Name: Dissecção da Auditivo Bulla em ratos pós-natais: Isolamento dos ossos do ouvido médio e da análise histológica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprenda a dissecção da bulla auditiva em camundongos pós-natais para análise histológica e montagem total. Este método isola ossículos do ouvido médio e auxilia no estudo da morfogênese e ossificação endocondral.

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Os autores agradecem a Masaki Yoda e Elise Lamar pela leitura crítica do manuscrito, Kazumasa Takenouchi pela ajuda com histologia, Mari Fujiwara pela ajuda com a microscopia e Makoto Morikawa pela ajuda na fotografia de ossículos auditivos humanos e de camundongos.

Todos os procedimentos com animais realizados neste estudo são aprovados pela Universidade Keio Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC - número de aprovação: 09.221) e siga as orientações institucionais em Experimentação Animal da Universidade Keio para o uso de animais em pesquisa. amostras humanas foram isoladas de um cadáver doado ao Departamento de Anatomia da Faculdade de Medicina da Universidade de Keio, e foram utilizados de acordo com os regulamentos institucionais. 1. Isolamento de Auditivo Bulla e Capsule <ol><li> Euthanize camundongos em um frasco contendo uma plataforma acima toalhas de papel embebido em isoflurano ou sevoflurano até ventilação respiratória cessa por mais de um minuto e, em seguida, executar deslocamento cervical. Tenha cuidado para evitar o contato direto de camundongos com as toalhas de papel embebido. </li><li> Faça uma pequena incisão transversal no lado dorsal do pescoço e puxar a pele para além em direção a cabeça ea cauda usando as duas mãos para expor mu pescoço subjacentetecido LECS. </li><li> Decapitar os ratos na região cervical 14 cm usando tesouras cirúrgicas afiadas. </li><li> pele casca completamente em direção ao nariz. Cortar toda a pele, juntamente com o focinho e incisivos. </li><li> Insira tesouras na boca e cortar músculos masseter em ambos os lados. </li><li> Abrir a garra com cuidado e retire a língua e mandíbula inferior juntos. </li><li> Usando uma tesoura afiada, crânio da separação e da base do crânio em duas metades ao longo do plano sagital médio (Figura 1A, B). </li><li> Utilizando uma pinça, retire os hemisférios cerebrais e cerebelo e tronco encefálico. A bula auditiva e da cápsula estão localizados lateralmente ao cerebelo e tronco cerebral. Note-se que a bolha auditivo é ainda mais lateralmente à cápsula auditiva (figura 1C, D). </li><li> Dissecar a bula e da cápsula com o osso do crânio circundante (Figura 1E). </li><li> Transfira a amostra para um prato contendo fosfato-salino tamponado (PBS) pH 7,4, à TA. </li><li> vocênder uma dissecação microscópio binocular, utilize uma pinça para separar os ossos e tesouras circundantes para cortar o limite solta ao redor da bolha e da cápsula (Figura 1F). Os ossos ao redor removidos são o basioccipital (fronteira ventral), exoccipital (fronteira ventro-posterior), supraoccipital (borda posterior), parietal (fronteira dorsal) interparietal, esquamosal (fronteira dorso-anterior), alisphenoid (borda anterior) e basiesfenóide (beira antero-ventral) ossos. Note-se que o processo styliform (SP), que apoia a abertura timpânica da trompa de Eustáquio 41, é distinto do processo estilóide do osso temporal. </li></ol> 2. Isolamento de Auditivo Ossículos: martelo, bigorna e estribo <ol><li> Martelo <ol><li> Utilizando as duas pequenas tesouras e pinças, remover a parte da lateral do canal auditivo externo para o sulco timpânico de modo que a membrana timpânica é visível (Figura 2A, B). </li><li> Remover parte da membrana timpânica e osso timpânico perto do malleal processus brevis (apófise orbicular, ver Discussão), tanto no ventral (pontilhada) e posterior (#) paredes (Figura 2C). O músculo do tímpano martelo e tensor deve agora ser exposto (Figura 2D, E). </li><li> Levantar o martelo (Figura 2F) e cortar o músculo tensor do tímpano com a borda chanfrada de uma agulha G 27 (Figura 2G). Note-se que o manubrium malleal fixado firmemente à membrana timpânica, como é visto em outros mamíferos. </li><li> Retire a membrana timpânica cuidadosamente do manubrium, que é frágil. Retirar o osso timpânica para revelar os três ossículos auditivos. </li><li> Deslocar o martelo da bigorna na articulação ossicular (Figura 2H). </li><li> Isolar o martelo pela fratura do processo