Name: Isolamento e caracterização de microvesículas a partir de sangue periférico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Aprenda a isolar e caracterizar microvesículas de sangue periférico usando citometria de fluxo e Western Blot. Este método rápido permite analisar subpopulações de vesículas para identificar biomarcadores tumorais.

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Os autores agradecem a Meike Schaffrinski pela excelente assistência técnica. Gostaríamos de agradecer às seguintes pessoas por sua ajuda na coleta de amostras de sangue periférico (todas do Centro Médico Universitário de Göttingen): Henrietta Vida (Departamento de Medicina Transfusional), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Departamento de Cirurgia Geral, Visceral e Pediátrica), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Departamento de Neurocirurgia), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Departamento de Otorrinolaringologia, Cirurgia de Cabeça e Pescoço), bem como todos os colaboradores da oncologia interdisciplinar de curta duração. Agradecemos a Dirk Wenzel (Instituto Max Planck de Química Biofísica, Göttingen) por sua ajuda com a microscopia eletrônica de MVs. 
O estudo foi financiado pelo projeto MetastaSys do Ministério Alemão de Educação e Pesquisa (BMBF) (concessão nº 0316173), bem como pelo German Cancer Aid (concessão nº 109615).

Todos os experimentos, incluindo seres humanos foram aprovados pelo comitê de ética local (aprovação no. 3/2/14). Para a escolha dos pacientes deve-se notar que diversos fatores, tais como idade, sexo, regimes terapêuticos atuais e muitos mais podem influenciar a composição MV no sangue e, portanto, devem ser levados em consideração antes da coleta da amostra 22,23. 1. Preparação de amostras de plasma <ol><li> Desenhe 1 - 2 tubos de sangue por doador, através de uma agulha de borboleta de calibre 21 em um tubo vacutainer colheita de sangue contendo EDTA (1,6 mg / mL de sangue). Certifique-se de inverter o tubo (s) várias vezes para garantir anticoagulação sangue eficiente. NOTA: O volume recomendado de sangue por citometria de fluxo e posterior análise de Western Blot é de 5 - 15 mL. A fim de evitar a degradação e perda de MV, as amostras de sangue deverão ser manuseados &lt;30 min após a retirada do sangue. </li><li> Preparar as amostras de plasma por centrifugação das amostras durante 15 minutos a 1200 xg àtemperatura ambiente (RT). </li><li> Aplicar um filtro de válvula, a fim de ajudar a separação de plasma (= camada superior) do restante células do sangue (= camada inferior). </li><li> Transfira o plasma para um tubo de 15 mL. </li><li> Centrifugar durante 15 minutos a 1500 xg, temperatura ambiente para sedimentar os detritos celulares e maiores remover plaquetas remanescentes. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo de 15 ml e proceder diretamente com amostras de isolamento ou de loja MV para até 6 meses a -20 ° C. NOTA: O protocolo apresentado também pode ser usado para isolar e (MVs Exos) a partir de sobrenadantes de cultura de células. A fim de fazer isso, cultivar as células a 60 - 80% de confluência, durante 24 - 48 h em meio de cultura suplementado com FCS a depleção de vesícula, e em seguida, recolher o sobrenadante. Centrifugar durante 5 minutos a 750 xg, a 4 ° C para destruir as células flutuantes residuais, encher o sobrenadante para um novo tubo de 15 ml e centrifugar de novo durante 5 min a 1500 xg, 4 ° C para sedimentar os detritos celulares maior. Este sobrenadante pode então ser usado para o isolamento de MVstal como descrito no Passo 2,1-2,16. </li></ol> 2. Isolamento de MVs <ol><li> Transfira a amostra de plasma num tubo de centrifugação adequado. Se necessário, encher tubo com PBS, a fim de diluir a amostra e evitar o colapso de tubos de paredes finas durante o processo de centrifugação. </li><li> Centrifugar durante 35 minutos a 14000 xg, 4 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante, mantenha tubos virou de cabeça para baixo e coloque sobre uma toalha de papel. Espera 3-5 minutos até que todo o restante sobrenadante foi embebido na toalha e assim removido a partir da amostra. </li><li> Ressuspender o sedimento em MV 1000 ul de PBS, transferido para um tubo de 1,5 mL e centrifuga-se durante 35 min a 14000 xg, a 4 ° C numa centrífuga de mesa. </li><li> Aspirar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento MV em 50-500 ul de PBS, dependendo do tamanho do pelete. Alternativamente, lisam MVs directamente, por exemplo, em tampão de RIPA (NaCl 150 mM / 0,1% SDS / 0,5% de Na-desoxicolato / 1% de Triton X-100 / Tris 50 mM, pH 7,2)para análise de Western Blot subsequente. MVs armazenar a -20 ° C. Eles vão permanecer estável durante vários meses, mas evitar congelamento e descongelamento ciclos repetidos. </li><li> Opcional: Determinar a concentração de proteína MV