Name: Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprenda a técnica de crioseccionamento de regiões contíguas de músculo esquelético de camundongo para análises histológicas e de expressão gênica. Este método permite correlacionar dados moleculares e histológicos de um único tecido.

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Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre e Junna Luan forneceram assistência técnica. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de concessão AR065077. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva do autor e não representa necessariamente as opiniões oficiais do National Institutes of Health.

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A autora declara que não tem interesses financeiros concorrentes.

Para obter os melhores resultados com este método, manter a incorporação de resina restrita ao terceiro ou inferior a metade do músculo durante a criopreservação de tecido porque o excesso de resina vai retardar a recolha dos criocortes reunidas e pode aumentar a incorporação de contaminação resina no isolamento de ARN. Além disso, muita atenção durante a homogeneização da agulha é importante para maximizar o rendimento e minimizar a probabilidade de entupimento da agulha. O protocolo pode ser modificado através da util...

O objetivo desta técnica é fazer várias análises experimentais por diferentes modalidades, como histologia e expressão gênica, acessíveis a partir de um único tecido esquelético pequena fonte muscular. Microscopia aplicações são as mais sensíveis para amostrar os métodos de conservação, que devem ser cuidadosamente controlados para limitar a formação de artefactos de cristais de gelo durante a criopreservação. Assim, o desenvolvimento do método baseia-se no músculo tibial anterior (TA) músculo congelado parcialmente coberto com a incorporação de um banho de resina em 2-metilbutano -140 ° C líquido arrefecido com azoto como o material fonte para microscopia de imunofluorescência e a expressão do gene análises. A necessidade de utilizar o mesmo material de origem de diversas abordagens técnicas é particularmente importante para as experiências com base em injecção intramuscular em que os músculos para a esquerda e direita representam condições diferentes, um experimental e um controlo. Por exemplo, em estudos de regeneração muscular, um muLECS é injectado com uma toxina para causar dano tecidual generalizada enquanto o músculo contralateral serve como controlo injectados com veículo 1. De igual modo, os estudos de terapia génica para doenças musculares começam tipicamente com a validação do vector de terapia genética por injecção intramuscular para ser comparado com o vector vazio, ou vector não relacionado de controlo de veículo no lado contralateral 2. Portanto, não é possível a fonte de cada músculo TA para uma aplicação diferente. As estratégias comuns para lidar com este problema são: i) a utilização de um grupo muscular diferente para cada aplicação, ii) para usar camundongos adicionais, ou iii) para cortar um pedaço do músculo para cada aplicação. No entanto, diferenças significativas entre os grupos musculares tornam difícil comparar os dados de aplicativos separados, e os animais adicionais aumentam despesa e são mal justifica se existem outras alternativas. Dividindo o músculo após a dissecação, a fonte aplicações diferentes é a melhor opção in muitos casos. No entanto, os pedaços de músculo são muitas vezes demasiado pequena para usar pulverização sob azoto líquido ou técnicas de trituração mecânica para homogeneização 2-5. Como o músculo é um tecido altamente estrutural embalado com proteínas da matriz extracelular e contráteis, homogeneização mecânica inadequada leva a um baixo rendimento de DNA posterior, RNA ou proteína. O método descrito aqui permite que pequenas quantidades de tecido de um músculo fonte para uso em múltiplas aplicações, ea inclusão de cryosectioning e agulha trituração melhora homogeneização mecânica para um melhor rendimento de RNA.

