Name: A rápida, Método Scalable para o isolamento, estudo funcional, e Análise de matriz extracelular derivado de celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a isolar matriz extracelular de células cultivadas usando hidróxido de amônio e análise por imunofluorescência. Este método permite estudar composição molecular e funções da ECM em processos normais e doenças.

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Estamos muito gratos ao Dr. Belinda Willard, proteômica e metabolômica Laboratory, Instituto de Pesquisa Lerner, Cleveland Clinic, para realizar a análise proteômica de RCS ECM. Agradecemos o apoio financeiro da theMedical Conselho Research UK, conceder número K018043, a JCA.

1. remoção de células com Hidróxido de Amónio Solution <ol><li> Prepare células aderentes por plaqueamento na densidade adequada. NOTA: As células podem ser de qualquer tipo de células aderentes que produz ECM suficiente para análise. Aqui, nós descrevemos o uso de células COS-7, uma linha de células de macaco verde Africano rim do tipo fibroblastos, que contém sequências de ADN virais SV-40; RCS, uma linha celular de condrossarcoma de rato; ou fibroblastos normais da derme humana (HDF) cepas de prepúcio juvenil. HDF são utilizadas da passagem 1 a única passagem 8. <ol><li> Placa as células em lamelas para a imagem de células vivas e ECM, para estudos de microscopia de fluorescência de ECM fixo, ou para a preparação de ECM derivada da célula para ensaios funcionais de pequena escala. Placa as células em placas de cultura de células para análise SDS-PAGE, immunoblot ou estudos de proteómica. NOTA: As condições de cultura de células (número de células de placa e meio de cultura) vai depender do tipo de célula. O número de células de placa será necessárioser estabelecida empiricamente para a linha de células particular ou estirpe celular. </li><li> Permitir um tempo adequado para que as células se depositam ECM, tipicamente&gt; 16 h. NOTA: O período de tempo dependerá do tipo de célula e terá de ser determinada empiricamente. Se conduzir a expressão ectópica, permitir um tempo adequado para a expressão da proteína transfectadas de interesse e para a deposição de ECM. </li></ol></li><li> Em um exaustor, Prepare 20 mM de hidróxido de amónio Num recipiente adequado por diluição da solução mãe de 1/14 com deionizada H 2 O. <ol><li> Remover as células a partir do incubador e remover suavemente meio de cultura. Adicionar solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem Ca2 + / Mg2 +, vertendo suavemente contra as paredes do prato. Balance o prato duas vezes e remover o líquido com uma pipeta de plástico. Repita duas vezes mais. </li></ol></li><li> Em um exaustor, inclinar cada prato e retire o PBS a partir do passo 1.2 com uma pipeta de plástico. Adicionar 3ml de hidróxido de amónio por 100 mm de prato e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Durante o período de incubação de 5 min, agitar suavemente o prato cada min para assegurar a lise de todas as células. Passos 1,4-1,7 também irá ser realizado no exaustor. NOTA: A remoção de células alternativo reagentes incluem 2 H ou 8 M de ureia, os quais são incubadas com as células durante 10 min. </li><li> Adicionar grandes quantidades de desionizada H2O a cada prato, pelo menos, 20 ml por placa de 100 mm, com balanço. Elimine o hidróxido de amónio-solubilizado material que é composto de hidróxido de amónio, as células lisadas, e H 2 O desionizada-por aspiração com uma pipeta de transferência. Transferir esta solução resíduos em um recipiente para resíduos líquidos. </li><li> Lava-se a camada de ECM insolúvel em copiosa H desionizada 2 O mais quatro vezes para assegurar a remoção completa de todo o material de hidróxido de amónio-solubilizado. </li><li> Para o exame da ECM por imunofluorescência, corrigir o ECM por adição de 2%paraformaldeído (PFA; 3 mL por placa de 100 mm) à temperatura ambiente durante 10 min. Cuidado: PFA é muito perigoso em caso de pele ou contato com os olhos ea sobreexposição severa pode produzir danos nos pulmões, asfixia, inconsciência ou morte. Ele só deve ser tratado em um exaustor, e equipamento de protecção individual deve ser usado. </li><li> Lave cada amostra fixa duas vezes com PBS, como no passo 1.2, e descartar a solução PFA em um recipiente de resíduos líquidos adequados. Se necessário, armazenar as amostras de ECM em PBS a 4 ° C antes de os preparar para a microscopia de fluorescência. </li></ol> 2. Acompanhamento de Deposição de uma proteína ECM por microscopia confocal de imagem de células vivas <ol><li> Contar as células sob um hemocitômetro. Para as células COS-7, placa 250.000 células num prato de cultura de células de 60 mm para a transfecção. NOTA: Para imagem de células vivas, as células devem ser transfectadas com um vector que codifica a proteína da MEC de interesse, fundido em estrutura com uma fluorescência geneticamente codificadotag nt. O objectivo é permitir a identificação da proteína ECM de interesse durante a geração de imagens de células vivas. </li><li> Após um tempo adequado para a expressão de proteínas (por exemplo, 16 h) remover as células da placa com solução de tripsina-EDTA, contá-los num hemocitómetro, e a placa de ~ células 150.000 numa placa de 35 mm em grade, com fundo de vidro para imagiologia. Permitir 2 h para as células para recolocar e para começar a deposição de ECM (o período de tempo dependerá do tipo de célula e deve ser estabelecida empiricamente). NOTA: Use um meio celular que não contém vermelho de fenol, pois isso pode dar uma coloração avermelhada que afeta a qualidade da imagem. </li><li> Durante o período de 2 h acima, configurar um microscópio confocal com uma câmara incubadora a 37 ° C e um fornecimento de CO 2. Permitir que a temperatura na câmara e no prato para estabilizar a 37 ° C antes de imagem; isso pode levar até 1 h. </li><li> Incubar as células plaqueadas sobre os 35 mm prato em grade, com um marcador fluorescente de células durante 30 min. Em seguida, lavar as célulasfenol duas vezes em meio de cultura livre de vermelho antes da imagiologia. NOTA: um marcador fluorescente citoplasmático pode ser usado para visualizar os volumes de células, ou um marcador de incorporação de membrana pode ser utilizado para visualizar as bordas de células. </li><li> Usando o objectivo de 20X e de contraste de fase em um microscópio confocal, identificar um quadrado da grelha apropriada que contém um número (&gt; 3) de aderentes, as células saudáveis. Confirmar a expressão da proteína alvo de escolha nas células dentro do quadrado da grelha seleccionada, utilizando os objectivos 63X ou 100X e os comprimentos de onda apropriados sob microscopia de fluorescência. </li><li> Configurar fluorescência e de contraste de fase de imagens de lapso de tempo usando um software z-stack. Defina o &quot;começar&quot; pilha para ser apenas abaixo da camada de ECM ea pilha &quot;End&quot; para ser um pouco acima do corpo celular. Definir o tamanho Z-passo a 0,3 uM e a Z-de volume entre 5 um e 10 um de profundidade no total, dependendo do tipo de célula. Isto lhe dará entre 15-30 z-seções por ponto de tempo. </li><li> Capture fluorescência (para a proteína fluorescente vermelha (RFP), excitação = 555 nm e emissão = 584 nm) e imagens de contraste de fase periodicamente durante um período de tempo definido. Por exemplo, use o software de lapso de tempo para definir o intervalo de tempo de 2 minutos e a duração de 2 horas. Selecione o botão &quot;iniciar&quot; para começar a captura de imagens de seção z ao longo do período de tempo definido. </li><li> No final do período de tempo, remover as células do prato, tal como descrito nos passos 1,1-1,5, para confirmar a localização da proteína marcadas com fluorescência de interesse no ECM. </li><li> Use imagens de contraste de fase e o objetivo 20X para realocar o quadrado da grelha relevante. </li><li> Mudar para o objetivo 63X e identificar a camada ECM sob microscopia de fluorescência. Compare esta imagem com a imagem de pré-extracção </li></ol> 3. Preparação estéril de ECM derivados de celular para celular ensaios funcionais <ol><li> Cresça uma população de células (as células &quot;produtores Matrix&quot;) em lamelas e outra popumento (o &quot;teste&quot;) em cultura de células padrão em um prato de cultura de células de 100 milímetros durante pelo menos 24 h. NOTA: Estes podem ser quaisquer dois tipos de células aderentes diferentes, eo delineamento experimental pode incluir a transfecção de populações um ou ambos os celulares para expressar uma proteína ECM fluorescente-marcadas. </li><li> Em uma câmara de fluxo laminar, tal como utilizado para a cultura de células, preparação de soluções estéreis de PBS sem Ca2 + / Mg2 +, hidróxido de amónio 20 mM (ver passo 1.3), e desionizada H 2 O, passando cada um através de um filtro estéril de 0,2 uM filtro para um recipiente esterilizado apropriado. </li><li> Manutenção técnica estéril, lavar cuidadosamente as células &quot;de produtores de matriz&quot; em lamelas três vezes com PBS estéril (veja o passo 1.2). </li><li> Remover o PBS por aspiração com uma pipeta estéril e eliminá-lo em um recipiente de resíduos líquidos adequados. Adicionar 20 mM de hidróxido de amónio estéril (3 mL / prato de 100 milímetros) e incubar durante 5 minutos com agitação em intervalos. </li><li> Adicionar quantidades