.

Análise integridade do DNA de células-Free em amostras de urina

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