<table><tbody><tr><td>Cortiça</td><td>VWR Scientific</td><td>23420-708</td><td>Corte em pequenos quadrados com uma lâmina afiada.</td></tr><tr><td>Lamínula de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td>Usado para orientar o músculo durante o congelamento.</td></tr><tr><td>Termómetro de baixa temperatura</td><td>VWR Scientific</td><td>89370-158</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbutano</td><td>Sigma</td><td>M32631-4L</td><td>Cuidado: produto químico perigoso. Armazene em armário inflamável.</td></tr><tr><td>Resina de incorporação: "criomatrix"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6769006</td><td>Outras resinas de incorporação podem ser substituídas pela criomatrix.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>microm HM550 com suporte de lâmina descartável</td><td>Qualquer criostato de trabalho deve ser suficiente para o protocolo.</td></tr><tr><td>Lâmina de criostato descartável</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3052835</td><td>Use uma lâmina ou faca apropriada para o criostato a ser usado.</td></tr><tr><td>Solução de descontaminação de RNAse: "RNase Zap"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Balança analítica</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>Pincel</td><td>Daler Rowney</td><td>214900920</td><td>Use para manusear criossecções. Pode ser encontrado em lojas com materiais de arte simples.</td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>VWR Scientific</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio</td><td>VWR Scientific</td><td>48311600</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de extração orgânica de RNA: TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Cuidado: O TRIzol é um produto químico perigoso. Nota: Apenas reagentes de extração orgânica são recomendados para extração de RNA do músculo esquelético.</td></tr><tr><td>Agulha de calibre 18</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305185</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de calibre 22</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305155</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de calibre 26</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305115</td><td>Opcional. Pode ser usado para uma terceira rodada de trituração de amostras no protocolo de extração de RNA.</td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>VWR Scientific</td><td>BD309659</td><td>Para amostras de valor muito elevado, recomenda-se uma seringa Luer-Lok (por exemplo, VWR BD309628).</td></tr><tr><td>1-bromo-3-cloropentano (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>Para 70% de etanol em água DEPC: 200 álcool à prova</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>+M18027161M</td><td>Misture 35 ml de álcool 200 proof + 15 ml de água DEPC.&nbsp;</td></tr><tr><td>Para etanol a 70% em água DEPC: água tratada com DEPC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9922</td><td>Misture 35 ml de álcool 200 + 15 ml de água DEPC.</td></tr><tr><td>Kit de purificação de RNA: Minikit de RNA PureLink</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>Etapas finais da preparação do RNA.</td></tr><tr><td>Água livre de DNase/Rnase&nbsp;</td>A água tratada <td>com Gibco</td><td>10977</td><td>DEPC também pode ser usada.</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro: Nanodrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2222</td><td>Trate o RNA purificado para remover qualquer contaminação do DNA antes das aplicações a jusante.</td></tr><tr><td>Caneta hidrofóbica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>PBS para protocolo de imunofluorescência.</td></tr><tr><td>Soro de burro</td><td>Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc</td><td>017-000-121</td><td>Reidrate o estoque normal de soro de burro de acordo com as instruções do fabricante, depois dilua uma alíquota a 5% para imunofluorescência.&nbsp; Soro de cabra normal também pode ser usado.</td></tr><tr><td>anticorpo eMHC</td><td>Universidade de Iowa Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma</td><td>F1.652</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de colágeno VI</td><td>Fitzgerald Industries</td><td>#70R-CR009x</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-coelho AlexaFluor488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IgG1 AlexaFluor546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21123</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6- diamidino-2-fenilindol)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem aquoso: Permafluor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-030-FM</td><td>Use apenas meios de montagem projetados para aplicações fluorescentes com propriedades anti-desbotamento.</td></tr><tr><td>Lamínula de vidro</td><td>VWR Scientific</td><td>16004-314</td><td>Utilização para montagem de lâminas no final do protocolo de imunofluorescência</td></tr><tr><td>Software de análise de imagem: ImageProExpress</td><td>Media Cybernetics, Inc.</td><td>Image-Pro Express ou produtos mais avançados</td><td>Freeware ImageJ também devem funcionar para contagem manual. Softwares mais avançados com capacidades de segmentação podem permitir a automação parcial do processo; por exemplo, ImageProPremier.</td></tr><tr><td>Mesclar e mapear imagens de seção: Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop</td><td></td></tr><tr><td>Cardiotoxina</td><td>Sigma</td><td>C9659</td><td>Sigma C9659 foi descontinuado. Outras opções de cardiotoxina são EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; ou Ge Script # RP17303; mas estes não foram validados.</td></tr><tr><td>kit de transcrição reversa: Sistema de síntese de primeira fita sobrescrito III</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080051</td><td>Podem ser usados quaisquer reagentes de transcrição reversa validados e de alta qualidade.</td></tr><tr><td>PCR padrão: Sistema de polimerase GoTaq Flexi</td><td>Promega</td><td>M8298</td><td>Qualquer sistema de polimerase Taq validado e de alta qualidade pode ser usado. Se o sequenciamento de DNA for usado para qualquer aplicação a jusante da PCR, um sistema de PCR de alta fidelidade deve ser usado.</td></tr><tr><td>SYBR verde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7585</td><td>Para uso em qPCR quando não estiver usando uma mistura mestre de qPCR dedicada. Use com SuperROX (para instrumentos da Applied Biosystems) e polimerase e tampões GoTaq Flexi.</td></tr><tr><td>ROX: SuperROX, 15 mM</td><td>BioResearch Technologies, Inc. Novato CA</td><td>SR-1000-10</td><td>SuperROX é mais estável na reação de PCR, por isso é preferível para uso como um corante de referência passiva qPCR em vez de ROX (carboxi-X-rodamina). Para qPCR com instrumentos da Applied Biosystems</td></tr> PCR <tr><td>em tempo real Applied</td><td>Biosystems</td><td>7900HT</td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning da contíguos regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

