Name: Usando um TMEM184A GFP Construir para a confirmação da Heparina Receptor Identity (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Aprenda a usar uma construção GFP-TMEM184A para confirmar a identidade do receptor de heparina em células vasculares. Este método demonstra a utilidade da marcação GFP na identificação funcional de genes órfãos.

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A pesquisa no laboratório Lowe-Krentz é apoiada por HL54269 de bolsas de pesquisa do National Institutes of Health para LLK.

<ol><li>Pugh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+Protein+184A+Is+a+Receptor+Required+for+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Responses+to+Heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin.</a> J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).</li>
<li>Daher, W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27063980">Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P.</a> Mol Biochem Parasitol. , (2016).</li>
<li>Vit, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+membrane+proteins+based+on+analysis+of+trypsin-protected+transmembrane+segments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments.</a> J Proteomics. , (2016).</li>
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<li>Zou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Identification+of+Jatropha+curcas+Aquaporin+Genes+and+the+Comparative+Analysis+Provides+Insights+into+the+Gene+Family+Expansion+and+Evolution+in+Hevea+brasiliensis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis.</a> Front Plant Sci. 7, 395(2016).</li>
<li>Gilotti, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+responses+in+vascular+smooth+muscle+cells+involve+cGMP-dependent+protein+kinase+%28PKG%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG).</a> J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).</li>
<li>Farwell, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+Decreases+in+Tumor+Necrosis+Factor+alpha+%28TNFalpha%29-induced+Endothelial+Stress+Responses+Require+Transmembrane+Protein+184A+and+Induction+of+Dual+Specificity+Phosphatase+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1.</a> J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).</li>
<li>Xu, D., Esko, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demystifying+heparan+sulfate-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Demystifying heparan sulfate-protein interactions.</a> Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).</li>
<li>Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin%2FHeparan+sulfate+proteoglycans+glycomic+interactome+in+angiogenesis%3A+biological+implications+and+therapeutical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use.</a> Molecules. 20, 6342-6388 (2015).</li>
<li>Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+realignment+and+cofilin+regulation+are+essential+for+barrier+integrity+during+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress.</a> J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).</li>
<li>Patton, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+heparin-binding+protein+using+monoclonal+antibodies+that+block+heparin+binding+to+porcine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells.</a> The Biochemical journal. 311, Pt 2 461-469 (1995).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Skalamera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+genome+scale+lentiviral+vector+library+for+EF1alpha+promoter-driven+expression+of+human+ORFs+and+identification+of+human+genes+affecting+viral+titer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer.</a> PloS one. 7, 51733(2012).</li>
<li>Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turn-on+switch+in+parathyroid+hormone+receptor+by+a+two-step+parathyroid+hormone+binding+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).</li>
<li>Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+with+the+EGFP-mCherry+fluorescent+protein+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair.</a> Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+the+ATP-sensitive+potassium+channel+complex+examined+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer.</a> J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).</li>
<li>Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+a+Potent+Free+Fatty+Acid+Receptor+1+%28FFA1%29+Fluorescent+Tracer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer.</a> J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).</li>
<li>Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+rendered+susceptible+to+proteolysis%3A+positions+for+protease-sensitive+insertions%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions.</a> Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os protocolos aqui relatados foram concebidos para proporcionar provas de confirmação para a identificação de um receptor TMEM184A como heparina em células vasculares 1. knockdown técnicas são rotineiramente utilizado como um mecanismo para confirmar a identificação de novas proteínas. No entanto, alguma perda funcional após knockdown não é geralmente suficiente a prova de que uma proteína candidata é realmente o receptor correcto (ou outra proteína funcional). É também importante ter evidência d...