com um ensaio de proteína (por exemplo, Bradford ou método de Lowry), a fim de avaliar o rendimento mV ou dosear MVS para experiências subsequentes. </li><li> Se Exos adicionais são para ser isolado a partir das amostras de plasma, decanta-se o sobrenadante a partir do passo 2.3 para um tubo de ultracentrifugação e centrifuga-se durante 2 h a 110.000 xg, 4 ° C. Decantar o sobrenadante tal como descrito no passo 2.3, ressuspender Exo sedimento em 1000 uL de PBS e transferir para pequenas (1,5 ml) tubos de ultracentrifugação. <ol><li> Ultracentrífuga durante 2 h a 110.000 xg, 4 ° C, o sobrenadante aspirado e ressuspender o pellet em Exo 50-75 ul de PBS ou tampão RIPA. </li></ol></li></ol> 3. Caracterização de MVs por citometria de fluxo <ol><li> Transferir 15 uL de PBS + 1% de soro fetal de vitelo empobrecido de vesículas (FCS) num tubo de citometria de fluxo. NOTA: vesículas com FCS empobrecido é preparado por centrifugação inactivado pelo calor (30 min a 56 ° C) de FCS durante 18 h a 110000 xg e filtração do sobrenadante através de um filtro de 0,2 um, tal como descrito anteriormente 24. </li><li> Adicionam-se 5 ug (em caso de baixos rendimentos 3 ig), são igualmente aplicáveis ​​de MVs em PBS. </li><li> Incubar as amostras durante 30 min à temperatura ambiente, a fim de bloquear os sítios de ligação não específicos na superfície de MV e, assim, reduzir a coloração de fundo. </li><li> Adicionar um anticorpo marcado por fluorescência contra o interesse da proteína-de-. Titula-se a quantidade de anticorpo utilizada para a mancha, antes da utilização, a fim de determinar a concentração óptima e garantir uma ração baixo sinal-para-ruído. Certifique-se também incluir um tubo com MVs não coradas como controlo negativo e um tubo de MVs coradas com o anticorpo de controlo de isotipo correspondente à mesma concentração (por exemplo, se 1 ug de anticorpo é utilizado, também utilizar um ug do um controlo de isotipotibody) para quantificar a coloração de fundo. NOTA: Também é possível realizar fluxo multicolor citometria adicionando vários anticorpos acoplados a diferentes fluorocromos. </li><li> Incubar durante 20 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Adicionar 250 mL PBS e proceder com a medição da amostra usando um citômetro de fluxo. <ol><li> No caso de amostras que não pode ser medida de imediato, adicionar 150 ul de PBS e 50 uL de 4% de paraformaldeído (PFA) para fixar as amostras e armazenar a 4 ° C. CUIDADO: PFA é tóxico. Use luvas e equipamento de protecção individual adequado. </li></ol></li><li> Reduzir o limiar do citômetro de fluxo para o valor mais baixo possível e procurar a população MV usando uma dispersão para a frente (FSC) versus dispersão lateral (SSC) enredo em escala logarítmica. Porta na população MV e avaliar o sinal de fluorescência em um histograma correspondente. </li></ol> 4. Caracterização de MVs por Western Blotting <ol><li> Ressuspender o sedimento em MV directamenteum tampão de lise apropriado (por exemplo, tampão de RIPA). <ol><li> No caso de o sedimento MV já foi ressuspenso em PBS, diluir, pelo menos, 1: 1 num tampão de lise apropriado (por exemplo, tampão de RIPA). </li></ol></li><li> Determinar a concentração de proteína da amostra MV, por exemplo, por ensaio de Lowry. </li><li> Preparar 10-20 ug de MVs em 22,5 ul de tampão RIPA. Em seguida, adicionar 7,5 mL de 4x tampão de carga Laemmli e calor durante 5 minutos a 95 ° C. </li><li> Carregar as amostras sobre um gel de poliacrilamida e realizar electroforese e imunotransf erência de acordo com protocolos padrão. </li><li> Depois de transferir as proteínas para a membrana, realizar uma coloração de Ponceau como um controlo de carregamento de acordo com protocolos padrão. </li><li> membrana Destain em TBST durante 5 min à TA. </li><li> Bloco de membrana durante 30 min até 1 h, à RT, em 5% de BSA em TBST. </li><li> Incubar membrana com o anticorpo primário a 4 ° C durante a noite ou durante 2 h à TA. </li><li> Lava-se a membrana com TBST 3 x 5 min.</li><li> Incubar membrana com o anticorpo secundário acoplado a HRP a uma diluição de 1: 10000 em BSA a 5%. Nota: Em caso de sinais de alta fundo, use leite em pó em vez de BSA. </li><li> Lava-se a membrana com TBST 3x 5 minutos. </li><li> Desenvolver membrana com um reagente de detecção ECL e detecção de sinais de quimioluminescência em filmes ou um sistema de imagem de quimioluminescência. NOTA: No fim de discriminar MVs de Exos, proteínas como Tubulin, actinina-4 ou mitofilin pode ser usado que deve ser, sobretudo, presente no MVs 16,25. Prestar atenção que os anticorpos mais tetraspaninas (por exemplo, CD9, CD81), utilizados como marcadores para Exos, não funcionam sob condições redutoras e deve, portanto, ser preparados em tampão não redutor de carga seguido por aquecimento durante 10 min a 70 ° C. </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