anterior, no goniale. </li></ol></li><li> Bigorna e estribo <ol><li> isolar tele bigorna, cortando o ligamento posterior da bigorna no curto crus (Figura 3A). </li><li> Isolar o estribo, cortando a artéria estapediano perto do estribo com a borda chanfrada de uma agulha G 27 (Figura 3B, C). Se necessário, cortar o tendão do músculo estapédico no processo muscular do estribo com a agulha. </li><li> Inserir uma agulha de costura (ou um pino de marcação) no forame obturador do estribo e levante o estribo. Depois de remover o estribo, a abertura da janela oval deve ser claramente visível (Figura 3D). </li></ol></li></ol> 3. Incorporação de Auditivo Bulla e Capsule <ol><li> Preparação para a incorporação em blocos de parafina <ol><li> Isolar a bula e da cápsula como descrito na Seção 1. </li><li> Cortar a extremidade anterior da bolha (o processo styliform) para fora com uma tesoura, e mergulhar a bula cápsula em 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS a 4 °C, e permitir que o fixador para entrar na bula. Se o ar fica preso na bula, removê-lo com uma agulha e seringa. Deixar a bula e cápsula no fixador a 4 ° CO / N num rotor tubo. Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado. </li><li> Lavar uma vez com PBS. </li><li> Descalcificação bula e da cápsula por uma semana a 4 ° C em 10% de di-hidrato de sal de dissódio do ácido etilenodiaminotetracético (EDTA-2Na), 100 mM de base Tris, pH 7,0, num tubo de 2 mL. Alterar o buffer a cada dois dias. </li><li> Lavar uma vez com PBS. As amostras podem ser armazenadas em 70% de etanol em água a 4 ° C. Opcionalmente, a transferência para 70% de etanol através de uma série de álcoois graduados (30%, 50%, 70% em água). </li><li> Num processador de tecido, desidratar as amostras numa série graduada de soluções de etanol (70%, 2 x 95%, 3 x 100%, cada um 1H), claras em xileno (4x, cada 1 h a 40 ° C), e infiltrar-se amostras com a cera de parafina fundida 42. Opcionalmente, xileno substituto com clearin tecido comercialg de solução (por exemplo, histo-claro). </li><li> Descarregar amostras do processador, e removê-los de suas fitas cassetes. </li><li> Em um sistema de console de tecido a incorporação, lugar espécimes em moldes cheios de cera de parafina derretida. Prossiga para a incorporação (Seção 4). </li></ol></li><li> Preparação para inclusão em blocos congelados (método de filme de Kawamoto) 43 <ol><li> Isolar a bula e da cápsula como descrito na Seção 1. </li><li> Cortar a extremidade anterior da bolha (o processo styliform) para fora com uma tesoura, e mergulhar a bula cápsula em fixador (2% ou 1% de PFA em vez de 4% em PBS para preservar a antigeni cidade) a 4 ° C. Se houver ar preso em bula, removê-lo usando uma agulha e seringa. Deixar a bula e cápsula no fixador a 4 ° CO / N num rotor tubo. </li><li> Lavar bula e cápsula rapidamente em PBS e mergulhar imediatamente no composto de crio-incorporação líquido a 4 ° C. </li><li> Importante: Remova as bolhas de ar se houver no meioe ouvido externo através de aspiração por uma agulha, e por adição do composto com a incorporação de uma pinça. Prossiga para a incorporação (Seção 4). </li></ol></li></ol> 4. Orientação Sample and Embedding NOTA: O conjunto bula e cápsula deve ser providenciado com uma orientação particular, durante a incorporação de cortar secções desejadas. Os procedimentos descritos abaixo são utilizados para secção o martelo em várias orientações. <ol><li> Longitudinal (parasagittal) de corte do martelo <ol><li> Coloque o lado lateral da bula ou conduto auditivo externo para baixo em parafina quente (ou composto-incorporação crio). Ajustar a orientação de modo que o pescoço e transversal lâmina do martelo são paralelas ao fundo horizontal do prato de encastre (Figura 4A - C). Note-se que a membrana timpânica é inclinado segundo um ângulo de aproximadamente 30 ° em relação à vertical na cabeça de rato (Figura 4A; Figura 59 em Kampen <suP&gt; 44). </li></ol></li><li> Corte horizontal do martelo <ol><li> Coloque a crista dorsal horizontal em parafina quente (ou composto-incorporação crio). Ajustar a orientação da bolha e da cápsula de modo que o pescoço e transversal lâmina do martelo são perpendiculares ao fundo do prato de encastre (Figura 4D - F). </li></ol></li><li> Seccionamento Frontal (secções transversais) do manúbrio e da membrana timpânica 5 <ol><li> Coloque a manubrium malleal em parafina quente (ou compostos à incorporação