Usando um TMEM184A GFP Construir para a confirmação da Heparina Receptor Identity

O objetivo geral de usar uma construção marcada com GFP é confirmar a identidade de uma proteína anteriormente desconhecida usando a GFP como alça. Este método pode ajudar na identificação funcional de genes órfãos quando uma atividade enzimática específica não está disponível para confirmação. A principal vantagem dessa técnica é que o GPF-tag permite que a mesma construção seja usada para vários tipos de experimentos.

Geralmente, os indivíduos que são novos neste método podem ter problemas, porque a transfecção nem sempre resulta na expressão de construção forte e as células nem sempre revivem. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez, quando começamos a reconhecer as dificuldades de identificar uma proteína usando apenas anticorpos criados contra ela. Comece ressuspendendo as células de interesse em um mililitro de tampão de eletroporação salina tamponada com HEPES e coloque imediatamente as células no gelo.

Adicione um volume suficiente de plasma marcado com GFP-TMEM184A às células para atingir uma concentração final de 20 microgramas por mililitro de DNA e transfira aproximadamente 0,4 mililitros de células para uma cubeta de eletroporação pré-resfriada. Eletroporar as células. Em seguida, veja as células transfectadas em placas de cultura de tecidos e coloque as placas em uma incubadora de cultura de células por 24 a 72 horas.

A etapa de transfecção é a etapa mais crítica do procedimento, porque a maior parte do trabalho experimental restante não pode ser efetivamente concluída se as células não forem viáveis e não expressarem níveis significativos da construção marcada com GFP. No momento experimental adequado, adicionar 100 microgramas por mililitro de heparina de rodamina ao meio de cultura celular que expressa o plasmídeo GFP e incubar as células, protegidas da luz, até atingir o nível de coloração desejado, observado por microscopia de fluorescência. Em seguida, enxágue as células com PBS e alguns segundos de agitação suave, protegida da luz, seguida de fixação com paraformaldeído a 4% por 15 minutos em temperatura ambiente com agitação suave.

Para avaliar a co-localização da heparina de rodamina marcada com GFP, use um microscópio confocal com a excitação apropriada de GFP e rodamina e lasers diminuídos para obter imagens de pelo menos 50 células de cada experimento de marcação separado. Examine as imagens no programa de análise de imagem apropriado para determinar a descoberta e absorção relativa de rodamina em cada célula, usando uma ferramenta à mão livre para circular as células dentro de cada imagem fluorescente. Use a ferramenta de medição para determinar a intensidade dentro de cada espaço circulado e, em seguida, exporte os dados de intensidade de fluorescência para uma planilha para calcular a área multiplicada pela intensidade, subtraindo o plano de fundo para a mesma quantidade de área para cada célula.

A fluorescência por célula pode então ser calculada para todas as células, para obter dados estatisticamente significativos. Para facilitar a transferência de energia de ressonância de fluorescência da TMEM184A GFP para a heparina de rodamina, primeiro monte células fixas GFP TMEM184A transfectadas com heparina de rodamina em lâminas de microscópio de vidro. Excite as células a 405 nanômetros para obter imagens da emissão de rodamina, seguida de excitação de 488 nanômetros para obter imagens da emissão de GFP.

Em seguida, excite as células a 561 nanômetros para uma segunda imagem de emissão de rodamina. Para imagens de células vivas da captação de heparina de rodamina, semeie uma cultura de placa confluente de 100 mililitros de células GFP TMEM184A transfectadas em placas de imagem de células vivas de 635 milímetros para obter células próximas à confluência. Após 48 horas, substituir o sobrenadante por meio de cultura sem vermelho de fenol e transferir uma placa de células para um microscópio confocal com um estágio de aquecimento ajustado para 37 graus Celsius.

Focalize o microscópio e adicione 100 microgramas por mililitro de heparina de rodamina às células com uma mistura suave. Em seguida, comece imediatamente a gravar as imagens ao vivo. Se não ocorrer captação de heparina dentro do campo de visão, mova o prato ligeiramente para identificar as células com pelo menos uma vesícula verde, contendo o rótulo de rodamina.