<html> Estudos recentes sobre EVs no sangue demonstraram que a composição e as contagens EV mudar durante a causa de várias doenças. Portanto, a análise e posterior caracterização destas EVs são de grande interesse para avaliar melhor a sua utilização potencial como biomarcadores da doença para diagnóstico e prognóstico ou para avaliar as respostas de terapia. O protocolo apresentamos aqui permite o isolamento de vesículas com um diâmetro de até 600 nm, que não contêm quaisquer organelos celulares. Estas observações estão em consonância com a actual definição de MVs e excluir a presença de corpos apoptóticos 2. Usando a técnica Western Blot, fomos capazes de demonstrar que as MVs isolados mostram uma elevada expressão da tubulina, enquanto que os tetraspanins CD9 e CD81 que são frequentemente usados ​​como marcadores Exo foram apenas ligeiramente expressa. Isto confirma que MVs diferem de Exos e se encaixa a recente caracterização em profundidade e comparação de ambas as populações EV por proteômica 25. conteúdo &quot;&gt; Durante a aquisição de amostras de sangue, é crítico para manter o tempo entre a punção venosa e preparação plasma tão curto quanto possível, a fim de evitar a degradação do MV. Além disso, o armazenamento prolongado de amostras de sangue pode levar à activação de células de sangue causando reforçada MV derramamento e, finalmente, a apoptose, que resulta na libertação de corpos apoptóticos. Outra consideração importante para o isolamento MV é para evitar contaminações de preparações MV com proteínas do plasma ou Exos menores. Portanto, é essencial para remover tanto do sobrenadante quanto possível depois de girar para baixo MVS a 14000 x g. uma vez que o sedimento é normalmente visível e firmemente fixado à parede do tubo, o sobrenadante pode ser facilmente removido com uma ponta de pipeta. Em contraste com Exos que tendem a formar agregados durante a preparação por ultracentrifugação alta velocidade e são muitas vezes difíceis para voltar a suspender, este problema não ocorre com MVs. Nosso estudo mostra que é possible para caracterizar subpopulações MV presentes no sangue por citometria de fluxo. Embora o limite de detecção da maioria dos citómetros de fluxo é de cerca de 200-300 nm, o MVS foram reprodutivelmente medido no dador, bem como amostras de cultura de células com os mesmos parâmetros de análise e portões que permitiram claramente a sua distinção de sinais de fundo. É importante verificar antes das medições que o PBS usado para as análises não contém quaisquer partículas contaminantes que poderiam causar um fundo elevado durante a citometria de fluxo (Figura 3). Embora alguns MVs menores não pode ser capturado numa abordagem por citometria de fluxo, verificou-MVs de todas as principais populações de células do sangue (por exemplo, plaquetas, glóbulos vermelhos, leucócitos, células endoteliais). Em nossas análises usamos marcadores padrão para as diferentes células do sangue que tenham sido previamente encontrados no MVS 26 - 29. Deve notar-se que, a fim de obter os melhores resultados possíveis por citometria de fluxo, tele quantidade e a concentração de todos os anticorpos devem ser tituladas numa amostra MV expressando o antigénio de interesse. Se subpopulações MV específicos no sangue devem ser identificados com maior especificidade, é possível realizar a coloração dupla contra dois antigénios diferentes presentes nos respectivos MVs e considerar apenas todas as MVs duplamente positivas para posterior análise 23. Atualmente, existem esforços para definir uma escala padrão de subpopulações de MT no sangue de indivíduos saudáveis 23,30. Estes estudos já demonstraram que MVs derivados de plaquetas constituem a maior população de MVs no sangue que está em correspondência com as nossas observações. Uma vantagem da citometria de fluxo para caracterizar amostras de MT é que este método já está bem estabelecida para fins de diagnóstico, na maioria dos centros clínicos que permitam o possível uso de MVs como biomarcadores no diagnóstico clínico diárias. Estudos anteriores sobre EVs no sangue que têm na sua maioria focoed em Exos menores, dependem tanto procedimentos de classificação específicos para analisar selectivamente a população alvo desejado Exo 31,32 ou requerem um (2 dias) Processo de isolamento demorado com acoplamento de Exos a pérolas de látex antes da análise 18. As nossas próprias observações não publicadas sugerem que a análise de citometria de fluxo de MVs de preparações de sangue inteiro mesmo permite a detecção de MVs como MVs derivadas de tumor sem qualquer desses processos de selecção. Tomados em conjunto, o protocolo aqui apresentado permite o isolamento rápido de MVs a partir de amostras de sangue periférico com equipamentos de laboratório padrão e sua qualificação ulterior por citometria de fluxo e Western Blotting. Todo o processo pode ser realizado em cerca de 2 h, o que vai facilitar futuros estudos sobre perfis de MT em sangue de pacientes que são necessárias para avaliar o potencial de MVs como biomarcadores da doença.