de crio) de tal modo que é perpendicular ao fundo do prato de incorporação. </li></ol></li><li> Arrefecer o bloco a temperaturas adequadas para endurecer a cera de parafina em um sistema de console tecido incorporação (em alternativa, usar composto incorporação crio em um banho de gelo seco / hexano). </li><li> bloco de tecido processo e seções de corte utilizando procedimentos de rotina. Por exemplo, seções mancha de parafina com hematoxilina e eosina (H &amp; #38; E), safranina O (para a cartilagem), ou para a actividade de fosfatase ácida (TRAP) resistente a tartarato (por osteoclastos) 3, ou por imuno-histoquímica. Criosecções descalcificadas são adequados para rotulagem óssea usando fluorocromos 14, alizarina para o cálcio, e imunofluorescência 42. </li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, apresentamos um método útil para isolar a bula auditiva e cápsula em ratos pós-natais. Antes da P12, os tecidos são frágeis e podem ser danificados durante o isolamento. Após P12, o bula auditiva e da cápsula pode ser facilmente isolado a partir de tecidos circundantes. Dissecando a bula da cabeça antes do corte tem várias vantagens. Em primeiro lugar, cavitação pós-natal e do crescimento da bula auditiva ocorrer mais ativamente da P6 em diante e são completos por P14 50. O tecido mesenquimal entre a membrana timpânica e parede coclear é substituído por ar através do processo de cavitação. O ar resultante na cavidade do ouvido médio pode impedir o contato entre os tecidos e líquidos durante a fixação, descalcificação e incorporação. É mais fácil para remover o ar da bula auditiva isolada, cortando o final (processo styliform) anterior ao invés de tentar fazê-lo na bula não isolado. Em segundo lugar, a orientação do martelo (e a membrana timpânica) não é verticalna cabeça. É, portanto, mais fácil de secção do martelo em planos desejados pela incorporação da bula auditiva isolada e cápsula em uma determinada orientação. Uma vez isolado, bula auditiva e cápsulas são úteis para numerosas análises. Por exemplo, de alta resolução de raios-X micro-CT pode revelar morfologia microestrutura do osso, tais como capilares osteogênicos no martelo 14. O microscópio de dissecação stereofluorescence é uma ferramenta poderosa para avaliar visualização das estruturas em ratinhos que expressam proteínas fluorescentes do repórter no ouvido médio ou interno 33. Além disso, pode ser realizada uma variedade in vivo ou ex vivo de fluorescência métodos de marcação e detecção de imunofluorescência de montagem inteira. A microscopia de fluorescência folha de luz também é útil para a análise tridimensional 51. Embora não seja descrito aqui, diversas estruturas anatômicas associado com a bula auditiva e da cápsula, como os nervos periféricos, vasos sanguíneos, emembrana timpânica no ouvido médio também pode ser avaliada usando esse protocolo. Note-se que o seccionamento de parafina requer descalcificação do tecido ósseo antes de incorporação e, portanto, não permite a análise de mineralização. Em contraste, o método de Kawamoto filme 43 usado para preparar secções congeladas pode ser realizada sem descalcificação e é adequado para estudos de mineralização utilizando técnicas de rotulagem de osso in vivo ou coloração especial, tais como coloração Alizarina. condições Cryo-seccionamento deve ser otimizada de acordo com base na idade mouse. Por exemplo, uma temperatura inferior fresco no interior da câmara criostato é recomendado para amostras mais velhas do rato para minimizar os danos para as secções. No rato, o termo correto para a protuberância semi-esférica de destaque do martelo é &quot;apófise orbicular&quot;. No entanto, o termo &quot;processus brevis&quot; tem sido amplamente utilizada para indicar a apófise orbicular para mais thum duas décadas, especialmente entre rato biólogos do desenvolvimento 16,20,22-25. &quot;Processus brevis&quot; originalmente se referia ao processo lateral (processus lateral), que difere da apófise orbicular. Em seres humanos, um processo lateral semelhante a uma ligeira projecção cónica forma geral a linha de ligação à membrana timpânica, que se estende a partir da fúrcula (não visto na Figura 6B, vista medial). Em ratinhos, o processo lateral é também uma projecção do manubrium na extremidade oposta ao umbo 48. Os pars flácida da membrana timpânica está acima do processo lateral do martelo. apófise orbicular não é aparente no martelo humano.