copiosasde estéril H de-ionizada 2 O para o prato &quot;produtor de matriz&quot;, pelo menos 20 ml por placa de 100 mm, com balanço e deitar fora o lisado celular em um recipiente de resíduos adequado. </li><li> Repetir o passo 3.5 por mais quatro vezes para assegurar a remoção completa do material de hidróxido de amónio-solubilizado. NOTA: O ECM depositados pelas células &quot;de produtores de matriz&quot; sobre as lamelas em seguida, fornece uma ECM estéril para ensaios funcionais com quaisquer células de teste de interesse. </li><li> Incubar as células de teste a partir da reserva de células prato com 1,5 mL de solução de tripsina-EDTA por placa de 100 mm (0,05% w / v de tripsina e 0,02% w / v de EDTA em solução salina equilibrada de Hank), até que as células de teste são separadas do prato . Adicionar meio de células, as células de teste centrifugar a 400 xg durante 5 min, e remover o líquido sobrenadante. </li><li> Volte a suspender as células de teste em meio fresco, estéril e contá-los em um hemocitômetro. Placa de um número adequado dessas células de teste para a estéril ECM, isolado no coverslips. Cultura-los no meio celular apropriado durante 2-3 h, ou durante o período de tempo necessário para a concepção experimental. </li><li> Para examinar a organização do citoesqueleto de actina, fixar as células de ensaio em 2% de PFA e manchar os com isotiocianato de fluoresceína (FITC) -phalloidin (excitação = 490 nm e emissão = 525 nm) para visualizar F-actina e com 4 &#39;, 6 -diamidino-2-fenilindole (DAPI; excitação = 358 nm e emissão = 461 nm) para visualizar os núcleos 11. NOTA: Comparar a morfologia e organização da actina nas células de teste semeadas em ECM derivada da célula heteróloga com células de teste banhado em seu próprio ECM. </li></ol> 4. Isolamento de ECM para SDS-PAGE, Análise de imunotransferência, ou Proteomics <ol><li> Crescer as células aderentes de interesse em placas de 100 mm de cultura de células (5 a 10 pratos para proteómica ou 1-2 pratos para imunoblotting) por 24-96 h, conforme apropriado para o tipo de célula, e para permitir a secreção de deposição de ECM. </li><li> Remover as células como described em passos 1,1-1,5. </li><li> Inclinação cada placa em um ângulo para drenar residual H 2 O para a parte inferior do prato, e cuidadosamente remover qualquer remanescente H 2 O com uma pipeta de P200 até que a placa está completamente seco. </li><li> Em paralelo, o tampão de amostra de SDS-PAGE de calor contendo ditiotreitol 100 mM (DTT) a 95 ° C durante 2 min, utilizando um bloco de aquecimento, e em seguida adicioná-lo à placa. 200 ul de tampão de amostra por cada placa de 100 mm são adequados para as amostras a serem examinadas por imunotransferência. <ol><li> Para analisar ECM por espectrometria de massa, obter uma amostra mais concentrada recolhendo o tampão de amostra de SDS-PAGE do prato (como descrito nas etapas 4.5 e 4.6, abaixo), re aquecendo-lo a 95 ° C, e utilizando a mesma aliquota através 2-3 placas adicionais. </li></ol></li><li> Use um raspador de células para raspar completamente o ECM fora do prato, garantindo que todas as áreas do prato foram raspados. </li><li> Com o raspador de células, recolher a amostra de um lado do prato e removê-lo com um 200mL ponta da pipeta em um tubo. </li><li> Transferir todo o SDS-PAGE de extracto de tampão de amostra residual da ponta do raspador de células para dentro do tubo para minimizar a perda de material de ECM. Para uma amostra concentrada, re-aquecer o mesmo SDS-PAGE tampão de amostra alíquota para 95 ° C e re usar-lo em toda 2-3 placas adicionais. </li><li> Resolver as proteínas da MEC por SDS-PAGE a 12, usando 7% ou 4-7% de gel de poliacrilamida de gradiente. NOTA: É conveniente usar marcadores de proteína pré-manchados. </li><li> Para aumentar a resolução das proteínas da MEC elevado peso molecular, prolongar o tempo de gel de funcionamento de tal modo que o marcador de peso molecular de 37 kDa é executado perto do fundo do gel e marcadores de peso molecular &lt;37 kDa ter executado fora do gel. </li><li> Para análise proteômica das proteínas da MEC, manchar o gel com uma mancha de proteína e capturar uma imagem. Cortar bandas de interesse a partir do gel, os digerir com tripsina, e analisá-las por dessorção de laser assistida pela matriz / ionização (MALDI) Espectrometria de -massa &lt;sup&gt; 13. </li><li> Alternativamente, para uma análise mais abrangente do extrato ECM e analisar toda a amostra, cortar a faixa de gel em seções, digeri-los com tripsina, e realizar a espectrometria de cromatografia de massa líquida (LC-MS) 14. </li><li> Alternativamente, por imunotransf erência 15, a transferência de proteínas do gel de SDS-PAGE em fluoreto de vinilideno (PVDF) da membrana de polivinilideno a 15 V durante pelo menos 1 h 10 min (método semi-seca) para assegurar a transferência das proteínas da MEC elevado peso molecular . Visualizar a proteína total transferido para a membrana com Ponceau S a uma mancha. </li><li> A seguir ao passo 4.11, utilizar anticorpos para determinar a presença e / ou fazer uma análise semi-quantitativa das proteínas da MEC individuais 15. <ol><li> Bloquear a membrana com 2% (w / v) de leite em TBS-Tween 20 (tampão de bloqueio) durante a noite a 4 ° C. Dilui-se anticorpos específicos para proteínas de ECM em tampão de bloqueio e incubar com a membrana durante 1,5 h à temperatura ambiente (anticorpo de fibronectin diluída 1/600 e anticorpo para trombospondina-1 diluída 1/150; Tabela Suplementar 1). </li><li> Testar a qualidade do isolamento ECM por re-sondagem da mesma mancha com anticorpos contra proteínas intracelulares abundantes, tais como actina ou tubulina (anti-actina diluído a 1 / 10.000 e anti-tubulina diluído a 1 / 5.000). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodelling+the+extracellular+matrix+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Remodelling the extracellular matrix in development and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 786-801 (2014).</li>
<li>Hynes, R. O., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+matrisome--an+inventory+of+extracellular+matrix+constituents+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a004903(2012).</li>
<li>Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+Collagen+from+Connective+Tissue+by+Neutral+Salt+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Extraction of Collagen from Connective Tissue by Neutral Salt Solutions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 41, 1-7 (1955).</li>
<li>Hellewell, A. L., Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insider+trading%3A+Extracellular+matrix+proteins+and+their+non-canonical+intracellular+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Insider trading: Extracellular matrix proteins and their non-canonical intracellular roles.</a> Bioessays. 38, 77-88 (2016).</li>
<li>Li, D., Yang, W., Li, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+native+collagen+from+limed+bovine+split+wastes+through+improved+pretreatment+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Technology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extraction of native collagen from limed bovine split wastes through improved pretreatment methods.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83, 1041-1048 (2008).</li>
<li>Strawich, E., Nimni, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+a+collagen+molecule+containing+three+identical+components+extracted+from+bovine+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Properties of a collagen molecule containing three identical components extracted from bovine articular cartilage.</a> Biochemistry. 10, 3905-3911 (1971).</li>
<li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+collagen+isolated+from+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Human collagen isolated from adipose tissue.</a> Biotechnol Prog. 28, 973-980 (2012).</li>
<li>Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Domenech, N., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequential+extraction+methodology+for+cardiac+extracellular+matrix+prior+to+proteomics+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis.</a> Methods Mol Biol. 1005, 215-223 (2013).</li>
<li>Carter, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation-dependent+alterations+is+glycoproteins+of+extracellular+matrix+of+human+fibroblasts.+Characterization+of+GP250+and+the+collagen-like+GP140%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transformation-dependent alterations is glycoproteins of extracellular matrix of human fibroblasts. Characterization of GP250 and the collagen-like GP140.</a> J Biol Chem. 257, 13805-13815 (1982).</li>
<li>Sechler, J. L., Takada, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+rate+of+fibronectin+matrix+assembly+by+deletion+of+the+first+type+III+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Altered rate of fibronectin matrix assembly by deletion of the first type III repeats.</a> J Cell Biol. 134, 573-583 (1996).</li>