Para avaliação de ligação à heparina in vitro, enxágue uma placa preta de 96 poços revestida com ativan e uma placa preta não revestida de 96 poços com 200 microlitros de 0,2% CHAPS PBS pro-well por três lavagens de cinco minutos com agitação. Após a última lavagem, adicione 100 microlitros de 60 picomoles por poço de anti-GFP biotinilado em triplicado à placa revestida com ativan para cada grupo de achado de GFP. Em seguida, adicione tampão apenas aos poços de controle e sele todos os poços com uma tampa de placa para uma incubação de duas horas em temperatura ambiente com agitação.

No final da incubação, lave todos os poços três vezes em CHAPS PBS, como acabamos de demonstrar, e adicione 100 microlitros de cinco nanomoles por poço de GFP TMEM184A, ou GFP sozinho, aos poços apropriados na placa revestida com ativan. Após uma incubação de uma hora em temperatura ambiente com agitação, lave todos os poços com CHAPS PBS fresco e adicione 100 microlitros de cada concentração experimental de fluoresceína-heparina aos poços de teste apropriados em triplicata, à placa revestida com ativan. Adicione os padrões de concentração às placas revestidas com ativan e não revestidas e incube ambas as placas por 10 minutos em temperatura ambiente, com agitação, protegidas da luz.

Agora, use um leitor de placas para registrar a emissão inicial de fluorescência de heparina nos poços de controle de ambas as placas e a emissão total de fluorescência inicial dos poços com a GFP imobilizada ou TMEM184A GFP na placa revestida com ativan. Em seguida, transfira a heparina fluorescente não ligada dos poços com a TMEM184A GFP ou GFP imobilizada para os poços correspondentes na placa preta não revestida. Depois de ler imediatamente a emissão de fluorescência na placa preta não revestida, adicione 100 microlitros de CHAPS PBS fresco de volta aos poços dos quais a fluoresceína-heparina foi removida e leia as emissões de fluorescência desses poços para obter a emissão de fluorescência das amostras removidas e não ligadas na placa não revestida.

Quando todas as leituras não ligadas tiverem sido obtidas, use os valores totais de emissão de heparina para confirmar se os níveis corretos de heparina foram adicionados a cada poço, subtraindo as leituras médias de fundo dos valores. Em seguida, crie um gráfico da emissão versus a fluoresceína-heparina total adicionada, para determinar a escala da emissão versus a quantidade de heparina e plote a heparina ligada corrigida, versus a heparina adicionada para os triplicados dos poços de TMEM184A GFP e GFP. O período de tempo após a transfecção afeta a distribuição da GFP TMEM184A, que parece se acumular ao longo de pelo menos 72 horas, com mais GFP aparente na região paranuclear ao longo do tempo.

O padrão de coloração de GFP nesta cultura de células vasculares representativas parece ser mais semelhante ao de um anticorpo levantado contra um peptídeo C-terminal, um resultado lógico, dado que a GFP está no terminal C da proteína. O uso de um ligante fluoresceína-rodamina-heparina também pode ser usado para a avaliação em tempo real da co-localização do receptor do ligante ao longo do tempo. A captação de heparina é aumentada na GFP TMEM184A construir células knockdown estáveis transfectadas, resultando em células que podem recuperar a capacidade de internalizar a heparina rodamina no nível ou acima do nível das células do tipo selvagem.

Usando o sistema de tato GFP codificado por plasmídeo demonstrado, a construção de TMEM184A GFP isolada com anticorpo anti-GFP demonstra uma ligação específica de heparina tripla, enquanto a GFP de controle não se liga a nenhuma heparina. A coloração simples por imunofluorescência com anticorpos novamente GFP também pode fornecer informações sobre a localização da GFP, com base no acesso de anticorpos em células não permeabilizadas, fornecendo evidências preliminares de que a GFP expressa na membrana plasmática é extracelular. Uma vez dominada, essa técnica pode resultar em excelente expressão de construção GFP, após 24 a 48 horas de cultivo.

Ao tentar o protocolo de imagem ao vivo, é importante lembrar que algumas células podem não exibir a captação co-localizada, por isso muitas vezes é necessário examinar outras células. Os ensaios de ligação com ligantes GFP podem ser complicados por dímeros ou agregados de ordem superior da proteína GFP, particularmente se estiverem em micelas detergentes. No geral, a expressão de proteínas marcadas com GFP pode facilitar uma ampla variedade de experimentos para confirmar a identidade de uma proteína anteriormente desconhecida.