Dissecção da Auditivo Bulla em ratos pós-natais: Isolamento dos ossos do ouvido médio e da análise histológica

O objetivo geral do procedimento de dissecção é isolar a bolha auditiva e a cápsula, seguidas pelos ossículos auditivos individuais de camundongos pós-natais para várias análises histológicas e de montagem total. Este método pode ser usado para abordar questões-chave no campo da biologia da ferida, como mecanismos de morfogênese pobre, ossificação endocondral ou metabolismo mineral deficiente. Este método é baseado no conhecimento profundo dos detalhes anatômicos.

Geralmente, indivíduos novos no camundongo como sistema biológico podem ter dificuldades, porque seu conhecimento do ouvido médio humano pode não ser aplicável à contraparte do camundongo. Demonstrando o procedimento estará Ayako Sakamoto, técnica do meu laboratório. Comece colocando a bolha auditiva e a cápsula com o osso do crânio circundante em uma placa de amostra contendo solução salina tamponada com fosfato pH 7.4 à temperatura ambiente.

Sob um microscópio de dissecação binocular, identifique os ossos do crânio ao redor da cápsula auditiva, conforme mostrado aqui. Use um conjunto de pinças para segurar o crânio ao redor e um segundo conjunto para afastar o osso basefenóide e occipital. Em seguida, use a pinça para puxar suavemente os ossos interparietal e parietal para longe da cápsula e removê-los quando estiverem totalmente soltos.

Em seguida, puxe o esquamosal para longe da bula e da cápsula e retire suavemente o osso e os tecidos moles. Em seguida, segure a orelha externa e vire a amostra para revelar o lado medial. Em seguida, gire a amostra 180 graus, segure a cápsula e puxe os tecidos moles restantes.

A crista dorsal agora é visível. Nesse ângulo, os nervos facial e vestíbulo-coclear no canal auditivo interno, fossa subarqueada e canal semicircular anterior são claramente visíveis. Quando a crista dorsal é inclinada em direção ao fundo da placa de dissecção, a bolha auditiva é claramente vista.

Se a preparação for ligeiramente inclinada, o martelo é visível dentro da bula. Comece usando uma pinça para fraturar o canal auditivo externo acima do martelo e lateral ao sulco do tímpano. Crie uma segunda fratura anterior à primeira.

Em seguida, remova o pedaço do canal auditivo externo para que a membrana timpânica fique visível. Em seguida, remova parte da membrana timpânica e do osso timpânico próximo ao processo curto do maleal, tanto nas paredes ventral quanto posterior. O martelo, a bigorna, o estribo e o músculo tensor do tímpano devem agora ser expostos.

Levante o martelo e corte o músculo tensor do tímpano com a borda chanfrada de uma agulha de calibre 27. Observe que o manúbrio maleal se liga firmemente à membrana timpânica, como é visto em outros mamíferos. Deslocar o martelo da bigorna na articulação ossicular fraturando o processo anterior do martelo no goniale.

Isole o martelo da bolha auditiva usando uma pinça. Remova a maior parte da bolha auditiva para expor a bigorna e o estribo. Em seguida, use a borda chanfrada de uma agulha de calibre 27 para cortar o ligamento posterior da bigorna na crista curta.

Isole a bigorna usando uma pinça. Corte a artéria estapedial perto do estribo com a borda chanfrada de uma agulha de calibre 27. Gire a amostra para que a janela redonda fique posicionada na parte inferior.

Em seguida, insira uma agulha de costura no forame obturador do estribo e levante o estribo. Depois de remover o estribo, a abertura da janela oval deve ser claramente visível. Use a agulha de calibre 27 para empurrar o estribo para fora da agulha de costura.

Para iniciar a incorporação do tecido, primeiro use uma tesoura para cortar o processo estiliforme na extremidade anterior da bula. O martelo e a crista dorsal são visíveis através da porção cortada. Mergulhe a bula e a cápsula em 1-2% de paraformaldeído em PBS.

Se o ar estiver preso na bula, remova-o usando uma agulha e uma seringa. Deixe a bula e a cápsula no fixador a quatro graus Celsius durante a noite em um rotador de tubo. No dia seguinte, lave a bula e a cápsula rapidamente em PBS.

Em seguida, mergulhe imediatamente em composto líquido de inclusão criogênica a quatro graus Celsius. É comum que bolhas de ar se formem no composto de crio-incorporação ao nível do ouvido médio e externo. Remova a bolha de ar do ouvido médio por aspiração por agulha.

Use a mesma técnica para a bolha de ar no ouvido externo. Uma vez removidas todas as bolhas de ar, oriente o tecido de acordo com o tipo de cortes a serem obtidos. O tecido pode então ser incorporado em blocos congelados antes do seccionamento.

Esta imagem mostra a coloração H e E de uma seção longitudinal de parafina do martelo descalcificado, indicada pela letra M, e a bolha auditiva e a cápsula de um camundongo P14. A membrana timpânica é indicada pela letra TM. Esta imagem mostra a marcação óssea de cálcio de uma seção longitudinal de martelo não descalcificado congelado, indicada pela letra M, e a bolha auditiva de um camundongo P21. Os sinais verdes de cálcio revelam nova formação óssea no martelo, na bula e na cápsula.

Uma vez dominada a técnica, a bolha auditiva e a cápsula podem ser isoladas em dez minutos se o procedimento for realizado corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão das orientações anatômicas dos ossículos auditivos e da bolha do camundongo, que foi descrita no texto principal.