<li>Adams, J. C., Bentley, A. A., Kvansakul, M., Hatherley, D., Hohenester, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+retention+of+thrombospondin+1+is+controlled+by+its+conserved+C-terminal+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix retention of thrombospondin 1 is controlled by its conserved C-terminal region.</a> J Cell Sci. 121, 784-795 (2008).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Hillenkamp, F., Karas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+peptides+and+proteins+by+matrix-assisted+ultraviolet+laser+desorption%2Fionization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of peptides and proteins by matrix-assisted ultraviolet laser desorption/ionization.</a> Methods Enzymol. 193, 280-295 (1990).</li>
<li>Davis, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+LC-LC-MS-MS+platform+using+binary+ion-exchange+and+gradient+reversed-phase+chromatography+for+improved+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Automated LC-LC-MS-MS platform using binary ion-exchange and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 752, 281-291 (2001).</li>
<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BWestern+blotting%26%2334%3B%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">&#34;Western blotting&#34;: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Soucy, P. A., Werbin, J., Heinz, W., Hoh, J. H., Romer, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelastic+properties+of+lung+cell-derived+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Microelastic properties of lung cell-derived extracellular matrix.</a> Acta Biomater. 7, 96-105 (2011).</li>
<li>Hellewell, A. L., Gong, X., Scharich, K., Christofidou, E. D., Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+extracellular+matrix+patterning+of+thrombospondins+by+actin+dynamics+and+thrombospondin+oligomer+state%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Modulation of the extracellular matrix patterning of thrombospondins by actin dynamics and thrombospondin oligomer state.</a> Biosci Rep. 35, (2015).</li>
<li>Mumby, S. M., Abbott-Brown, D., Raugi, G. J., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+thrombospondin+secretion+by+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of thrombospondin secretion by cells in culture.</a> J Cell Physiol. 120, 280-288 (1984).</li>
<li>Myllyharju, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+and+developing+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Osteoporos+Rep%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix and developing growth plate.</a> Curr Osteoporos Rep. 12, 439-445 (2014).</li>
<li>Roughley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Articular+cartilage+and+changes+in+arthritis%3A+noncollagenous+proteins+and+proteoglycans+in+the+extracellular+matrix+of+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res%22%5BJournal%5D)">Articular cartilage and changes in arthritis: noncollagenous proteins and proteoglycans in the extracellular matrix of cartilage.</a> Arthritis Res. 3, 342-347 (2001).</li>
<li>Naba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+matrisome%3A+in+silico+definition+and+in+vivo+characterization+by+proteomics+of+normal+and+tumor+extracellular+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The matrisome: in silico definition and in vivo characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices.</a> Mol Cell Proteomics. 11, M111 014647(2012).</li>
<li>Sanchez, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+human+heart+matrix%3A+A+critical+step+toward+whole+heart+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts.</a> Biomaterials. 61, 279-289 (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Passos críticos dentro do Protocolo O método tem alguns passos críticos que devem ser seguidas para garantir o isolamento bem sucedido e análise de ECM. Por exemplo, o hidróxido de amónio for utilizado para remover as células e para isolar ECM para análise. Apesar de hidróxido de amónio é estável em soluções aquosas no escuro e pode ser armazenada à temperatura ambiente, as garrafas devem ser firmemente re-selado entre cada utilização. Como o gás pode evaporar-se a partir da solução, diminuindo assim a concentração, é altamente recomendável iniciar uma garrafa fresca a cada 6-8 semanas. Além disso, a solução de trabalho deve ser feito de fresco para cada experiência. É também essencial que as células são totalmente removida com lavagens copiosas de água desionizada. Se essas etapas não são executadas de forma adequada, o material celular pode permanecer no prato e contaminar análises a jusante. Se as células foram cultivadas durante 10 dias ou mais, podem ser necessárias as lavagens adicionais de água. É importante nota que a camada de ECM isolado é tipicamente muito fino em comparação com as células 11, de modo que é necessário cuidado quando identificando o ECM durante a imagem. Para a extracção eficaz do ECM isolado em tampão de amostra de SDS-PAGE, é essencial que o tampão de amostra contém um agente de redução. Para a remoção mais eficaz do ECM, fervendo-quente tampão de amostra deve ser usado. Para as experiências em que amostras da MEC vai ser resolvidos por electroforese em SDS-PAGE para coloração de proteína ou proteómica, é crítico para conseguir uma amostra concentrada por raspagem várias placas-vale de ECM na mesma aliquota de tampão de amostra. Modificações e resolução de problemas A produção e a secreção de proteínas da MEC pode variar significativamente entre os tipos de células, de modo que os períodos de tempo para a secreção e a deposição de ECM deve ser determinado de novo para cada tipo de célula. Também é importante estar ciente de que a composição ECM irá alterar dinamicamente em relação to densidade celular e tempo em cultura 18. Este factor deve ser tido em conta na concepção de experiências. Claramente, a selecção de um tipo de célula para este método é importante, particularmente quando se extrai o ECM para análise por espectrometria de massa, que pode necessitar de uma quantidade substancial de proteína total ECM. Limitações da técnica As células que segregam níveis muito baixos de proteínas da MEC vai ser mais difícil para utilização com este método. As células não aderentes, as culturas de células em 3D, ou ensaios de invasão de células são inadequados actualmente para o isolamento de ECM por este método. O método é mais adequado para uso com culturas de células &quot;2-dimensional&quot; padrão. Uma vez que a extracção de hidróxido de amónio remove as células completamente, ECM associados com os lados superiores das células e segregadas, mas não reticulados, proteínas de ECM são também removidos, deixando no prato de uma camada fina de ECM montado a partir de baixo e em torno das bases das células 11,17 </sup&gt;. É difícil de quantificar a quantidade de ECM é libertado pela extracção de hidróxido de amónio, porque o material libertado também inclui proteínas de ECM que são intracelulares, quer antes ou após a secreção de absorção da superfície da célula. Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos A capacidade de realizar uma vasta gama de experiências com ECM isolado é importante no contexto da biologia celular e fisiologia do tecido, e também tem implicações para os campos da regeneração de tecidos e a engenharia de tecidos. O método tem vantagens sobre os géis formados a partir de colagénios purificados ou outras proteínas de ECM purificados em que as células montar estruturas ECM complexos na sua dimensão nativa, com mecanismos de reticulação nativas e com as proteínas de ECM individuais presentes em proporções adequadas para o tipo de célula de origem. Por exemplo, o estudo de proteômica de RCS ECM demonstrado matrilins abundantes e COMP / TSP5, como esperado paraum ECM cartilaginoso 19,20 (Figura 4). Em geral, a análise de ECM derivada de células é dificultada pela sua natureza de uma extensa rede de multi-proteínas, que resulta em reticulação covalente e a insolubilidade das muitas proteínas da MEC, e também por o potencial de contaminação dos extrai o ECM com as proteínas intracelulares. Um processo multi-passo concebido para isolar a fracção de ECM de tecidos para análise proteomic rendeu 8% de proteínas da MEC no conjunto total de proteínas identificadas 21. No entanto, os péptidos de proteínas de ECM foi de 73% do total de péptidos identificados. Este método para o isolamento e análise de ECM derivada de células rapidamente e com fiabilidade remove material celular mantendo proteínas da MEC. Este método pode ser usado para uma variedade de tipos de células e aplicações a jusante e facilita a análise de biologia ECM e célula-ECM interacções em cultura de células. Os nossos protocolos detalhe como o método pode ser aplicado em diferentes escalas para tratar uma vasta gama de expperguntas erimental no que respeita à organização ECM, dinâmica, ou composição, e os efeitos funcionais de ECM isolado nas células. Aplicações futuras ou chegar depois de dominar esta técnica Olhando para o futuro, o método poderia ser adaptado para uso com culturas de células em 3D; isso iria expandir a sua relevância fisiológica. Tecido descelularizado nativa tem um grande potencial como um andaime para a regeneração do tecido perdido ou danificado e, como uma alternativa ao transplante, tais como insuficiência cardíaca após 22. Tem o potencial para ultrapassar os problemas de disponibilidade de doador e immunorejection. As aplicações futuras do método descrito neste relatório pode investigar a sua utilização com culturas de células ou em 3D descelularização de tecidos, que iria aumentar ainda mais o âmbito desta abordagem.