Os três ossículos auditivos do ouvido médio, ou seja, martelo, bigorna e estribo, formam uma cadeia auditiva específica de mamíferos que transmite som a partir da membrana timpânica ao ouvido interno, ou cóclea 1,2. Função auditiva pode ser avaliada em ratos medindo Auditivo de Tronco Encefálico (ABR) limiares 3-6, e vibração do martelo atrás da membrana timpânica pode ser monitorado usando Laser Doppler vibrometria (LDV) 7. Ao combinar ABR, LDV e medidas Produto de Distorção de Emissões Otoacústicas (EOAPD), perda auditiva condutiva pode ser discriminado de deficiência neurossensorial 8. são necessários modelos animais de condições de orelha, dada a importância da audição e a saúde do ouvido para o bem-estar dos pacientes de todas as idades. Por exemplo, otite média é uma infecção no ouvido extremamente comum visto em lactentes e crianças humanas, e, otite média aguda grave e suas complicações podem ocorrer se a condição não for tratada com antimicrobianos apropriados 9. Modelos de rato de otite média pode ser útil na compreensão da patogênese e no desenvolvimento de tratamentos 10,11. Ossículos murino, que (com excepção da parte goniale do martelo) são formados por ossificação endocondral 12,13, são altamente relevantes para o estudo do metabolismo ósseo e morfogênese. Em primeiro lugar, seu pequeno tamanho permite a análise de alta resolução de ossos com um periósteo intacto usando raios-X ou microscopia de fluorescência 14. Em segundo lugar, o metabolismo ósseo anormal, como a reabsorção óssea excessiva ou deficiente, ou interações deficientes entre as células ósseas 15, pode ser analisado como um contribuinte potencial de perda auditiva 3,4,7. Em terceiro lugar, a morfogénese ossículo anormal é relatada em vários ratinhos deficientes em genes, tais como animais que faltam Hoxa2 16-19, 20-22 Msx1, Prrx1 23, Goosecoid(GSC) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, FGFR1 29, os receptores da hormona da tiróide (Thra, Thrb) 5, Bcl2 30 e outros 1,31, ou em camundongos com superexpressão Hoxa2 32. Finalmente, apesar de seu pequeno tamanho, estruturas associado com ossículos, como músculos e articulações 33 34,35 são acessíveis. ossículos do rato são menores do que ossículos humanos, mas é digno de nota que a orelha média do rato não é uma versão em miniatura de sua contraparte humana. Por exemplo, em ratos, a artéria estapediano, que passa através do anel do estribo, persistir ao longo da vida 36, enquanto que em seres humanos, a artéria estapediano embrionária desaparece durante a gestação. Além disso, a morfologia do martelo do rato difere da do the osso humano (ver Figura 6). Em camundongos, a bula auditiva (timpânica) encerra a cavidade do ouvido médio cheio de ar, enquanto que em seres humanos, as células aéreas da mastóide compostas de osso trabecular no osso temporal abriga os ossículos, em vez de uma bolha 37. Em ambas as espécies, a cápsula auditiva (cápsula ótica, labirinto ósseo) encerra a cóclea e canais semicirculares do ouvido interno. Biologia comparada e evolutiva do ouvido médio tem sido extensivamente revisado 38-40. O protocolo fornecido abaixo primeira descreve como dissecar a bula auditiva e cápsula, que consistem principalmente de orelha média e orelha interna, respectivamente. Este protocolo também demonstra como isolar o martelo, bigorna e estribo da bula auditiva. Finalmente, ele mostra como orientar a bula auditiva e da cápsula para embutir em preparação para o seccionamento de tecidos de ossículos auditivos.

<table><tbody><tr><td>Ferramentas/Equipamentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paper towel</td><td>Daio Paper Corporation</td><td>703347</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Frasco de vidro</td><td>Vários</td><td></td><td>podem ser adquiridos de outros fornecedores Tesoura</td></tr><tr><td>cirúrgica de 14 cm</td><td>Ferramentas de Belas Ciências (FST)</td><td>91400-14</td><td>pode ser adquirido de outros fornecedores Tesouras</td></tr><tr><td>extra finas retas</td><td>Ferramentas de Belas Ciências (F.S.T.)</td><td>14084-08</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Pinça Fina Angulada 45&deg; </td><td>Ferramentas de Belas Ciências (F.S.T.)</td><td>11063-07</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>para dissecação de rotina</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>para filmes&nbsp;</td></tr><tr><td>Agulha de injeção 27 G</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Seringa (1 mL)</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Pino de marcação</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rotador de tubo RT-50</td><td>TAITEC</td><td>0000165-000</td><td>pode ser adquirido de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/</td></tr> <tr><td>TC-65 Lâmina de tungstênio</td><td>Leica</td><td>14021626379</td><td>para o método firme de Kawamoto</td></tr><tr><td>Recipientes de aço inoxidável</td><td>Leica</td><td></td><td>para o método firme de Kawamoto</td></tr><tr><td>Cryofilm tipo IIC</td><td>Leica</td><td></td><td>para o método firme de Kawamoto</td></tr><tr><td>Corrediça