Nos últimos anos, muitos estudos in vitro têm demonstrado que vesículas extracelulares (VE) desempenham um papel importante na comunicação intercelular. As células vivas constantemente eliminado vesículas que diferem em tamanho, conteúdo e biogênese. Os EVs melhor estudados são exosomes que se originam a partir do sistema endossomal onde eles são armazenados como vesículas intraluminais em corpos multivesiculares. Uma vez que esta última se fundem com a membrana plasmática, as vesículas contidos são libertados como exossomas (Exos, diâmetro de 30-100 nm 1). A segunda população de EV que ganha cada vez mais atenção nos últimos anos, são grandes microvesículas (MVs, diâmetro de 100 - 1.000 nm), que brotam diretamente da membrana plasmática 2. Ambos os tipos de vesículas estão rodeados por uma bicamada lipídica e contêm ácidos nucleicos, por exemplo, ADN, ARNm ou miARN 3-5, e uma variedade de proteínas que se podem transferir para C vizinhaells. Embora, em geral, a composição de proteína das vesículas reflecte o estado de uma célula de origem, algumas proteínas parecem ser selectivamente orientadas e enriquecido em VE 1. Uma grande interesse de pesquisa é caracterizar EVs de células anormais e doentes, a fim de definir assinaturas EV específicas que possam permitir o uso de EVs como novos biomarcadores. Especialmente no cancro, em que muitas vezes o próprio tumor não é facilmente acessível, biópsias líquidos segmentação VE específicos de tumores no sangue pode permitir a monitoração das respostas terapia ou ajudar a caracterização do tumor primário, sem a necessidade de procedimentos invasivos 6. Na verdade, EVs já foram isolados com sucesso a partir de vários fluidos corporais, incluindo urina 7, 8 CSF, o leite materno 9 ou sangue 10. Vários estudos identificaram alterações nas contagens de EV e composição em diferentes doenças humanas. Por exemplo, em pacientes com sepsia o número de MVs pró-coagulante éaumentou significativamente em comparação com indivíduos saudáveis 11. Também em pacientes com malária cerebral grave um aumento no total de MVs no sangue pode ser observada e contagens de MVs derivados de plaquetas correlacionar com profundidade coma e trombocitopenia 12. Outros estudos relatam números elevados de vesículas derivados do endotélio em doentes com lúpus eritematoso sistémico ou insuficiência cardíaca e, no caso deste último, esta está correlacionada com uma maior probabilidade de eventos cardiovasculares 13,14. Especialmente no câncer, EVs no sangue estão atualmente discutido como novos biomarcadores com valor diagnóstico e prognóstico. Níveis de MVs que expressam proteínas associadas a tumores, tais como MUC-1, EGFR ou FAK parecem ser elevados no sangue de doentes com cancro da mama 15,16. Também para Exos, estudos recentes têm mostrado que Exos derivados do sangue que transportam antígenos específicos do tumor, como glipicano-1 para câncer de pâncreas ou Del-1 para o cancro da mama permitir cedo a doença deproteção com alta especificidade e sensibilidade 17,18. Adicionalmente, o tumor derivada de soro Exos pode conter ADN que pode ser utilizado para a detecção de mutações, tais como KRAS e p53 que sugere a sua utilização para a terapia de previsão 19. Avanços recentes têm mostrado que a análise de Exos no sangue de pacientes com glioblastoma utilizando um chip de microfluidos específica permite a monitorização da terapia 20. Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que a análise de subpopulações de doenças específicas de vesículas dá informações preciosas sobre diagnóstico, prognóstico, bem como as opções terapêuticas e sucesso. No entanto, o isolamento e análise de Exos de sangue é morosa, requer equipamento especial de laboratório e, por conseguinte, ainda não é adequado para o diagnóstico clínico de rotina. Em contraste, o MVS pode ser isolado muito mais rapidamente e, devido ao seu grande tamanho, podem ser facilmente analisadas por citometria de fluxo, sem a necessidade de associá-los a esferas de látex, uma vez que é necessário para Exos 18, 21. Assim, aqui se apresenta um protocolo que pode ser utilizado para o isolamento de MVs padronizado a partir de amostras de sangue e a subsequente caracterização de sub-populações de MT por citometria de fluxo. Este protocolo irá permitir o estudo adicional e caracterização em profundidade de perfis de MT em grandes grupos de pacientes que serão necessários, a fim de utilizar MVS para diagnósticos clínicos diárias.