Ao longo das últimas décadas, a matriz extracelular (ECM) tornou-se reconhecido como um ambiente diverso, dinâmico e complexo que está envolvido em processos celulares fisiológicos e patológicos múltiplos. Ao nível do tecido, o ECM influencia a sinalização celular, motilidade, diferenciação, angiogénese, biologia das células estaminais, tumorigénese, fibrose, etc. 1,2. O estudo da organização da ECM e processos dependentes de ECM, portanto, tem vastas implicações para a biologia celular e fisiologia do tecido. Para chegar a um entendimento mecanicista da composição ECM, organização e propriedades funcionais, os métodos para o isolamento precisa da ECM são obrigatórios. Considerando a primeira identificação de proteínas ECM invocados isolamento a partir de tecidos 3, a preparação de ECM a partir de células cultivadas tornou-se mais prevalente. O isolamento e análise de ECM derivada de células é complicada por duas razões principais. Em primeiro lugar, a presença de células e oproteínas intracelulares abundantes IR pode torná-la difícil de isolar o ECM como uma estrutura extracelular discreta. De facto, algumas proteínas de ECM têm um papel no interior da célula, bem como na MEC 4; Portanto, a remoção eficiente de proteínas intracelulares a partir de ECM derivada de células é vital para que o estudo de proteínas da ECM não deve ser confundido com o seu papel no interior da célula. Em segundo lugar, o ECM derivada de células é composto por muitas proteínas oligoméricas, grandes, que são frequentemente covalentemente reticulado quando da montagem do ECM e que são, portanto insolúvel em detergentes convencionais. Estas propriedades podem complicar a extração ea análise mais aprofundada da ECM. Para resolver estes problemas, é necessário um método que permita a separação eficiente de proteínas de ECM de componentes celulares. Vários métodos foram descritos na literatura para o isolamento de ECM a partir de qualquer cultura de células ou extractos de tecido. Muitos destes métodos são destinadas à extracção do PR ECM abundanteotein, o colagénio, a partir de tecidos e incluem a utilização de sais neutros, 3 5,6 condições ácidas, ou pepsina 7. Isolamento de ECM totais a partir de extractos de tecidos envolve frequentemente descelularização do tecido antes do isolamento do ECM. Por exemplo, um método de extracção sequencial tem sido descrito que isola ECM a partir de tecido cardíaco humano 8. Em primeiro lugar, as proteínas de ECM frouxamente ligados foram extraiu-se com NaCl 0,5 M antes de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) foi utilizado para remover as células. Finalmente, as proteínas da MEC restantes foram extraídas com 4 M guanidina 8. ECM também podem ser solubilizados a partir de amostras descelularizados utilizando 8 M de ureia 9. Outras técnicas utilizam detergentes, tais como ácido desoxicólico 10, para extrair ambas as células e ECM antes de separar as proteínas da MEC insolúveis a partir do lisado celular por centrifugação solúvel. O método para o isolamento e análise de ECM derivada de células descrito neste relatório proporciona uma Reproducible método para a remoção de material celular, deixando ECM derivada de células que podem ser analisados por imunofluorescência em situ ou extraído para análise bioquímica. Este método pode ser adaptado para qualquer tipo de células aderentes e podem ser ampliados para os procedimentos a jusante, tais como o immunoblotting, ou espectrometria de massa, ou para a utilização do ECM isolado em estudos funcionais. O método também pode ser usado em conjunto com microscopia confocal de células vivas para controlar a deposição de ECM de uma proteína marcadas de interesse em tempo real. Isto é conseguido através da utilização de um prato em grade, com fundo de vidro. No geral, a abordagem fornece um isolamento precisa da ECM derivado de células e também o escopo de identificar e monitorar a deposição e dinâmica de proteínas ECM individuais.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo para COL1A1</td><td>Novus</td><td>NB600-408</td><td>Coelho policlonal. Reage com outros colágenos fibrilares, bem como colágeno I. IF: 1/200</td></tr><tr><td>Anticorpo para fibronectina</td><td>Sigma</td><td>F3648</td><td>Coelho policlonal. WB: 1/600 para 1,5 h. IF: 1/200</td></tr><tr><td>Anticorpo para trombospondina 1</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>MA5-13398</td><td>Clone monoclonal de camundongo A6.1. WB: 1/150 para 1,5 h</td></tr><tr><td>Anticorpo para RFP</td><td>Abcam</td><td>ab62341</td><td>Coelho policlonal. WB: 1/2.000 por 2 h</td></tr><tr><td>Anticorpo para &beta;-actina</td><td>Sigma</td><td>A1978</td><td>Clone monoclonal de camundongo AC-15. WB: 1/10.000 por 1,5 h</td></tr><tr><td>Anticorpo para &alfa;-tubulina</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>Clone monoclonal de camundongo DM1A. WB: 1/5.000 para Cell Tracker de 1,5 h</td></tr><tr><td>Verde</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>C2925</td><td>Marcador de célula fluorescente. Use em 1 &micro; M para 30 min</td></tr><tr><td>Isotiocianato de fluoresceína (FITC)-Faloidina</td><td>Sigma</td><td>P-5282</td><td>Stock = 50 mg/mL em DMSO. 1/50 por 45 min</td></tr><tr><td>IgG anti-rato de cabra conjugado com FITC Sigma</td><td></td><td>F8771</td><td>IF: 1/50 por 1 h</td></tr><tr><td>IgG de ovelha conjugada com FITC IgG</td><td>SIgma</td><td>F7512</td><td>IF: 1/50 por 1 h</td></tr><tr>IgG <td>LI-COR</td><td>926-80010</td> de<td>cabra conjugada com peroxidase de rábano (HRP)</td><td>WB: 1/50.000 para 1 h</td></tr><tr><td>HRP-conjugado cabra anti-coelho IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-80011</td><td>WB: 1/100.000 para 1 h</td></tr><tr><td>Vectorshield meio de montagem com DAPI</td><td>Vector</td><td>H-1200</td><td>Armazenar em 4 &deg; C no escuro</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma</td><td></td><td>D6429</td><td>Aqueça antes do uso</td></tr><tr><td>Meio de crescimento de fibroblastos</td><td>PromoCell</td><td>C-23010</td><td>Aqueça antes de usar, suplemento com 50 &micro; g/mL de ácido ascórbico</td></tr><tr><td>Sem fenol sem vermelho DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>21063-029</td><td>Quente antes</td></tr><tr><td>de usar Solução de tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Quente antes de usar</td></tr><tr><td>Prato grelhado com fundo de vidro</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-C-GRID</td><td></td></tr><tr><td>NH4OH, solução a 28-30%</td><td>Sigma</td><td>221228</td><td>Diluir a 20 mM em água desionizada. Uma vez aberta, loja no escuro, bem tampada.</td></tr><tr><td>Paraformaldeído, solução a 16%</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td>Diluir a 2% (v/v) em PBS</td></tr><tr><td>Ácido desoxicólico</td><td>Sigma</td><td>D2510</td><td>Usar a 2% (v/v) de concentração final</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Diluir a 0,5% (v/v) de concentração final</td></tr><tr><td>Reagente de coloração GelCode Blue</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>24590</td><td>Mancha de proteína para géis SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Padrões de proteína Precision Plus</td><td>Biorad</td><td>161-0374</td><td>Padrões de proteína para géis SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Célula de transferência semi-seca</td><td>Biorad</td><td>1703940</td><td>Transferência eficiente de proteínas de alto peso molecular</td></tr><tr><td>Membrana de transferência PVDF</td><td>Millipore</td><td>ISEQ00010</td><td>Immobilon-PSQ&nbsp;</td></tr><tr><td>Coloração Ponceau S Sigma</td><td></td><td>P7170</td><td>Coloração reversível de proteína para membrana de PVDF</td></tr><tr><td>WesternSure Substrato de quimioluminescência aprimorada (ECL)</td><td>LI-COR</td><td>926-80200</td><td></td></tr><tr><td>Filme de quimioluminescência de alto desempenho</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de filtração estéril, MILLEX-GV</td><td>Millipore</td><td>ML481051</td><td></td></tr><tr><td>SP8 Varredura a laser confocal AOBS microscópio</td><td>Leica</td><td></td><td>Câmara ambiental necessária para controle de temperatura e CO2 (Life Imaging Services)</td></tr><tr><td colspan="4">Key: IF, Imunofluorescência; WB, Western Blot</td></tr></tbody></table>