revestida de silano (Novo Silano II)</td> <td>Muto Pure Chemicals</td><td>511617</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>Matsunami</td><td></td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Processador de tecidos</td><td>Sakura Finetek</td><td>VIP-5</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Sistema de console de incorporação de tecidos</td><td>Sakura Finetek</td><td>Tissue-Tek TEC 5&nbsp;</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Micrótomo deslizante para parafina</td><td>Yamato Kohki Industrial</td><td>REM-710</td><td>pode ser adquirido de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Path Blade+pro para tecidos duros</td><td>Matsunami</td><td>PB3503C</td><td>para seção de parafina</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>RIGAKU</td><td></td><td>R_mCT2 http://www.rigaku.com/en</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000</td><td></td></tr><tr><td>Nome </td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Reagentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Maruishi pharmaceutical Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>wako</td><td>191-01665</td><td>para PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>wako</td><td>285-14</td><td>para PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4 12H2O</td><td>wako</td><td>196-02835</td><td>para PBS</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>wako</td><td>287-21</td><td>para PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA, Grau EM)</td><td>TAAB</td><td>P001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>wako</td><td>15111-45</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Super Cryoembedding Médio</td><td>Leica</td><td></td><td>para o método firme de Kawamoto</td></tr><tr><td>Gelo seco</td><td>Vários</td><td></td><td>para o método firme de Kawamoto</td></tr><tr><td></td><td>Hexane wako</td><td>080-03423</td><td>para o método firme de Kawamoto</td></tr><tr><td>Super Cryomouting Tipo médio R2</td><td>Leica</td><td></td><td>para o método firme de Kawamoto</td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Sakura Finetek</td><td>781001A0107</td><td></td></tr><tr><td>Histo-Clear</td><td>NDS</td><td>HS-200</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>DOJINDO</td><td>340-00433</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina&nbsp;</td><td>wako</td><td>131-09665</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>wako</td><td>051-06515</td><td></td></tr></tbody></table>

dissecção da auditivo bulla em ratos pós-natais: isolamento dos ossos do ouvido médio e da análise histológica

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

Na maioria dos mamíferos, ossículos auditivos no ouvido médio, incluindo o martelo, bigorna e estribo, são os menores ossos. Nos ratos, uma estrutura óssea chamada a bula auditiva abriga os ossículos, enquanto a cápsula auditiva envolve o ouvido interno, ou seja, a cóclea e canais semicirculares. ossículos murino são essenciais para a audição e, portanto, de grande interesse para os pesquisadores da área de otorrinolaringologia, mas seu metabolismo, desenvolvimento e evolução são altamente relevantes para outros campos. Metabolismo ósseo alterada pode afetar a função auditiva em ratos adultos, e vários ratos gene deficiente mostram mudanças na morfogênese dos ossículos auditivos no útero. Embora ossículos auditivos murino são minúsculos, sua manipulação é viável se se compreende a sua orientação anatômica e estrutura 3D. Aqui, descrevemos como dissecar a bula auditiva e cápsula de ratos pós-natais e em seguida isolar ossículos individuais através da remoção de parte da bula. Nós também discutir como emcama da bolha e da cápsula em orientações diferentes para gerar parafina ou secções congeladas adequados para a preparação de secções longitudinais, horizontais, ou frontais do cabo do martelo. Finalmente, enumerar as diferenças anatômicas entre mouse e ossículos auditivos humanos. Estes métodos seriam úteis na análise dos aspectos patológicos, de desenvolvimento e evolutivas de ossículos auditivos e da orelha média em camundongos.

Este protocolo apresenta um método para isolar ossículos do rato bula auditivo. Em primeiro lugar, a bolha e cápsula são dissecados como uma peça única a partir do crânio (Figura 1). A bula dissecado é então utilizado para preparar o martelo (Figura 2) e a bigorna e estribo (Figura 3). Marcos da bula auditivo e cápsula são o processo styliform na extremidade anterior da bolha, a crista dorsal, do canal semicircular anterior, e a fossa subaquata (Figura 1F). Tomografia (TC) Microcomputed revela ossículos na bula auditiva, bem como as orientações óptimas para seccionamento longitudinal e horizontal desses ossículos (Figura 4). Para realizar o corte de parafina longitudinal do martelo, a bula e cápsula foram descalcificadas em EDTA a 4 ° C durante uma semana, incorporado em um pabloco raffin na orientação mostrada na Figura 4 A - C, seccionados a 4 mm, e em seguida corados com H &amp; E. O martelo ligado à membrana timpânica na bula auditiva