<table><tbody><tr><td>agulha borboleta (calibre 21)</td><td>Hospira Deutschland GmbH</td><td>490P29201</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino Fração V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td>Para 10x TBS pesar 24,2 g Tris base e 80 g NaCl, ad 1 L H2O e ajustar o pH para 7,6</td></tr><tr><td colspan="4">Para 1x TBS-T misture 100 mL 10x TBS com 900 mL H2O e adicione 1 mL Tween-20</td></tr><tr><td>CD235a-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07792</td><td>use 5 &micro; l para coloração</td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>Beckman Coulter</td><td>7782</td><td>use 5 &micro; l para coloração</td></tr><tr><td>CD62E-PE</td><td>Biolegend</td><td>336008</td><td>usar 0,8 &micro; g para coloração</td></tr><tr><td>CD62P-PE</td><td>Biolegend</td><td>304905</td><td>usar 0,1 &micro; g para coloração</td></tr><tr><td>de anticorpo CD81</td><td>Biolegend</td><td>349501</td><td>1:2.000 em 5% BSA em TBS-T; use condições não redutoras para o anticorpo Western Blotting</td></tr><tr><td>CD9</td><td>Immunotools</td><td>21270091</td><td>1:1.000 em 5% BSA em TBS-T; use condições não redutoras para</td></tr><tr><td>o gerador de imagens de quimioluminescência Western Blotting ImageQuant LAS-4000</td><td>Fujitsu Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DC protein assay kit II</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>5000112</tr><tr><td>reagente de detecção de ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>EDTA vacutainers para coleta de sangue</td><td>Sarstedt</td><td>01.1605.001</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>soro fetal de bezerro (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10091148</td><td>inativado por calor (30 min, 56 &deg; C)</td></tr> <tr><td>filtro 0,22 &micro; m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-camundongo acoplado a HRP</td><td>santa cruz</td><td>sc-2005</td><td>use 1:10.000 em leite em pó a 5% em TBS-T</td></tr><tr><td>HRP-acoplado anticorpo secundário de coelho</td><td>santa cruz</td><td>sc-2004</td><td>use 1:10.000 em leite em pó a 5% em TBS-T</td></tr><tr><td>4x tampão de carregamento Laemmli, Roti-Load 1</td><td>Roth</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>microfífuga SIGMA 1-15K</td><td>Sigma Laborzentrifugen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>leite em pó (bloqueador de grau mata-borrão, leite em pó desnatado)</td><td>BioRad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>multifúgio 3 LR</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>NanoSight Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, sem Ca e Mg</td> Seringa perfusora Pan <td>biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>50 mL</td><td>Braun</td><td>8728844F</td><td></td></tr><tr><td>Solução de coloração Ponceau-S</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A2935,0500</td><td></td></tr><tr><td>rotor Sw32.1 Ti para ultracentrifugação (6 x 17 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rotor TLA-120.2 para ultracentrifugação (10 x 1,5 mL)</td><td>Beckman Tubos de relha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>para citometria de fluxo (5 mL, fundo redondo)</td>Tubos <td>de 352054</td><td></td> <td>BD Biosciences</td></tr><tr><td>para ultracentrifugação (15 mL)</td>Tubos <td>de 344061</td><td></td> <td>Beckman Coulter</td></tr><tr><td>para ultracentrifugação (11 * 34 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo de tubulina</td><td>Millipore</td><td>05-829</td><td>1:5.000 em 5% BSA em TBST</td></tr><tr><td>ultracentrífuga Optima L-80 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultracentrífuga TL-100</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>filtro de válvula Seraplas V15</td><td>Sarstedt</td><td>53,428</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e caracterização de microvesículas a partir de sangue periférico

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

A liberação de vesículas extracelulares (SVE), incluindo as pequenas exossomos-endossomal (Exos, diâmetro &lt;100 nm) e microvesículas derivados de membrana grande de plasma (MVs, diâmetro&gt; 100 nm) é um processo celular fundamental que ocorre em todas as células vivas. Estas proteínas de transporte de vesículas, lípidos e ácidos nucleicos específicas para a sua célula de origem e em estudos in vitro em destaque a sua importância como mediadores de comunicação intercelular. VE foram isolados com sucesso a partir de vários fluidos corporais e, especialmente, os VE no sangue foram identificados como promissores biomarcadores para cancro ou doenças infecciosas. A fim de permitir o estudo de subpopulações MV no sangue, apresentamos um protocolo normalizado para o isolamento e caracterização de MVs a partir de amostras de sangue periférico. MVS são sedimentadas a partir de amostras de plasma anticoagulado com EDTA por centrifugação diferencial e, tipicamente, possuem um diâmetro de 100-600 nm. Devido ao seu tamanho maior, eles podemfacilmente ser estudada por citometria de fluxo, uma técnica que é utilizada rotineiramente em diagnósticos clínicos e está disponível na maior parte dos laboratórios. Vários exemplos de ensaios para as MVs isolado de controlo de qualidade vai ser dada e marcadores que podem ser utilizados para a discriminação de diferentes subpopulações de MT no sangue vai ser apresentado.