a rápida, método scalable para o isolamento, estudo funcional, e análise de matriz extracelular derivado de celular

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

A matriz extracelular (MEC) é reconhecida como um ambiente diverso, dinâmico e complexo que está envolvido em múltiplos processos fisiológicos e patológicos celulares. No entanto, o isolamento da MEC, a partir de tecidos ou cultura de células, é complicado pela natureza insolúvel e reticulada da MEC montada e pela potencial contaminação dos extratos da MEC com proteínas de superfície celular e intracelulares. Aqui, descrevemos um método para uso com células cultivadas que remove células de forma rápida e confiável para isolar um ECM derivado de células para experimentação a jusante.
Com o uso deste método, a ECM isolada e seus componentes podem ser visualizados por microscopia de imunofluorescência in situ. A dinâmica de proteínas específicas da ECM pode ser rastreada rastreando a deposição de uma proteína marcada usando microscopia de fluorescência, antes e depois da remoção das células. Alternativamente, a ECM isolada pode ser extraída para análise bioquímica, como eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e immunoblotting. Em escalas maiores, uma análise proteômica completa da ECM isolada por espectrometria de massa pode ser realizada. Ao realizar o isolamento da MEC em condições estéreis, camadas estéreis de MEC podem ser obtidas para estudos funcionais ou fenotípicos com qualquer célula de interesse. O método pode ser aplicado a qualquer tipo de célula aderente, é relativamente fácil de executar e pode ser vinculado a um amplo repertório de projetos experimentais.