Identificação de proteínas candidatas para novos funções muitas vezes depende protocolos de isolamento à base de afinidade, seguido por determinação da sequência parcial. Exemplos recentes de proteínas recentemente identificados incluem proteína transmembranar 184A (TMEM184A), um receptor de heparina identificado após interacções de afinidade de heparina 1, e TgPH1, um proteína do domínio de homologia que se liga plecstrina PI fosfoinositida (3,5) P 2 2. Outro novo identificação de proteínas envolve a análise de sequência directa de péptidos, tais como que por Vit, et ai. que usou peptídeos transmembrana para identificar produtos de proteínas de genes previamente descaracterizados 3. Do mesmo modo, a identificação de sequências de proteína nova pode ser realizada utilizando bioinformática procura de famílias de proteínas previamente caracterizadas como a identificação de novas proteínas 4TM 4. Exame de sequências de genes da família aquaporin tem alpor isso permitiu a identificação de novos membros com novas funções 5. Após a identificação, análise da função da proteína é tipicamente um passo seguinte, que pode, por vezes, ser examinada utilizando um ensaio específico da função da proteína, tais como no caso aquaporina. Quando possível, a função de uma proteína recentemente identificada pode ser examinada com enzimática específica ou ensaios in vitro de função semelhante. Porque muitas funções de novas proteínas dependem de interacções complexas que ocorrem apenas em células intactas ou organismos, em ensaios in vitro não são sempre eficazes. No entanto, os ensaios in vivo devem ser concebidos de tal maneira que eles dependem da sequência do gene. Em cultura de células, e / ou organismos modelo simples, knockdown pode fornecer elementos de prova para a identificação / função da proteína 6. Com novas proteínas identificadas como notado acima, é muitas vezes insuficiente para derrubar simplesmente uma proteína para confirmar a função, umad o desenho de ensaios funcionais in vivo que dependem da sequência do gene torna-se importante para a caracterização de novas proteínas. A recente identificação de TMEM184A como um receptor de heparina (que modula a proliferação no músculo liso vascular e respostas inflamatórias em células endoteliais), utilizando cromatografia de afinidade e de MALDI MS 1, 7 fornecido uma oportunidade para desenvolver um conjunto de ensaios após knockdown produziu resultados consistentes com a identificação . Uma revisão recente confirmou que a heparina interage especificamente com muitos factores de crescimento, os seus receptores, os componentes da matriz extracelular, adesão celular, receptores e outras proteínas 8. No sistema vascular, a heparina e os proteoglicanos de sulfato de heparano (contendo cadeias de sulfato de heparano de uma estrutura semelhante à heparina) interagem com várias centenas de proteínas 9. Para confirmar funcionalmente that TMEM184A estava envolvido com a captação de heparina e de ligação, as técnicas que empregaram a construção de gene para TMEM184A foram desenvolvidos. O presente relatório inclui um conjunto de ensaios com base em um GFP-TMEM184A construção para utilização em confirmando a identidade do TMEM184A como um receptor de heparina.

<table><tbody><tr><td>GFP-TMEM184A construir</td><td>OriGene</td><td>RG213192</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina-Heparina</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-204</td> Fluoresceína <td>sensível à</td></tr><tr><td>luz-heparina</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-201</td><td>Mowiol sensível à luz</td></tr><tr><td></td><td>EMD Millipore</td><td>475904-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA, sem metanol)</td> <td>Thermo Sci Pierce Biotech, disponível através da Fisher Scientific</td><td>PI28908 na Fisher</td><td>Use in Hotte Hood</td></tr><tr><td>Placas de neutravidina de ligação Reacti (placas pretas de 96 poços revestidas com Avidin)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, através da Fisher Scientific</td><td>PI15510 na Fisher</td><td>Preste atenção ao prazo de validade</td></tr><tr><td>Placas pretas de 96 poços</td><td>Corning Life Sciences Plastic, adquiridas através da Fisher Scientific</td><td>064432 na Fisher</td><td></td></tr><tr><td>A7r5 célula de músculo liso vascular linha</td><td>ATCC</td><td>CRL 1444</td><td>Pode ser trocado por meio MEM1</td></tr><tr><td>BAOEC células endoteliais da aorta bovina</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>B304-05</td><td>A cultura, conforme recomendado inicialmente, pode ser trocada por meio MEM para cultura contínua1,7</td></tr><tr><td>BAOSMC células musculares lisas da aorta bovina</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>B354-05</td><td>A cultura, conforme recomendado inicialmente, pode ser trocada em meio MEM para continuar a cultura 1</td></tr> <tr><td>RAOEC células endoteliais da aorta de rato</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>R304-05a</td><td>A cultura, conforme recomendado inicialmente, pode ser trocada em meio MEM para continuar a cultura7</td></tr><tr><td>Biotinilated anti-GFP</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, através da Fisher Scientific</td><td>MA5-15256-BTIN</td><td></td></tr><tr><td>Grânulos revestidos com estreptavidina</td><td>Sigma</td><td>S1638</td><td></td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Disponível na Bio-Rad</td><td></td><td>Pode ser preparado em laboratório. O pH é de 6,8</td></tr><tr><td>TMEM184A anticorpo para o N-terminal</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc292006</td><td>Apenas conhecido TMEM184A anticorpo para a região N-terminal.</td></tr><tr><td>TMEM184A anticorpo para o terminal C</td><td>Obtido da ProSci Inc, Poway, CA&nbsp;</td><td>Pro Sci 5681</td><td>ProSci usado em anticorpos Figura 1</td></tr><tr><td>GFP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc9996</td><td>Usado em anticorpos secundários Figura 5</td></tr><tr><td>, marcados com TRITC ou Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA</td><td>711 025 152 (anti-coelho de burro, TRITC) 715 165 150 (anti-rato de burro, Cy3)</td> <td>Reatividade cruzada mínima para minimizar qualquer coloração inespecífica.</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Comprado da Sigma</td><td>C5849</td><td>Note que este número de catálogo específico foi descontinuado.&nbsp; O fornecedor fornecerá informações sobre a substituição.</td></tr><tr><td>Placas de imagem ao vivo de 35 mm</td><td>MatTek (Ashland MA)</td><td>P35G-1.0 - 20 mm - C</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta com uma lente de imersão em óleo de 63X</td><td>Usado para imagens e imagens ao vivo em <forte>Figuras 1, 2 e 3</forte></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal</td><td>Nikon</td><td>C2+ confocal com uma lente de imersão em óleo de 60X</td><td>Usado para imagens em <forte>Figura 5</forte></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal</td><td></td><td>Zeiss Zeiss LSM 880 com uma lente de imersão em óleo 63X</td><td>Usado para imagens em equipamentos de Figura 2C</td></tr><tr><td>Electroporation</td><td>Bio-Rad</td><td>Gene Pulser X-Cell System</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de eletroporação</td><td>disponíveis na MidSci</td><td>EC2L</td><td>Também podem ser obtidos do fornecedor de equipamentos Leitor de</td></tr><tr><td>placas</td><td>TECAN TECAN</td><td>Infinite&reg; m200 Pro leitor de placas</td><td>Leituras no meio dos poços e não na superfície.</td></tr><tr><td>Programa de computador para medir a intensidade da coloração</td><td>Imagem J</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/ Programa e informações disponíveis on-line</td><td>Qualquer programa apropriado pode ser usado. Veja https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html para detalhes adicionais&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de tripsina para cultura de células</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td>adquirida como solução 10x</td></tr></tbody></table>