A fim de quantificar o rendimento de MVs que podem ser isolados seguindo o protocolo descrito, calculou-se a quantidade de MVs isoladas a partir de amostras de sangue de 10 dadores. O rendimento MV, que foi avaliada num ensaio de proteínas de Lowry, variou de 10 até 30 ^ g, com uma média de 19,2 ug MVs por mL de sangue (Tabela 1). A concentração de partículas determinado por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) variou de 1,66 x 10 9-2,36 x 10 10 com uma média de 5,9 x 10 9 partículas por ml amostra de plasma (Tabela 2). Além disso caracterização das MVs por microscopia eletrônica de transmissão revelou uma população de vesículas com um diâmetro&gt; 100 nm que foram cercados por uma bicamada lipídica e não contêm quaisquer organelos celulares (Figura 1A). NTA confirmou que o tamanho das MVs isolados variou de 100 a 600 nm (Figura 1B) e o tamanho médio foi de 201 MVnm (Figura 1C). A coloração para marcadores típicos de MT e Exo por Western Blotting demonstrado que as MVs isoladas foram positivas para a tubulina e mostrou apenas uma ligeira expressão de CD81 e CD9, enquanto Exos foram negativos para a tubulina e enriquecido em CD9 e CD81 (Figura 2). Análise dos MVs isoladas por citometria de fluxo (Figura 3A) revelaram uma população de vesículas definidas que poderia ser fechado usando os mesmos parâmetros normalmente utilizados para MVS isolados a partir de sobrenadantes de cultura de células e que foi claramente diferente da do sinal de fundo obtido pela medida de PBS + 1% de vesículas com depleção de FCS sem a adição de MVs (Figura 3B). De modo a analisar as diferentes populações MV presentes no sangue, o MVS foram coradas com marcadores estabelecidos para as diferentes populações de células do sangue, por exemplo, CD62P para MVS derivados de plaquetas, CD45 para MVS derivados de leucócitos, para CD235aMVs e CD62E sangue vermelho de células-derivadas para MVS derivadas de células endoteliais (Figura 4). Esta caracterização mostrou que a percentagem de subpopulações MV diferiu entre as amostras de sangue do dador investigados, enquanto a maioria de MVs parecia ser derramado por plaquetas em todas as amostras. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig1.jpg" /> Figura 1: Distribuição do Tamanho de MVs isoladas do sangue periférico. A, isolados MVs foram visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão. B, análise de rastreamento de nanopartículas representativas (NTA) de MVs que ilustram a distribuição de tamanhos das vesículas. C, O tamanho médio MV a partir de 10 preparações independentes foi medida por NTA (média). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver al</a>versão Arger desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig2.jpg" /> Figura 2: Caracterização de MVs isolado por Western Blotting. a expressão da proteína diferencial nas MVs isoladas e Exos de dois doadores foi visualizado por Western Blot. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig3.jpg" /> Figura 3: Análise de MVs por citometria de fluxo. A, MVs são primeiro visualizadas em frente (FSC) versus espalhamento lateral parcelas (SSC) para a porta na respectiva população MV. Subsequentemente, estes são caracterizados MVs para o antigénio de interesse pela<html> utilizando anticorpos marcados com fluorescência dirigidos contra o antigénio. B, o FSC SSC típica contra parcelas para MVS isoladas a partir do plasma de dois dadores. Como comparação, um lote típico para MVS derivadas de células de tumor a partir de células de cancro do pulmão A549, isolado a partir do sobrenadante de cultura de células, bem como um controlo negativo utilizando apenas PBS + 1% de vesículas com depleção de FCS sem MVS são mostradas à direita. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig4.jpg" /> Figura 4: Caracterização de MVs isolado por citometria de fluxo. MVs de três dadores foram caracterizadas para a expressão de marcadores de células de sangue vermelhas estabelecidos (), por citometria de fluxo. Os respectivos controlos isotípicos são mostradas em cinza.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Amostra </td><td> MVs / mL de sangue [g] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 29,4 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> # 3 </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 31,1 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 18.8 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 22,7 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 18,7 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 15,0 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 11,9 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: rendimento de proteína de MV amostras de sangue periférico. </strong&gt; É mostrada a quantidade de MVs por sangue periférico mL que foi elaborada a partir de 10 doadores. MV rendimentos foram quantificados por ensaio de Lowry. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Amostra </td><td> MVs / mL de plasma [contagem de partículas] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 6.42E + 09 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 2.36E + 10 </td></tr><tr><td> # 3 </td><td> 1.88E + 09 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 6.51E + 09 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 3.48E + 09 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 4.57E + 09 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 2.09E + 09 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 1.66E + 09 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 2.54E + 09 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 6.20E + 09 </td></tr></tbody></table> Tabela 2: MV Rendimento de partículas a partir de amostras de sangue periférico. </stRong&gt; MV foram isolados a partir de amostras de plasma de 10 doadores e contagens de partículas foram determinadas por análise de rastreamento de nanopartículas. É mostrado o valor médio de três medidas independentes.