O protocolo descrito nos passos 1,1-1,5 atos para remover as células e deixar para trás a ECM derivada da célula. O protocolo foi realizado em células COS-7 cultivadas durante 96 h em lamelas de vidro, e o ECM derivada de células foi analisada por microscopia de fluorescência. O tratamento com hidróxido de amónio removidos de forma eficaz as células, tal como estabelecido pela perda dos núcleos das células e do citoesqueleto de actina, de acordo com DAPI e coloração com faloidina, respectivamente (Figura 1). A extracção das células com 2 M de ureia não era tão eficaz como o hidróxido de amónio; vestígios de DAPI e coloração faloidina foram detectados após o tratamento. 8 M de ureia teve um efeito semelhante ao de hidróxido de amónio (Figura 1). Em seguida, o ECM derivada de células foi visualizado antes e após o tratamento com hidróxido de amónio (passos 2,1-2,11). Células COS-7 foram transfectadas com uma proteína fluorescente vermelha monomérica (MRFP) tagged trímero trombospondina-1 C-terminal, (mRFPovTSP1C) 11 e cultivadas em um prato de 35 mm, com uma base de vidro em grade. Duas horas após a galvanização, um quadrado da grelha adequada que continham células saudáveis ​​vários expressando mRFPovTSP1C foi visualizado sob um microscópio confocal. Uma imagem de contraste de fase de referência foi feita desta área, e, em seguida, imagens de fluorescência de lapso de tempo foi realizada a cada 1 min para 2 h (Figura 2A). As células foram, em seguida, removido utilizando hidróxido de amónio, e o mesmo quadrado da grelha sobre o prato foi transferido sob contraste de fase e, em seguida, re-analisadas por microscopia de fluorescência. As células não eram mais presente no quadrado da grelha, mas mRFPovTSP1C permaneceu dentro do ECM, detectadas por microscopia de fluorescência como pontos lacrimais característica (Figura 2A). Qualquer mRFPovTSP1C depositado na ECM antes da remoção de células foi identificado por comparação do padrão de fluorescência pré e pós-remoção de células. O ponto lacrimal fluorescente identificada em ambas as imagens (Figure 2A, exemplo seta) são inferidos a ser associada com o ECM. tratamento com hidróxido de amónio foi então usado para isolar o ECM nativa a partir de células cultivadas, aderentes. fibroblastos dérmicos humanos (HDF) foram cultivadas em lamelas de vidro durante 96 h. As células foram removidas utilizando hidróxido de amónio, e o ECM foi sondada com um anticorpo anti-colagénio I, que demonstraram uma fibrilar e coloração malha padrão característico 16 (Figura 2B). A fibronectina foi examinada a padronização, em torno de células não-permeabilizadas fixadas de condrossarcoma de rato (RCS) e dentro do ECM após a remoção das células de RCS (Figura 2C). O isolamento de hidróxido de amónio de ECM foi também levada a cabo sob condições estéreis de modo a que as células de &quot;teste&quot; poderia ser re-plaqueadas em ECM para fenotípica ou estudos funcionais. Por exemplo, &quot;test&quot; células COS-7 foram plaqueadas durante 2 horas para ECM estéril produzido por células de RCS, e tgalinha que foram fixadas, permeabilizadas, e analisados para a organização de actina F por coloração com faloidina-FITC, em comparação com células COS-7 que produzem o seu próprio ECM (passos 3,1-3,9) (Figura 3). Numa escala maior, o método foi utilizado para isolar por procedimentos bioquímicos ECM. Por exemplo, as células RCS foram cultivadas em duas placas de cultura de células de 100 mm, durante 7 dias, e os procedimentos em etapas 4,1-4,7 foram seguidos. As proteínas da MEC derivada de células foram recolhidas por raspagem-los em tampão de amostra de SDS-PAGE a quente e foram separadas por SDS-PAGE num gel de poliacrilamida a 7% sob condições redutoras. O gel foi corado para a proteína, e as quatro bandas principais foram cada isolado e analisado por espectrometria de massa (Figura 4A). Um certo número de proteínas de ECM, incluindo fibronectina, trombospondina 1 (TSP1), trombospondina proteína 5 / cartilagem oligomérico matriz (TSP5 / COMP), e matrilin-1 foram identificados (Figura 4B). Em alternativa, preparações de pequena escala de ECM pode ser avaliada por imunocolorações. Por exemplo, o ECM derivada de células a partir de células COS-7 que expressam ectopicamente mRFPovTSP1C foi separada por SDS-PAGE, transferidas para uma membrana de PVDF e sondadas quanto a RFP com um anticorpo anti-RFP (Figura 4C). Esta técnica é sensível o bastante para detectar diferenças na deposição de entre um trímero nativa de TSP1 (mRFPovTSP1C) e uma Engineered pentâmero da região C-terminal de TSP1 (MRFP-TSP-5-1C) 17 (Figura 4C). Para investigar o ECM endógena de HDF, a presença de proteínas específicas no lisado celular ou a ECM isolado foi analisado por imunotransf erência. A característica de proteínas de ECM fibronectina e trombospondina-1 foi detectado na matriz extracelular, enquanto que os abundantes proteínas intracelulares α-tubulina e β-actina estavam ausentes da ECM isolado (Figura 4D). Figura 1: Comparação de métodos de remoção de celular. células COS-7 foram crescidas a uma densidade elevada durante 96 h, em lamelas fixados em 2% de PFA, e permeabilizadas em Triton X100 a 0,5%, ou foram tratadas como indicado para a remoção de células. As lamelas foram depois coradas com FITC-faloidina para visualizar a F-actina e DAPI para visualizar núcleos. Barra de escala = 25 um. Este valor é modificado de uma publicação original no Journal of Cell Science 11. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55051/55051fig2.jpg" /> Figura 2: Identificação de ECM proteínas no Isolated ECM. (A) de contraste de fase e fluorescência imagens decélulas COS-7 que expressam mRFPovTSP1C e cultivadas em um prato de 35 mm, com, uma base em grelha com fundo de vidro durante 2 h. As imagens são mostradas antes e após a remoção das células por hidróxido de amónio. A aresta da carta de grade é indicado nas imagens de contraste de fase com uma linha pontilhada. setas brancas indicam exemplos de puncta fluorescente que estavam presentes antes e depois da remoção das células. (B) Detecção de colágeno I em HDF ECM por imunofluorescência indireta. HDF foram cultivadas durante 96 h, e removido com hidróxido de amónio, e o ECM foi corado para I. colagénio fibrilar humano O ECM também foi corado com o anticorpo secundário anti-coelho conjugado com FITC sozinho. (C) A localização de fibronectina em torno de células RCS ou dentro isolado RCS ECM, tal como detectado por imunofluorescência indirecta. células RCS foram cultivadas durante 48 h, fixadas em 2% de PFA, e coradas para a fibronectina e com DAPI. Em pratos paralelos, as células foram removidas com hidróxido de amónio a 20 mM e o ECM foi corado para FIBRonectin e com DAPI. As células foram também coradas com FITC-conjugado anti-IgG de rato anticorpo sozinho. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55051/55051fig3.jpg" /> Figura 3: O uso de estéril ECM para estudos funcionais. &quot;matriz&quot; de produtores células RCS foram cultivadas durante 48 h em lamelas de vidro e, em seguida, tratada com hidróxido de amónio a 20 mM sob condições estéreis para remover as células. Células COS-7 &quot;de teste&quot; foram plaqueadas em lamelas com ou sem isolado RCS ECM durante 2 h, fixadas em 2% de PFA, permeabilizadas em 0,5% de Triton X100, e coradas com FITC-faloidina para visualizar a F-actina e DAPI para visualizar núcleos . COS-7 células semeadas em RCS ECM espalhar mais amplamente e formaram grandes feixes microfilamentosas (exemplo seta) e Ruff bordales. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55051/55051fig4.jpg" /> Figura 4: Identificação de proteínas de ECM isolada por SDS-PAGE, espectrometria de massa, ou imunotransferência. Células de RCS (A) foram cultivadas durante 7 dias e removido com hidróxido de amónio a 20 mM; o ECM foi raspada para cima em tampão de amostra de SDS-PAGE quente contendo DTT 100 mM. A preparação de ECM foi separada por SDS-PAGE num gel de poliacrilamida a 7% sob condições redutoras. Quatro bandas significativas (setas 1-4) foram identificados por coloração da proteína. (B) As proteínas de ECM RCS faixas 1-4 foram identificados por espectrometria de massa MALDI. (C) células COS-7 que expressam quer mRFPovTSP1C (trímero) ou MRFP-TSP-5-1C (pentâmero) foram cultivadas durante 48h e removido com hidróxido de amónio a 20 mM, e o ECM foi isolado em tampão de amostra de SDS-PAGE a quente contendo DTT 100 mM. A preparação de ECM foi separada por SDS-PAGE num gel de poliacrilamida a 7% sob condições redutoras, transferidos para uma membrana de PVDF e sondadas com um anticorpo anti-RFP. Este painel é modificado de uma publicação original em Bioscience Reports 17. (D) de HDF foram cultivadas durante 96 h e, em seguida, tratados com ácido desoxicólico a 2% em PBS (ligado celular) ou com hidróxido de amónio a 20 mM para remover as células. O ECM foi raspadas para tampão de amostra SDS-PAGE quente. As duas fracções foram separadas por SDS-PAGE num gel de poliacrilamida a 10% sob condições redutoras, transferidos para uma membrana de PVDF e sondado com anticorpos, tal como indicado. Em cada painel, as posições dos marcadores de peso molecular são indicados em kDa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta fi</a>gura.