revelou ossificação endocondral em curso no P14 (Figura 5A). Para visualizar a nova formação óssea, calceína (30 mg / g de peso corporal) foi peritoneal injetado em um rato P20 e bula e da cápsula foram isolados 24 h mais tarde, no P21. A amostra sem descalcificação foi incorporado congelada e, em seguida, criosseccionada a 6 uM, utilizando uma película adesiva com base no método de Kawamoto 43. Depois de coloração nuclear com DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole), a secção foi observado sob um microscópio de fluorescência. Sinais calceína (verde) revelou neoformação óssea no martelo (m), bula e na cápsula (Figura 5B). Para realizar o corte horizontal do martelo, a bula auditivo isolado a partir de um ratinho com 5 semanas de idade, foi incorporado congelado sem descalcificação (para oOrientação veja a Figura 4D - F), criosseccionada a 6 mm utilizando o método de Kawamoto, e corados com H &amp; E. Corte horizontal da brevis malleal processus (MPB) também mostra a cóclea (Figura 5C). Uma visão medial dos ossículos auditivos certos isolados de um rato P31 mostra características típicas do martelo mouse (ou persa 45 espada-like) manubrium, um processus brevis proeminente (apófise orbicular ou seja, o &quot;delta-gaivota-asa-como&quot; , ver discussão), e a lâmina transversal (Figura 6). Note-se que o processo anterior (processus anterior) foi fracturada no procedimento de dissecção em torno do goniale e foi separada a partir do anel timpânica (ectotimpánico). Esta amostra representativa exibe uma joint incudomalleolar intacta entre o martelo ea bigorna, enquanto a joint incudostapedial é deslocado. inserções tendinosas e na mallealprocessos musculares estapedianos são detectáveis (Figura 6A, asteriscos). Figura 6B compara mouse e ossículos auditivos humanos com a mesma ampliação. diferenças entre as espécies, com excepção de tamanho, incluem o seguinte. O manubrium malleal é ala-como em ratos, mas semelhante a um clube em seres humanos. O ângulo entre o eixo anatómico (ou o eixo de rotação, a linha através do processo anterior do martelo e a curta da bigorna) e a fúrcula é muito menor em ratinhos e os dois são quase paralelas, em oposição a aproximadamente perpendicular em seres humanos 6,46-48. Em ossículos humanos, estudos vibrometric revelam que a joint incudo-maleolar é móvel ao invés de funcionalmente fixo 49. O martelo do mouse exibe uma ampla, fina e plana da lâmina transversal não aparente em humanos 47. Em ratinhos, o anterior processus funde a ossos membranosos, ou seja, a goniale e o tímpanoC anel, enquanto que em humanos a anterior processus é reduzida a um pequeno espícula de osso 41. O estribo de ratos e seres humanos também é diferente: em ratos, o crus anterior é curvo e crus posterior é mais direto ao passo que nos seres humanos, o crus anterior é mais direto do que o crus posterior. Vale a pena notar que a cabeça do martelo em relação ao tamanho do corpo é maciçamente ampliado em espécies como a toupeira de ouro, o que demonstra variabilidade significativa nas relações alométricas de &quot;os mais pequenos&quot; ossos 48. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig1.jpg" /> Figura 1. Dissecção da Auditivo Bulla e Capsule. (A) O crânio de um rato P31 é dividido em direito e metades esquerda. Um, anterior; P, posterior; G, para a esquerda; R, direita. (B) face medial da metade direita do, cabeça pele cortada. Cx, córtex cerebral; Cb, cerebelo; Bs, brainstem. D, dorsal; V, ventral. (C) Remoção de cérebro com uma pinça. (D) Vista medial da cápsula auditiva no crânio direita. A crista dorsal (setas) fica entre a fossa média craniana (mcf) e da fossa posterior do crânio (PCF) e separa dorso-superfícies anterior e ventro-posterior da cápsula auditiva. barra de escala, 2 mm. (E) Maior ampliação da bolha auditiva e da cápsula (vista medial). Co, cóclea; VII, do nervo facial; VIII, vestibulocochlear nervo; AC, anterior (superior) canal semicircular; Sf, fossa subaquata, que abriga o paraflóculo cerebelar. barra de escala, 1 mm. (F) Micrografia da bula auditiva isolada e cápsula (vista medial). Sp, processo styliform. barra de escala, 1 mm. (A - E), rato P31. (F), rato P33. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig2.jpg" /> Figura 2. Dissecção do Malleus. (A) vista ventrolateral de uma bolha auditiva direita e cápsula. O sulco timpânico (ST, a seta a tracejado) é o local de ligação da membrana timpânica. O lateral do osso para o ST é parte do ouvido externo, e medial óssea para o ST forma o fundo da cavidade do ouvido médio. Um, anterior; P, posterior; D, dorsal; V, ventral. (B) Vista após a remoção do canal auditivo externo para revelar a membrana timpânica (TM), incluindo os pars flácida (PF) e pars tensa (PT). (C) A remoção de partes do osso timpânico (linhas pontilhadas e #) perto do malleal processus brevis (MPB). m, martelo; mM, manubrium malleal. A seta, bolha de ar na cavidade do ouvido médio pode ser visto através da membrana timpânica. (D) do martelo exposto. cabeça do martelo é indicado. Pontilhadolinha indica a superfície articular da bigorna. (E) tendão do músculo tensor do tímpano (TT) ligado ao cabo do martelo. (F) O tensor do tímpano é puxado quando o martelo é levantado. *, Processo muscular. (L) tensor do tímpano é cortada usando uma agulha. (H) três ossículos auditivos após a remoção da membrana timpânica. A joint incudo-maleolar é deslocado. m, martelo; i, bigorna; s, estribo; Vá, goniale (fundido com o anel martelo e timpânica, TR). Todas as barras de escala, de 0,5 mm. (A, H), rato P33. (B - G), rato P31. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig3.jpg" /> Figura 3. Dissecção da bigorna e estribo. (A) Incus eestribo após a remoção do martelo. A artéria estapediano (SA) passa através do estribo (s). A linha pontilhada indica a superfície articular da bigorna. Note-se que o curto crus (ICB, crus breve) da bigorna (I) é fixado pelo ligamento cruzado posterior (não mostrado). Asterisk, o processo muscular do estribo. (B) do estribo após a remoção da bigorna. ponta da agulha é usada para cortar a artéria estapediana (SA). Seta, direção do fluxo sanguíneo. A linha pontilhada indica a superfície articular do estribo. (C) A artéria estapediana é removido a partir do estribo. X indica a extremidade cortada da artéria estapédico (SA). (D) A janela oval (Ow, fenestra ovalis ou vestibuli fenestra) é visível após a remoção do estribo. RW, janela redonda (rotunda fenestra ou cochleae fenestra). Barras de escala, de 0,5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta</a>figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig4.jpg" /> Figura 4. Orientação do Auditivo Bulla e Capsule durante Incorporação para Longitudinal (parasagittal, A - C) e horizontal (D - E) Seccionamento do Malleus. (A - C) O pescoço e transversal lâmina do martelo está colocada paralelamente ao fundo do prato de incorporação. (A) Vista lateral: Imagem micro-CT para mostrar a incorporação do martelo direita na bula (pseudocolored azul). O martelo e bigorna são pseudocolored verde. A linha a tracejado, o plano de corte desejado. linha sólida, parte inferior da incorporação de prato. m, martelo; pontas de seta, dorsal da crista. M, medial; G, lateral; D, dorsal; V, ventral. (B) Vista de cima: imagem Micro-CT. Note-se que a extremidade anterior da (processo styliform) bolha foi removida. i, bigorna. (C) Vista de cima: micrografia (tomado com umafiltro de cor). AC, anterior (superior) canal semicircular; Sf, fossa subaquata; Sp, processo styliform. Um, anterior; P, posterior; D, dorsal; V, ventral. (D - F) O brevis processus do martelo é colocado perpendicular ao fundo do prato de incorporação. (D) Vista lateral: Imagem Micro-CT para mostrar a incorporação do martelo direita. A linha a tracejado, o plano de corte desejado. linha sólida, parte inferior da incorporação de prato. (E) Vista de cima: imagem Micro-CT. mM, manubrium malleal. (F) acima Ver: micrografia (tomado com um filtro de cor). Barras de escala, de 1 mm. Imagens micro-TC foram obtidos a uma resolução do voxel de 5 um, tal como descrito anteriormente 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig5.jpg" /> Figura 5. Histologia. (A) coloração de H &amp; E. Longitudinal (parasagittal) seção do martelo parafinado direita (m) na bula auditiva (linha pontilhada) no P14. TM, membrana timpânica. Rotulagem óssea (B) calceína. corte longitudinal do, martelo congelada descalcificada esquerda (m) na bula auditiva no P21. Contracorante, DAPI. (C) coloração de H &amp; E. secção horizontal do brevis congelado, descalcificadas deixou malleal processus (MPB) na bula auditiva e da cápsula (mouse com 5 semanas de idade). Co, cóclea. Barras de escala, de 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig6.jpg" /> Figura 6. Medial Vista do Auditivo ossículos. (A) ossículos auditivos direito de P31 mouse. Um, anterior; P, posterior; D, dorsal; V, ventral. barra de escala, 1 mm. malleus cabeça (Caput mallei, Capitulum mallei); pescoço (Collum mallei); lâmina (lâmina transversal); mM (Manúbrio mallei); asterisco preto (processo muscular do martelo); MPa (Processus anterior, Processus gracilis); MPB (processus brevis); corpo da bigorna (Corpus incudis); ICB (breve Crus, short crus, processo curto); ICL (longum Crus, muito crus, processo longo); IPL (lenticularis Processus, processo lenticular, Sylvian apófise); cabeça do estribo (Caput stapedis); asterisco branco (processo muscular do estribo); SCA (anterius Crus, crus anterior); SCP (Crus posterius, crus posterior); base (stapedis Base, platina); SOF (forame obturador, forame intercrural). (B) ossículos auditivos direito de um 76-year-old fêmea humana (cortesia do Departamento de Anatomia da Faculdade Universidade Keio de Medicina). Os ossículos do rato P31 (inferior direito) são gravadas com a mesma ampliação que o utilizado para ossículos humanos. Curvsetas ed indicar o ângulo entre o eixo anatômico eo manubrium (linhas pontilhadas). barra de escala, 2 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Apresentamos um protocolo para isolar a bula auditiva, a cápsula e os ossículos de camundongos pós-natais para análise histológica e de montagem inteira.

