A rápida, Método Scalable para o isolamento, estudo funcional, e Análise de matriz extracelular derivado de celular

O objetivo geral deste procedimento é isolar a matriz extracelular de células cultivadas para uma ampla variedade de experimentos a jusante, para ajudar a entender as funções e propriedades da matriz extracelular em tecidos normais e processos de doenças. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da matriz extracelular, como a organização, composição molecular, interações proteicas ou propriedades funcionais da matriz extracelular. Além disso, a matriz extracelular pode ser preparada a partir de qualquer tipo de célula aderente.

A principal vantagem dessa técnica é que elas podem ser realizadas em diferentes escalas para remover células com eficiência e reter proteínas da matriz extracelular. Demonstrando o procedimento estarão Silvia Rosini, uma estudante de pós-graduação em meu laboratório, e Andrew Hellewell, um pesquisador de pós-doutorado. Para começar, células de placa em lamínulas para a imagem de células vivas e matriz extracelular ou ECM.

Para estudos de microscopia de florescência, um ECM fixo. Ou para preparação de ECM derivada de células para estudos funcionais de pequena escala. Incube as células a uma temperatura e umidade adequadas por um tempo adequado para que as células depositem a ECM.

Normalmente superior a 16 horas. Em um exaustor, prepare hidróxido de amônio 20 milimolar em um recipiente adequado usando água deionizada para diluir a solução de estoque de um a 14. Remova as células da incubadora e remova suavemente o meio de cultura.

Em seguida, adicione PBS sem cálcio ou magnésio, despejando suavemente contra a parede do prato. Balance o prato duas vezes e despeje o líquido. Em seguida, repita a lavagem mais duas vezes.

No exaustor, remova a última lavagem PBS, adicione 1,5 mililitros de hidróxido de amônio por prato de 60 milímetros e incube as placas em temperatura ambiente por cinco minutos. Agite suavemente a louça a cada minuto para garantir a lise de todas as células. Em seguida, adicione grandes quantidades de água deionizada a cada prato e balance o prato.

Em seguida, despeje o material solubilizado de hidróxido de amônio, que é composto de hidróxido de amônio, células lisadas e água deionizada. Lave a camada insolúvel de ECM em grandes quantidades de água deionizada mais quatro vezes, para garantir a remoção completa de todo o material solubilizado em hidróxido de amônio. É essencial que as células sejam totalmente removidas com lavagens abundantes em água deionizada.

Se essas etapas não forem executadas adequadamente, o material celular pode permanecer no prato e contaminar a análise a jusante. Para o exame da ECM por imunofluorescência, remova a água deionizada restante, fixe a ECM adicionando 2% de paraformaldeído, abreviado PFA, e incube os pratos em temperatura ambiente por 10 minutos. Use PBS para lavar cada amostra fixa duas vezes e descarte a solução em um recipiente de resíduos líquidos antes de realizar a microscopia de fluorescência de acordo com o protocolo de texto.

Em uma capela de fluxo laminar, prepare soluções estéreis de PBS sem cálcio e magnésio, hidróxido de amônio 20 milimolar e água deionizada, passando cada solução por um filtro estéril de 0,2 micrômetro para um recipiente estéril apropriado. Mantendo a técnica estéril, use PBS estéril para lavar suavemente as células produtoras da matriz em lamínulas três vezes. Depois de remover a lavagem final do PBS, adicione 1,5 mililitros de hidróxido de amônio estéril ao prato de 60 milímetros e incube em temperatura ambiente por cinco minutos com balanço intermitente.

Adicione grandes quantidades de água deionizada estéril ao prato com balanço, despeje o lisado celular em um recipiente de resíduos apropriado. Repita esta lavagem mais quatro vezes para garantir a remoção completa do material solubilado. Depois de tripsinizar e peletizar as células de acordo com o protocolo de texto, ressuspenda as células de teste em meio estéril fresco e use um hemocitômetro para contar as células.