A matriz extracelular desempenha um papel importante na definição do microambiente das células e na modulação do comportamento e fenótipo celular. Descrevemos um método rápido para o isolamento de matriz extracelular derivada de células, que pode ser adaptado a diferentes escalas para estudos microscópicos, bioquímicos, proteômicos ou funcionais.

A rápida, Método Scalable para o isolamento, estudo funcional, e Análise de matriz extracelular derivado de celular

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar a matriz extracelular de células cultivadas para uma ampla variedade de experimentos a jusante, para ajudar a entender as funções e propriedades da matriz extracelular em tecidos normais e processos de doenças. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da matriz extracelular, como a organização, composição molecular, interações proteicas ou propriedades funcionais da matriz extracelular. Além disso, a matriz extracelular pode ser preparada a partir de qualquer tipo de célula aderente.A principal vantagem dessa técnica é que elas podem ser realizadas em diferentes escalas para remover células com eficiência e reter proteínas da matriz extracelular. Demonstrando o procedimento estarão Silvia Rosini, uma estudante de pós-graduação em meu laboratório, e Andrew Hellewell, um pesquisador de pós-doutorado. Para começar, células de placa em lamínulas para a imagem de células vivas e matriz extracelular ou ECM.Para estudos de microscopia de florescência, um ECM fixo. Ou para preparação de ECM derivada de células para estudos funcionais de pequena escala. Incube as células a uma temperatura e umidade adequadas por um tempo adequado para que as células depositem a ECM.Normalmente superior a 16 horas. Em um exaustor, prepare hidróxido de amônio 20 milimolar em um recipiente adequado usando água deionizada para diluir a solução de estoque de um a 14. Remova as células da incubadora e remova suavemente o meio de cultura.Em seguida, adicione PBS sem cálcio ou magnésio, despejando suavemente contra a parede do prato. Balance o prato duas vezes e despeje o líquido. Em seguida, repita a lavagem mais duas vezes.No exaustor, remova a última lavagem PBS, adicione 1,5 mililitros de hidróxido de amônio por prato de 60 milímetros e incube as placas em temperatura ambiente por cinco minutos. Agite suavemente a louça a cada minuto para garantir a lise de todas as células. Em seguida, adicione grandes quantidades de água deionizada a cada prato e balance o prato.Em seguida, despeje o material solubilizado de hidróxido de amônio, que é composto de hidróxido de amônio, células lisadas e água deionizada. Lave a camada insolúvel de ECM em grandes quantidades de água deionizada mais quatro vezes, para garantir a remoção completa de todo o material solubilizado em hidróxido de amônio. É essencial que as células sejam totalmente removidas com lavagens abundantes em água deionizada.Se essas etapas não forem executadas adequadamente, o material celular pode permanecer no prato e contaminar a análise a jusante. Para o exame da ECM por imunofluorescência, remova a água deionizada restante, fixe a ECM adicionando 2% de paraformaldeído, abreviado PFA, e incube os pratos em temperatura ambiente por 10 minutos. Use PBS para lavar cada amostra fixa duas vezes e descarte a solução em um recipiente de resíduos líquidos antes de realizar a microscopia de fluorescência de acordo com o protocolo de texto.Em uma capela de fluxo laminar, prepare soluções estéreis de PBS sem cálcio e magnésio, hidróxido de amônio 20 milimolar e água deionizada, passando cada solução por um filtro estéril de 0,2 micrômetro para um recipiente estéril apropriado. Mantendo a técnica estéril, use PBS estéril para lavar suavemente as células produtoras da matriz em lamínulas três vezes. Depois de remover a lavagem final do PBS, adicione 1,5 mililitros de hidróxido de amônio estéril ao prato de 60 milímetros e incube em temperatura ambiente por cinco minutos com balanço intermitente.Adicione grandes quantidades de água deionizada estéril ao prato com balanço, despeje o lisado celular em um recipiente de resíduos apropriado. Repita esta lavagem mais quatro vezes para garantir a remoção completa do material solubilado. Depois de tripsinizar e peletizar as células de acordo com o protocolo de texto, ressuspenda as células de teste em meio estéril fresco e use um hemocitômetro para contar as células.Em seguida, coloque o número adequado de células de ensaio e de meio de cultura na ECM isolada estéril em lamínulas e incube durante duas a três horas ou durante o tempo necessário. Para examinar a organização do citoesqueleto de actina, fixe as células de teste em 2% de PFA e comode-as com FITC-Faloidina para visualizar a F-actina e DAPI para visualizar os núcleos. Depois de cultivar um grande número de células, remover as células e lavar o ECM conforme demonstrado anteriormente no vídeo, incline cada placa em um ângulo para drenar a água residual para o fundo do prato e use uma pipeta P200 para remover cuidadosamente qualquer água restante até que a placa esteja completamente seca.Ao mesmo tempo, aqueça o tampão de amostra SDS-PAGE contendo 100 milimolares DDT a 95 graus Celsius por dois minutos e adicione 200 microlitros a cada placa de 100 milímetros a ser examinada por immunoblot. Use um raspador de células para coletar a amostra em um lado do prato e use uma ponta de pipeta de 200 microlitros para transferi-la para um tubo. Para analisar a ECM por espectrometria de massa, prepare uma amostra mais concentrada coletando o tampão de amostra SDS-PAGE da placa, reaquecendo-a a 95 graus Celsius e usando a mesma alíquota em duas a três placas adicionais.Transfira qualquer extrato residual de tampão de amostra SDS-PAGE da ponta do raspador de células para o tubo para minimizar a perda de material ECM. Para uma extração eficaz do ECM isolado no tampão de amostra SDS-PAGE, é essencial que o tampão de amostra seja aquecido a 95 graus, contenha um agente redutor e que a placa seja raspada extensivamente. Aqui são mostradas células COS-7 cultivadas em lamínulas de vidro.O tratamento com hidróxido de amônio removeu as células de forma eficaz, conforme estabelecido pela perda dos núcleos celulares e do citoesqueleto de actina. Nesta figura, as células COS-7 foram transfectadas com a tag RFP trombospondina-1. E a ECM foi visualizada antes e depois do tratamento com hidróxido de amônio.Infere-se que os pontos fluorescentes identificados em ambas as imagens estão associados à MEC. Neste experimento, os fibroblastos dérmicos humanos foram removidos com hidróxido de amônio e a ECM foi sondada com anticorpo anticolágeno 1, que demonstrou um padrão característico de coloração fibular e de malha. Como mostrado aqui, a coloração com fibronectina foi realizada na ECM a partir de células de condrossarcoma de rato extraídas com hidróxido de amônio.Neste exemplo, as células COS-7 de teste foram plaqueadas por duas horas em ECM estéril produzida por células RCS e analisadas quanto à organização da F-actina pela coloração FITC-Faloidina. Em comparação com as células COS-7 que produzem sua própria MEC. Neste experimento, a MEC foi isolada de células de condrossarcoma de rato e as proteínas derivadas da MEC foram então separadas por SDS-PAGE.E as quatro bandas principais foram isoladas e analisadas por espectrometria de massas. Fibronectina, trombospondina-1 e cinco, e matrilina-1 foram identificadas. Finalmente, a MEC endógena de fibroblastos dérmicos humanos foi analisada por immunoblotting.Fibronectina e trombospondina-1 foram detectadas, enquanto as proteínas intracelulares alfa-tubulina e beta-actina estavam ausentes. Uma vez dominada, a remoção de células com hidróxido de amônio e a extração de ECM com tampão de amostra SDS-PAGE quente de três placas de 100 milímetros podem ser feitas em uma hora se forem realizadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de fazer soluções de trabalho de hidróxido de amônio frescas a cada vez para remover as células.Também é muito importante usar lavagens abundantes com água deionizada para garantir a remoção de todas as células. Seguindo este procedimento, métodos como a análise proteômica da ECM extraída podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como uma abundância relativa de proteínas ECM produzidas por diferentes tipos de células. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como remover células de forma eficiente de placas de cultura de células e como extrair ECM.Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar em um exaustor e usar equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método simples é descrita para analisar os efeitos da fibroblastos de tecido em associadas células epiteliais. A combinação deste método eo tridimensional de cultura de tecido pode facilitar a análise das células após o isolamento a partir de 3D. A técnica é aplicável a células de diferentes potencial maligno, permitindo estudo sistemático dos efeitos de estroma associado ao tumor em células tumorais.