Vesículas extracelulares presentes no sangue têm sido sugeridas como novos biomarcadores para várias doenças. Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento de grandes microvesículas derivadas da membrana plasmática de amostras de sangue periférico e sua posterior análise por citometria de fluxo convencional e Western Blotting.

Isolamento e caracterização de microvesículas a partir de sangue periférico

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Os objetivos gerais deste método são caracterizar e estudar populações de microvesículas derivadas da membrana plasmática no sangue periférico. Microvesículas de pacientes com tumor, são ensaios pró-invasivos e funcionais. Portanto, uma caracterização mais aprofundada fornecerá informações sobre como essas vesículas realmente contribuem para a invasão e metástase.A principal vantagem dessa técnica é que ela permite uma análise relativamente rápida de microvesículas no sangue, sem a necessidade de materiais e equipamentos sofisticados ou caros. Depois de obter um ou dois tubos de sangue de um voluntário em tubos de coleta contendo EDTA, inverta os tubos várias vezes para garantir uma anticoagulação sanguínea eficiente. Dentro de meia hora após a coleta de sangue, centrifugue as amostras e adicione um filtro de válvula aos tubos para ajudar a separar o plasma de qualquer sangue restante.Transferir o plasma para um tubo de 15 mililitros para uma segunda centrifugação. Colher o sobrenadante e transferi-lo para um novo tubo. Adicione PBS, se necessário.Centrifugue o plasma contendo sobrenadante diluído em PBS conforme necessário para coletar as microvesículas. Em seguida, transvase o sobrenadante e coloque os tubos de cabeça para baixo sobre uma toalha de papel por três a cinco minutos. Quando todo o sobrenadante restante estiver embebido na toalha, remova qualquer plasma restante da borda dos tubos e ressuspenda o pellet de microvesícula em um mililitro de PBS.Transfira a solução para um tubo de microcentrífuga 1,5. Em seguida, após a centrifugação, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 50 a 500 microlitros de PBS, dependendo do tamanho do pellet. Em seguida, determine a concentração de proteína da microvesícula com um ensaio de proteína.Para caracterizar as microvesículas por citometria de fluxo, transfira 15 microlitros de PBS, suplementados com FCS depletado de 1% de vesículas para um tubo de citometria de fluxo, seguido de três a cinco microgramas de microvesículas suspensas em PBS. Incube a amostra por 30 minutos em temperatura ambiente para bloquear qualquer ligação inespecífica na superfície da microvesícula. Em seguida, adicione o anticorpo marcado com fluorescência de interesse para uma incubação em temperatura ambiente de 20 minutos no escuro.Em seguida, dilua a amostra em 250 microlitros de PBS fresco e carregue as microvesículas no citômetro de fluxo. Reduza o limiar do citômetro de fluxo para o valor mais baixo possível e pesquise a população de microvesículas usando um gráfico de dispersão direta versus lateral em uma escala logorítmica. Em seguida, faça uma porta ao redor da população de microvesículas e avalie o sinal fluorescente em um histograma correspondente.O rendimento de microvesículas de amostras de sangue de doadores pode ser avaliado no ensaio de proteína de Lowry com rendimentos típicos entre 10 a 30 microgramas de vesícula por mililitro de sangue e uma concentração de partículas variando de 1,66 vezes 10 a 9, a 2,36 vezes 10 a 10, conforme determinado pela análise de rastreamento entre partículas. A caracterização adicional das microvesículas por microscopia eletrônica de transmissão revela uma população de vesículas com diâmetro superior a 100 nanômetros circundadas por uma bicamada lipídica que não contém organelas celulares. A análise de rastreamento de nanopartículas também confirma que o tamanho médio das microvesículas isoladas varia de 100 a 600 nanômetros, com uma média de 201 nanômetros.A coloração para marcadores típicos de microvesículas e exossomos por western blotting demonstra que as microvesículas isoladas do sangue são tipicamente positivas para tubulantes, com uma expressão fraca de CD9 e CD81, enquanto os exossomos são geralmente negativos para tubulantes e são enriquecidos com os outros dois marcadores. A citometria de fluxo revela uma população definida de vesículas derivadas de doadores que podem ser controladas usando os mesmos parâmetros usados para microvesículas isoladas sobrenadantes de cultura de células. Isso também é claramente diferente do sinal de fundo observado para o PBS controlado, complementado com amostras somente de FCS com 1% de depleção de vesículas.A coloração de microvesículas com marcadores estabelecidos para diferentes populações de células sanguíneas revela que a porcentagem de subpopulações de microvesículas difere entre as amostras de doadores de sangue, com a maioria das microvesículas parecendo ser eliminada por plaquetas em todas as amostras. Uma vez dominado, o isolamento de microvesículas e sua subsequente caracterização por citometria de fluxo podem ser realizados em cerca de 2-1/2 horas. A caracterização das subpopulações de microvesículas ajudará a identificar uma assinatura tumoral em pacientes versus controles.Isso pode ser útil como um biomarcador para contradiagnóstico e terapia.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo detalha um método para isolar vesículas extracelulares (SVE), pequenas partículas membranoso liberados a partir de células, a partir de tão pouco como 10 amostras de soro ul. Esta abordagem evita a necessidade de ultracentrifugação, exige apenas alguns minutos de tempo de ensaio, e permite o isolamento de VE a partir de amostras de volumes limitados.