usando um tmem184a gfp construir para a confirmação da heparina receptor identity

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

Quando novas proteínas são identificados através de análise de isolamento e bioinformática à base de afinidade, eles são muitas vezes não caracterizados em grande parte. Os anticorpos contra os péptidos específicos dentro da sequência prevista permitir que algumas experiências de localização. No entanto, outros possíveis interacções com os anticorpos muitas vezes não podem ser excluídos. Esta situação constituiu uma oportunidade para desenvolver um conjunto de ensaios dependentes da sequência da proteína. Especificamente, foi obtida uma construção contendo a sequência de gene acoplado à sequência codificante de GFP na extremidade C-terminal da proteína e utilizados para estes fins. Experimentos para caracterizar localização, afinidade do ligando, e ganho de função foram originalmente concebidos e realizados para confirmar a identificação de TMEM184A como um receptor heparina 1. Além disso, a construção pode ser utilizada para estudos abordando questões de topologia de membrana e as interacções proteína-ligando detalhados. O presente relatório apresenta arange de protocolos experimentais com base na GFP-TMEM184A expresso em células vasculares que poderia ser facilmente adaptada para outras novas proteínas.

Embora, em teoria, a transfecção de qualquer construção de ADN para as células pode ser realizada com os reagentes de transfecção lipofílicos, relatórios anteriores indicam transfecção mais eficaz de GFP construções em células endoteliais utilizando electroporação 12. O protocolo aqui fornecida tipicamente conseguida GFP-construção de expressão em mais de 80% das células endoteliais derivados de primários e células de músculo liso utilizados. Projeto da construção...

Uma construção que codifica TMEM184A com uma marcação GFP no carboxi-terminal concebido para expressão eucariótica, foi empregue em ensaios desenhados para confirmar a identificação de um receptor TMEM184A como heparina em células vasculares.

Usando um TMEM184A GFP Construir para a confirmação da Heparina Receptor Identity

