Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas

O objetivo geral deste procedimento é permitir a análise de parâmetros histológicos e moleculares de cortes adjacentes de um único tecido. Com este método, podemos ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia e doenças do músculo esquelético. Por exemplo, quais são os efeitos regenerativos após lesão muscular e quais são os efeitos da entrega de genes virais por injeção intramuscular?

A vantagem deste método é que os dados histológicos e moleculares podem ser diretamente correlacionados a partir de um único tecido. Isso torna a análise de dados mais eficaz e melhor uso dos tecidos experimentais. Cinco minutos antes de completar as dissecações, resfrie o banho de criopreservação.

Quando as amostras de tecido estiverem prontas para serem incorporadas, aplique primeiro a resina de incorporação no terço inferior até a metade do tecido, onde o músculo encontra a rolha. Isso deve ser feito de forma organizada para reduzir a interferência da resina nas etapas a jusante. Em seguida, solte imediatamente a rolha no banho de 2-metilbutano resfriado a 140 graus Celsius negativos.

Inclua até oito preparações de tecido por lote. No banho, mexa os lenços de papel durante 30 segundos, raspando o fundo do copo para evitar que as rolhas de tecido congelem na solução. Após 30 segundos, usando uma ferramenta de metal, puxe uma rolha de tecido do 2-metilbutano.

Em seguida, remova rapidamente a lamínula de suporte. Passe o excesso de 2-metilbutano de volta no banho e, em seguida, coloque a rolha de tecido no banho externo de nitrogênio. Depois que todos os tecidos forem transferidos para o nitrogênio líquido, mova-os para um recipiente e armazene-os a 80 graus Celsius negativos.

Depois de preparar o criostato e montar uma amostra de tecido, use os controles grossos e finos para avançar a amostra até a lâmina para que ela toque a lâmina. Redefina a soma das espessuras da seção para zero neste ponto. Em seguida, defina o criostato para a função de compensação com espessura de seção em 30 mícrons.

E corte e descarte as seções até a profundidade desejada do tecido. Para coletar criosseções com eficiência para extração de RNA, primeiro abra o tubo de coleta e coloque-o próximo ao suporte da lâmina. Lá, use uma escova limpa e pré-resfriada para pegar cada seção e transferi-la para o tubo.

Seções anteriores do tibial de camundongo de 30 mícrons agrupadas retiradas de 400 a 4.000 mícrons de profundidade de tecido normalmente rendem 25 a 50 miligramas de músculo. Se a incorporação de resina envolver a criossecção, trave o freio de mão e use uma lâmina de barbear para raspar pequenos pedaços de resina até que haja apenas uma camada fina ao redor da parte superior do músculo. Sempre corte a resina com a lâmina inclinada para longe do músculo.

Uma fina camada de resina de incorporação não prejudica substancialmente a extração de RNA a jusante. Se houver resina de incorporação mais espessa, use escovas para afastá-la do músculo antes de mover a criossecção para o tubo de coleta. Durante o processo de secção, quando as seções histológicas são desejadas, redefina a espessura da fatia para sete mícrons usando os controles do criostato.

Em seguida, corte e descarte de quatro a sete seções para obter uma superfície de tecido consistente e uniforme e anote a profundidade desse tecido. Agora, corte uma boa seção e oriente-a na superfície do porta-lâminas. Usando uma lâmina de microscópio em temperatura ambiente, pegue a seção e retorne a lâmina à temperatura ambiente.

Colete todas as seções desejadas e, em seguida, anote a profundidade final do tecido. Depois de concluir o seccionamento, registre rapidamente o peso das criosseções agrupadas para isolamento de RNA. Retorne imediatamente o tubo à câmara do criostato para manter a temperatura das seções próxima a 20 graus Celsius negativos.

Comece transferindo rapidamente as criosseções agrupadas para o gelo e adicionando aproximadamente um mililitro de reagente de extração de RNA orgânico por 50 miligramas de criossecções. Quanto mais cedo o reagente for aplicado, menos o RNA se degrada. Em seguida, usando uma seringa de um mililitro com uma agulha de calibre 18, homogeneizar as criossecções sem fazer muitas bolhas, extraindo repetidamente uma solução e ejetando-a nas paredes do tubo.

Use a ponta da agulha para dispersar pedaços aglomerados. A cada cinco golpes, retorne brevemente a amostra ao gelo para mantê-la fria. Depois de homogeneizado, use uma agulha de calibre 22 para triturar cuidadosamente a amostra usando mais cinco golpes.

Em seguida, retorne a amostra ao gelo. Repita esse processo três ou quatro vezes para obter uma homogeneidade de tecido muito finamente dispersa. Uma vez feito o homogeneizado final, deixe-o incubar por cinco minutos à temperatura ambiente para interromper os complexos moleculares.

Em seguida, em uma capela de exaustão, adicione 0,1 mililitro de BCP por mililitro de reagente de isolamento de RNA. Em seguida, agite o tubo vigorosamente por 15 segundos. Não use um vórtice.

Em seguida, incube a amostra em temperatura ambiente por dois a três minutos. Após a breve incubação, centrifugue a amostra por 15 minutos a 12.000g e quatro graus Celsius. Em seguida, colete cuidadosamente a fase superior clara contendo o RNA.

Transfira-o para um tubo limpo e adicione um volume igual de etanol a 70%, feito em água do mar profunda. Depois de fazer um breve vórtice do tubo, deixe-o incubar por 10 minutos em temperatura ambiente e prossiga seguindo o protocolo de texto. As preparações de RNA do músculo esquelético foram feitas a partir do tibial anterior do camundongo.

Três dias antes, alguns músculos foram injetados com cardiotoxina 10 micromolar e outros com solução salina. A pureza e o rendimento do RNA dessas amostras foram excelentes. O rendimento de RNA foi substancialmente maior nos músculos tibiais anteriores após a lesão da toxina.

A integridade do tecido e a produção de RNA podem ser um fator nessa observação. A persistência da qualidade do RNA preparado foi avaliada usando um microlitro de RNA que foi armazenado a 20 graus Celsius negativos por 18 meses. Bandas proeminentes de RNA ribossômico 18S e 28S ainda são evidentes em amostras que demonstram alta qualidade de RNA.

Cortes de sete mícrons foram corados para expressão de cadeia pesada de miosina embrionária, vista em vermelho. Para detectar fibras regeneradoras, corado para colágeno seis, visto em verde, que delineia as fibras musculares e corado com dappy, em azul, para observar os núcleos. Quando há uma injeção de toxina deficiente, a lesão parece mínima.

Uma injeção de toxina bem-sucedida resulta em uma região muito maior do compartimento muscular alvo sendo afetada. O grau de lesão pode ser usado como critério de inclusão para a análise de RNA. Uma vez dominadas, as seções de corte para extração de RNA e lâmina histológica podem ser concluídas em menos de meia hora para um único tecido.

Após este procedimento, outras colorações histológicas de imunofluorescência podem ser seguidas para responder a uma ampla variedade de perguntas. As criosseções combinadas também podem ser usadas para coletar DNA ou proteína.