Dissecção da Auditivo Bulla em ratos pós-natais: Isolamento dos ossos do ouvido médio e da análise histológica

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

O objetivo geral do procedimento de dissecção é isolar a bolha auditiva e a cápsula, seguidas pelos ossículos auditivos individuais de camundongos pós-natais para várias análises histológicas e de montagem total. Este método pode ser usado para abordar questões-chave no campo da biologia da ferida, como mecanismos de morfogênese pobre, ossificação endocondral ou metabolismo mineral deficiente. Este método é baseado no conhecimento profundo dos detalhes anatômicos.Geralmente, indivíduos novos no camundongo como sistema biológico podem ter dificuldades, porque seu conhecimento do ouvido médio humano pode não ser aplicável à contraparte do camundongo. Demonstrando o procedimento estará Ayako Sakamoto, técnica do meu laboratório. Comece colocando a bolha auditiva e a cápsula com o osso do crânio circundante em uma placa de amostra contendo solução salina tamponada com fosfato pH 7.4 à temperatura ambiente.Sob um microscópio de dissecação binocular, identifique os ossos do crânio ao redor da cápsula auditiva, conforme mostrado aqui. Use um conjunto de pinças para segurar o crânio ao redor e um segundo conjunto para afastar o osso basefenóide e occipital. Em seguida, use a pinça para puxar suavemente os ossos interparietal e parietal para longe da cápsula e removê-los quando estiverem totalmente soltos.Em seguida, puxe o esquamosal para longe da bula e da cápsula e retire suavemente o osso e os tecidos moles. Em seguida, segure a orelha externa e vire a amostra para revelar o lado medial. Em seguida, gire a amostra 180 graus, segure a cápsula e puxe os tecidos moles restantes.A crista dorsal agora é visível. Nesse ângulo, os nervos facial e vestíbulo-coclear no canal auditivo interno, fossa subarqueada e canal semicircular anterior são claramente visíveis. Quando a crista dorsal é inclinada em direção ao fundo da placa de dissecção, a bolha auditiva é claramente vista.Se a preparação for ligeiramente inclinada, o martelo é visível dentro da bula. Comece usando uma pinça para fraturar o canal auditivo externo acima do martelo e lateral ao sulco do tímpano. Crie uma segunda fratura anterior à primeira.Em seguida, remova o pedaço do canal auditivo externo para que a membrana timpânica fique visível. Em seguida, remova parte da membrana timpânica e do osso timpânico próximo ao processo curto do maleal, tanto nas paredes ventral quanto posterior. O martelo, a bigorna, o estribo e o músculo tensor do tímpano devem agora ser expostos.Levante o martelo e corte o músculo tensor do tímpano com a borda chanfrada de uma agulha de calibre 27. Observe que o manúbrio maleal se liga firmemente à membrana timpânica, como é visto em outros mamíferos. Deslocar o martelo da bigorna na articulação ossicular fraturando o processo anterior do martelo no goniale.Isole o martelo da bolha auditiva usando uma pinça. Remova a maior parte da bolha auditiva para expor a bigorna e o estribo. Em seguida, use a borda chanfrada de uma agulha de calibre 27 para cortar o ligamento posterior da bigorna na crista curta.Isole a bigorna usando uma pinça. Corte a artéria estapedial perto do estribo com a borda chanfrada de uma agulha de calibre 27. Gire a amostra para que a janela redonda fique posicionada na parte inferior.Em seguida, insira uma agulha de costura no forame obturador do estribo e levante o estribo. Depois de remover o estribo, a abertura da janela oval deve ser claramente visível. Use a agulha de calibre 27 para empurrar o estribo para fora da agulha de costura.Para iniciar a incorporação do tecido, primeiro use uma tesoura para cortar o processo estiliforme na extremidade anterior da bula. O martelo e a crista dorsal são visíveis através da porção cortada. Mergulhe a bula e a cápsula em 1-2% de paraformaldeído em PBS.Se o ar estiver preso na bula, remova-o usando uma agulha e uma seringa. Deixe a bula e a cápsula no fixador a quatro graus Celsius durante a noite em um rotador de tubo. No dia seguinte, lave a bula e a cápsula rapidamente em PBS.Em seguida, mergulhe imediatamente em composto líquido de inclusão criogênica a quatro graus Celsius. É comum que bolhas de ar se formem no composto de crio-incorporação ao nível do ouvido médio e externo. Remova a bolha de ar do ouvido médio por aspiração por agulha.Use a mesma técnica para a bolha de ar no ouvido externo. Uma vez removidas todas as bolhas de ar, oriente o tecido de acordo com o tipo de cortes a serem obtidos. O tecido pode então ser incorporado em blocos congelados antes do seccionamento.Esta imagem mostra a coloração H e E de uma seção longitudinal de parafina do martelo descalcificado, indicada pela letra M, e a bolha auditiva e a cápsula de um camundongo P14. A membrana timpânica é indicada pela letra TM. Esta imagem mostra a marcação óssea de cálcio de uma seção longitudinal de martelo não descalcificado congelado, indicada pela letra M, e a bolha auditiva de um camundongo P21. Os sinais verdes de cálcio revelam nova formação óssea no martelo, na bula e na cápsula.Uma vez dominada a técnica, a bolha auditiva e a cápsula podem ser isoladas em dez minutos se o procedimento for realizado corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão das orientações anatômicas dos ossículos auditivos e da bolha do camundongo, que foi descrita no texto principal.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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