Em seguida, coloque o número adequado de células de ensaio e de meio de cultura na ECM isolada estéril em lamínulas e incube durante duas a três horas ou durante o tempo necessário. Para examinar a organização do citoesqueleto de actina, fixe as células de teste em 2% de PFA e comode-as com FITC-Faloidina para visualizar a F-actina e DAPI para visualizar os núcleos. Depois de cultivar um grande número de células, remover as células e lavar o ECM conforme demonstrado anteriormente no vídeo, incline cada placa em um ângulo para drenar a água residual para o fundo do prato e use uma pipeta P200 para remover cuidadosamente qualquer água restante até que a placa esteja completamente seca.

Ao mesmo tempo, aqueça o tampão de amostra SDS-PAGE contendo 100 milimolares DDT a 95 graus Celsius por dois minutos e adicione 200 microlitros a cada placa de 100 milímetros a ser examinada por immunoblot. Use um raspador de células para coletar a amostra em um lado do prato e use uma ponta de pipeta de 200 microlitros para transferi-la para um tubo. Para analisar a ECM por espectrometria de massa, prepare uma amostra mais concentrada coletando o tampão de amostra SDS-PAGE da placa, reaquecendo-a a 95 graus Celsius e usando a mesma alíquota em duas a três placas adicionais.

Transfira qualquer extrato residual de tampão de amostra SDS-PAGE da ponta do raspador de células para o tubo para minimizar a perda de material ECM. Para uma extração eficaz do ECM isolado no tampão de amostra SDS-PAGE, é essencial que o tampão de amostra seja aquecido a 95 graus, contenha um agente redutor e que a placa seja raspada extensivamente. Aqui são mostradas células COS-7 cultivadas em lamínulas de vidro.

O tratamento com hidróxido de amônio removeu as células de forma eficaz, conforme estabelecido pela perda dos núcleos celulares e do citoesqueleto de actina. Nesta figura, as células COS-7 foram transfectadas com a tag RFP trombospondina-1. E a ECM foi visualizada antes e depois do tratamento com hidróxido de amônio.

Infere-se que os pontos fluorescentes identificados em ambas as imagens estão associados à MEC. Neste experimento, os fibroblastos dérmicos humanos foram removidos com hidróxido de amônio e a ECM foi sondada com anticorpo anticolágeno 1, que demonstrou um padrão característico de coloração fibular e de malha. Como mostrado aqui, a coloração com fibronectina foi realizada na ECM a partir de células de condrossarcoma de rato extraídas com hidróxido de amônio.

Neste exemplo, as células COS-7 de teste foram plaqueadas por duas horas em ECM estéril produzida por células RCS e analisadas quanto à organização da F-actina pela coloração FITC-Faloidina. Em comparação com as células COS-7 que produzem sua própria MEC. Neste experimento, a MEC foi isolada de células de condrossarcoma de rato e as proteínas derivadas da MEC foram então separadas por SDS-PAGE.

E as quatro bandas principais foram isoladas e analisadas por espectrometria de massas. Fibronectina, trombospondina-1 e cinco, e matrilina-1 foram identificadas. Finalmente, a MEC endógena de fibroblastos dérmicos humanos foi analisada por immunoblotting.

Fibronectina e trombospondina-1 foram detectadas, enquanto as proteínas intracelulares alfa-tubulina e beta-actina estavam ausentes. Uma vez dominada, a remoção de células com hidróxido de amônio e a extração de ECM com tampão de amostra SDS-PAGE quente de três placas de 100 milímetros podem ser feitas em uma hora se forem realizadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de fazer soluções de trabalho de hidróxido de amônio frescas a cada vez para remover as células.

Também é muito importante usar lavagens abundantes com água deionizada para garantir a remoção de todas as células. Seguindo este procedimento, métodos como a análise proteômica da ECM extraída podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como uma abundância relativa de proteínas ECM produzidas por diferentes tipos de células. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como remover células de forma eficiente de placas de cultura de células e como extrair ECM.

Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar em um exaustor e usar equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.