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

O objetivo geral de usar uma construção marcada com GFP é confirmar a identidade de uma proteína anteriormente desconhecida usando a GFP como alça. Este método pode ajudar na identificação funcional de genes órfãos quando uma atividade enzimática específica não está disponível para confirmação. A principal vantagem dessa técnica é que o GPF-tag permite que a mesma construção seja usada para vários tipos de experimentos.Geralmente, os indivíduos que são novos neste método podem ter problemas, porque a transfecção nem sempre resulta na expressão de construção forte e as células nem sempre revivem. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez, quando começamos a reconhecer as dificuldades de identificar uma proteína usando apenas anticorpos criados contra ela. Comece ressuspendendo as células de interesse em um mililitro de tampão de eletroporação salina tamponada com HEPES e coloque imediatamente as células no gelo.Adicione um volume suficiente de plasma marcado com GFP-TMEM184A às células para atingir uma concentração final de 20 microgramas por mililitro de DNA e transfira aproximadamente 0,4 mililitros de células para uma cubeta de eletroporação pré-resfriada. Eletroporar as cél

using-gfp-tagged-tmem184a-construct-for-confirmation-heparin-receptor

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Nós geneticamente codificam o aminoácido não natural, p-azido-L-fenilalanina em várias posições orientadas nos GPCRs e mostram a versatilidade do grupo azido em diferentes aplicações. Estes incluem uma tecnologia de fotorreticulação alvo para identificar resíduos na bolsa de ligação ao ligando de um GPCR, e específica do local de modificação bioorthogonal de GPCRs com uma etiqueta de péptido epitopo ou sonda fluorescente.

Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

Aqui demonstramos a utilização do corante fluorescente Alexa acoplado a α-bungarotoxina para medir GABA A localização do receptor de superfície e endocitose em neurónios do hipocampo. Através da utilização de construções que ostentam uma marca curta extracelular que se liga α-bungarotoxina, análise de proteína da membrana plasmática do tráfico endocítica pode ser alcançado.

Usando um α-Bungarotoxina Binding Tag Site para Estudar GABA um receptor de membrana Localização e Tráfico

Este manuscrito descreve como conduzir ensaios baseados em Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) (molécula única) para medir a dinâmica de ligação entre o receptor de antígeno de célula T (TCR) e moléculas de MHC carregadas com peptídeos antigênicos à medida que ocorrem dentro da sinapse imunológica de uma célula T em contato com uma bicamada lipídica planar funcionalizada.

Medição de TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Usando a microscopia Ensaio de FRET

As proteínas do envelope nuclear desempenham um papel central em muitos processos biológicos básicos e têm sido implicadas em uma variedade de doenças humanas.  Este protocolo descreve um novo modelo de camundongo baseado em Cre / Lox que permite o controle espaço-temporal da ruptura dos complexos LINC.

A validação de um modelo de camundongo para Disrupt Complexos LINC de um modo específico de célula

arritmias cardíacas hereditárias são geralmente causadas por mutações que alteram a entrega de superfície de um ou mais canais de íons. Aqui, nós adaptar ensaios de citometria de fluxo para proporcionar uma quantificação da expressão de proteína total e a superfície celular relativa dos canais de iões recombinantes expressas em células TSA-201.

Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo

Um ensaio de fluorescência facile é apresentado para avaliar a eficiência de amino-acil-tRNA-sintetase/tRNA pares incorporando proteínas expressadas em células de mamíferos não-canônicos amino-ácidos (ncAAs). A aplicação de ncAAs estudar receptors G-proteína acoplada (GPCRs) é descrita, incluindo mapeamento de foto-reticulação de binding sites e opaco GPCR rotulagem em células vivas.

Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

Aqui, apresentamos um protocolo robusto e otimizado para a produção de quantidades de miligrama de monômeros nativos, livre de marca e fibrilas do exon1 da proteína huntingtina (Httex1) com base na fusão transitória do ubiquitin pequeno modificador relacionados (SUMO).

Geração de nativos, sem marcas de formatação da huntingtina Exon1 monômero e fibrilas usando uma estratégia de fusão de sumô

Este protocolo descreve técnicas utilizadas para determinar as estruturas do canal de íon pela microscopia cryo-elétron, incluindo um sistema de baculovirus usado eficientemente expressar genes em células de mamíferos, com esforço mínimo e toxicidade, extração de proteínas, purificação, e verificação de qualidade, preparação da amostra grade e triagem, bem como coleta de dados e processamento.

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Este manuscrito descreve uma abordagem de triagem baseada em células em escala de genoma para identificar interações receptor-ligantes extracelulares.

Identificação do receptor de superfície celular usando telas genéticas CRISPR/Cas9 em escala de genoma

Este artigo apresenta um protocolo de isolamento de membrana plasmática de pequena escala para a caracterização da proteína Cdr1 (cassete de ligação ATP) da Candida ABC (fita adesão a ATP), superexpressa em Saccharomyces cerevisiae. Uma mGFPC terminal de protease com um linker de 16 resíduos entre o Cdr1 e a tag foi projetada para facilitar a purificação e o detergente-triagem do Cdr1.

Preparação de membrana plasmática em pequena escala para a análise de cânbicas cânbicas cdr1-mGFPHis

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