Isolamento de células epiteliais mamárias de tridimensional Mixed-célula esferoidal co-cultura

Nós desenvolvemos uma cultura de células automatizado e uma plataforma de interrogação para experiências de estimulação de células micro-escala. A plataforma oferece um controle simples, versátil e preciso para cultivar e estimular pequenas populações de células e recuperar lisados ​​para análises moleculares. A plataforma é bem adequado para os estudos que utilizam células preciosos e / ou reagentes.

A plataforma automatizada versátil para experiências de estimulação Micro escala celulares

As propriedades mecânicas e a micro estrutura da matriz extracelular afectar fortemente a migração de células 3D. Um método in vitro para estudar o comportamento de migração celular no espaço-temporal ambientes biofísico variáveis, tanto na população e os níveis de células individuais, é descrito.

Sistema de Gel Concentric para estudar o papel Biofísica da Matrix Microenvironment sobre a migração celular 3D

Descrevemos o isolamento da matriz extracelular cardíaca de camundongos controle C57Bl/6J, camundongos de pele apertada e camundongos de pele apertada tratados com o peptídeo inibitório IRF5. Também descrevemos os estudos de vasodilatação nos vasos isolados de C57Bl / 6J, camundongos de pele firme e camundongos de pele apertada tratados com o peptídeo inibitório IRF5.

Vasodilatação de isolado navios e o isolamento da matriz extracelular do Mice Tight-pele

diferenciação celular é regulada por uma série de fatores do microambiente, incluindo ambas as propriedades da composição da matriz e material de substrato. Descrevemos aqui uma técnica utilizando microarrays de células em conjunto com microscopia de força de tracção para avaliar tanto a diferenciação de células e as interacções célula-substrato biomecânicas como uma função do contexto microambiental.

Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

A matriz extracelular específico do tecido (ECM) é um mediador chave da função das células. Este artigo descreve métodos para a síntese de espumas e microtransportadores que são estáveis em cultura sem a necessidade de reticulação química para aplicações em 3D avançada em modelos de cultura celular in vitro ou como bioscaffolds pró-regenerativos derivado de ECM puros.

Fabricação de espumas de Matriz Extracelular derivados e Microcarregadores como cultura celular de tecidos específicos e plataformas de entrega

Nós desenvolvemos um ensaio de poliacrilamida-baseado multi bem formato para sondar o efeito da rigidez da matriz extracelular em infecção bacteriana das células aderentes. Este ensaio é compatível com citometria de fluxo, imunocoloração e microscopia de força de tração, permitindo medições quantitativas das interações biomecânicas entre células, matriz extracelular e bactérias patogênicas.

Um ensaio de poliacrilamida-baseado formato multi bem para estudar o efeito da rigidez da matriz extracelular sobre a infecção bacteriana das células aderentes

Este artigo descreve a metodologia detalhada para preparar uma matriz multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulação de alta produtividade de física e química sugestões imitando na vivo o microambiente celular e para Identifica o ambiente celular ideal para as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) com perfis de célula única.

Fabricação de uma matriz de microambiente celular Artificial multiplexado

O objetivo do presente protocolo é a produção de fibras da matriz extracelular toda alvejado para reparação da ferida que são apropriados para avaliação pré-clínicos como parte de um implante de andaime regenerativa. Estas fibras são produzidas pela cultura de fibroblastos nas membranas de fibra oca e extraídas por dissolução das membranas.

Produção de fibras da matriz extracelular através de cultura de células de membrana de fibra oca Sacrificial

O objetivo deste método é obter matrizes 3D derivadas de fibroblasto como um andaime natural para ensaios celulares subsequentes. Os fibroblastos são semeados em uma placa de cultura pré-tratada e estimulados com ácido ascórbico para geração de matriz. As matrizes são descelularizadas e bloqueadas para a cultura de células relevantes (por exemplo, células endotélias).

Sistema de matriz 3D derivado do fibroblasto aplicável ao ensaio de formação do tubo endotelial

Aprenda a isolar matriz extracelular de células cultivadas usando hidróxido de amônio e análise por imunofluorescência. Este método permite estudar composição molecular e funções da ECM em processos normais e doenças.

A rápida, Método Scalable para o isolamento, estudo funcional, e Análise de matriz extracelular derivado de celular

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