Análise integridade do DNA de células-Free em amostras de urina

O objetivo geral deste método é avaliar a integridade do DNA livre de células urinárias em sequências oncogênicas específicas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer urológico, como o diagnóstico precoce não invasivo de câncer de bexiga e próstata. A principal vantagem dessa técnica é que ela é fácil de fazer e analisar.

As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de neoplasias urológicas, pois normalmente liberam células e ácidos nucléicos livres na urina. Embora esse método possa fornecer informações sobre amostras urinárias, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como soro ou plasma. Geralmente, indivíduos novos neste método teriam dificuldades porque a concentração de DNA livre de células de urina costuma ser baixa.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando tentamos encontrar um método simples para detecção precoce não invasiva do câncer de bexiga. Para iniciar o procedimento, obtenha uma amostra de urina limpa de 50 mililitros na primeira manhã que foi armazenada a quatro graus Celsius por não mais de três horas. Inverter a amostra duas vezes e, em seguida, particioná-la em dois tubos de centrífuga cónica de 50 mililitros.

Centrifugar a amostra a 850 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, para cada tubo, transfira 10 mililitros da parte superior do sobrenadante para dois tubos de cinco mililitros, deixando pelo menos dois mililitros de sobrenadante acima do pellet. Rejeitar os pellets e armazenar o sobrenadante a 80 graus Celsius negativos.

Repita este processo para amostras de urina adicionais, conforme necessário. Para iniciar a purificação do DNA, para cada amostra, descongele uma alíquota de sobrenadante de urina. Vortex a amostra descongelada e inverta o tubo duas vezes.

Coloque um mililitro da amostra em um tubo de cinco mililitros e armazene o restante a menos 80 graus Celsius. Prepare um kit de purificação de DNA adequado para amostras de urina de acordo com as instruções do fabricante. Adicione 100 microlitros de proteinase K e um mililitro de tampão de lise à amostra e misture bem com uma pipeta.

Incubar a amostra a 56 graus Celsius por 15 minutos. Durante a incubação, prepare os tampões de lavagem em uma coluna de centrifugação. Após a incubação, deixe a amostra esfriar até a temperatura ambiente e, em seguida, adicione um mililitro de etanol absoluto e misture bem por pipetagem.

Transfira 650 microlitros da amostra para a coluna. Centrifugue a 6000 vezes G por um minuto. Substitua o tubo de coleta e repita esse processo até que toda a amostra tenha sido carregada na coluna.

Em seguida, adicione 500 microlitros do primeiro tampão de lavagem e centrifugue a coluna a 6000 vezes G por um minuto. Substitua o tubo de coleta, adicione 500 microlitros do segundo tampão de lavagem e centrifugue a coluna na velocidade máxima por três minutos. Coloque a coluna em um tubo de coleta limpo e centrifugue na velocidade máxima por mais três minutos para remover o tampão de lavagem residual.

Transfira a coluna para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mililitro. Carregue 50 microlitros de tampão de eluição na coluna e deixe o tampão de molho na coluna por sete minutos. Em seguida, centrifugue a coluna a 6000 vezes G durante um minuto.

Pipetar o eluído de volta para a coluna e centrifugar a coluna à velocidade máxima durante um minuto para obter o ADN livre de células urinárias. Para começar a preparar os padrões, primeiro isole o DNA de uma linhagem celular apropriada usando um kit de purificação. Quantifique o DNA de cada amostra de urina purificada na linha celular com um espectrofotômetro de acordo com as instruções do fabricante do kit.

Diluir o ADN da UCF a um nanograma por microlitro e armazenar as amostras diluídas a 20 graus Celsius negativos até estarem prontas para o teste de integridade. Dilua o DNA da linha celular para criar seis padrões de 100 microlitros de diferentes concentrações. Armazene os padrões a menos 20 graus Celsius.

Para iniciar o teste de integridade do DNA, descongele as amostras de DNA UCF, os padrões, os primers de PCR apropriados e a supermistura verde no gelo. Em seguida, configure a placa do disco do rotor de 72 poços com tubos de tira. Coloque duas alíquotas de 10 microlitros padrão e, em seguida, cada amostra em poços.

Preparar dois poços de 10 microlitros de água isenta de RNase como controlo negativo. Para cada poço cheio, prepare uma mistura de um microlitro de cada primer, 12,5 microlitros de supermix verde e 6,5 microlitros de água livre de RNase. Transfira 15 microlitros da mistura para cada poço cheio e, em seguida, transfira os poços para um disco de rotor de 72 poços.

Realize a PCR com um instrumento em tempo real de acordo com as especificações do fabricante. Usando o software do instrumento, verifique se alguma réplica tem uma diferença de valor limite de ciclo de uma ou mais. Descarte essas amostras da análise e avalie o limite médio de ciclagem para as amostras restantes.

Realize a análise de fusão em cada amostra com um valor médio de limite de ciclagem de 36 ou menos para avaliar a especificidade do produto de PCR. Em seguida, use a curva padrão para determinar uma concentração em nanogramas por microlitro para cada aplique. O DNA livre de células urinárias foi isolado e a integridade do DNA foi avaliada em quatro regiões que apresentam aumento do número de cópias de DNA em tumores sólidos.

Uma sequência de controle também foi avaliada para verificar se a quantidade de DNA em cada amostra era suficiente para o teste de integridade. A concentração total de DNA livre e os coeficientes de variação foram calculados para cada gene. Este método mostra 73% de sensibilidade e 84% de especificidade para detectar câncer de bexiga, mas apenas 58% de sensibilidade e 44% de especificidade para câncer de próstata.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em um dia útil se for executada corretamente. Seguindo este procedimento, outros métodos, como PCR digital ou sequenciamento de próxima geração, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como indutor do número de cópias dos genes de interesse. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar o DNA livre de células da urina de uma maneira muito simples e como estudar a integridade de regiões específicas de interesse usando abordagens de PCR em tempo real.