Os dispositivos à base de papel para o Isolamento e Caracterização de Extracelular Vesículas

O líquido biliar é uma fonte valiosa de vesículas/exossomos extracelulares que contêm biomarcadores potencialmente importantes. Este protocolo representa um método robusto para isolar exossomos da bile humana para análises adicionais, incluindo perfis de miRNA.

Isolamento e Caracterização do perfil de exossomas de bílis humana contendo MicroRNA-

Mycobacterium tuberculosis mostra aumento da produção e liberação de vesículas extracelulares em resposta às condições de baixo ferro. Este trabalho detalha um protocolo para gerar condições e métodos baixos de ferro para a purificação e caracterização de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas em resposta à deficiência de ferro.

Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas por ferro

Apresentamos um protocolo simples para o isolamento de células mononucleares de sangue periférico de sangue inteiro obtidos de pacientes diagnosticados com Síndrome de Sézary, seguido pela seleção de células T CD4+, sua estimulação com phorbol12-myristate13-acetato e ionóforo A23187, e preparação de RNA para perfil transcriômico.

Isolando células mononucleares de sangue periféricos humanos e células T CD4+ de pacientes com síndrome de Sézary para perfil transcriômico

O presente protocolo descreve um método para extração de vesículas extracelulares do sangue periférico e tecidos sólidos com posterior perfilamento de antígenos de superfície e cargas proteicas.

Isolamento e Análise de Vesículas Extracelulares Rastreáveis e Funcionalizadas do Plasma e Tecidos Sólidos

O presente protocolo descreve a centrifugação diferencial para isolar e caracterizar EVs representativos (exossomos e microvesículas) de CTMs humanas cultivadas. Outras aplicações desses EVs também são explicadas neste artigo.

Isolamento, Caracterização e Aplicação Terapêutica de Vesículas Extracelulares a partir de Células-Tronco Mesenquimais Humanas Cultivadas

Este artigo descreve uma metodologia para o isolamento, caracterização e quantificação de vesículas extracelulares derivadas de plasma humano (EV) e apresenta um fluxo de trabalho para análise sem marcação do proteoma EV usando cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS).

Isolamento, caracterização e análise proteômica de vesículas extracelulares derivadas de plasma para descoberta de biomarcadores cardiovasculares

Aqui, demonstramos o método de caracterização de vesículas extracelulares (EVs) coletadas de fluidos biológicos, como lágrimas e saliva, de seres humanos. O scanner usado neste método é capaz de detectar o fenótipo, tamanho e contagem total de partículas de EVs a partir de 1 μL da amostra.

Caracterização de Vesículas Extracelulares a partir de Fluidos Biológicos

Este protocolo descreve o isolamento de pequenas vesículas extracelulares de músculos esqueléticos murinos e medula óssea usando digestão enzimática e cromatografia de exclusão de tamanho, permitindo a recuperação reprodutível de frações enriquecidas com vesículas de tecidos estruturalmente complexos e de baixo rendimento para análise molecular posterior.

Isolamento de Pequenas Vesículas Extracelulares do Músculo Esquelético Murino e Medula Óssea por Cromatografia de Exclusão de Tamanho

Aqui, nós descrevemos um protocolo para isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos. Este método compreende mecânico e dissociação enzimática do tecido pulmonar, bem como um processo de purificação passo 2, utilizando anti-PECAM-1 e anti-ICAM-2 anticorpos conjugados com esferas magnéticas, que produz uma população de células endoteliais pura de origem principalmente microvascular.

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Aprenda a isolar e caracterizar microvesículas de sangue periférico usando citometria de fluxo e Western Blot. Este método rápido permite analisar subpopulações de vesículas para identificar biomarcadores tumorais.

Isolamento e caracterização de microvesículas a partir de sangue periférico

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