Com este método, criosecções consecutivos são coletadas para permitir que ambas as aplicações de microscopia para a histologia do tecido e enriquecimento do RNA para a expressão do gene usando regiões adjacentes a partir de um músculo esquelético único rato. Normalmente, é um desafio para alcançar a homogeneização adequada de amostras de músculo esquelético pequenas porque os volumes de tampão pode ser muito baixa para aplicações de moagem eficientes, mas sem ruptura mecânica suficiente, a arquitetura do tecido denso de limites musculares penetração de reagentes tampão, em última análise, causando baixo rendimento RNA. Seguindo o protocolo aqui relatado, 30 um secções são recolhidas e combinadas permitindo cryosectioning e subsequente homogeneização agulha para mecanicamente perturbar o músculo, aumentando a área de superfície exposta para a penetração tampão. As principais limitações da técnica é que ela exige um criostato, e é relativamente baixa taxa de transferência. No entanto, o RNA de alta qualidade pode ser obtido a partir de pequenas amostras de m reunidascriocortes uscle, tornando este método acessível para muitos músculos esqueléticos e de outros tecidos diferentes. Análises Além disso, esta técnica permite combinados (por exemplo, exame histopatológico dos tecidos e expressão de genes) de regiões adjacentes de um único músculo esquelético de modo que as medições podem ser diretamente comparados entre aplicativos para reduzir a incerteza experimental e para reduzir as experiências com animais replicativas necessárias para obter uma pequena de tecido para múltiplas aplicações.

RNA criocorte muscular está em alta qualidade e proporciona um rendimento suficiente para a maioria das aplicações As análises de dezasseis preparações de ARN do músculo esquelético estão apresentados na Tabela 1, utilizando 19,4 a 41 mg do músculo tibial anterior em pool (TA) a partir de 8 ratinhos de controlo. Tanto para a esquerda (L) e direito (R músculos) TA foram preparados em experiências de regeneração co...

Consecutivos crio-secções são recolhidas para permitir que aplicações histológicas e enriquecimento do RNA para medições de expressão de genes usando regiões adjacentes a partir de um músculo esquelético único rato. RNA de alta qualidade é obtida a partir de 20 - 30 mg de criosecções e medições agrupados serão comparadas diretamente entre aplicativos.

Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

O objetivo geral deste procedimento é permitir a análise de parâmetros histológicos e moleculares de cortes adjacentes de um único tecido. Com este método, podemos ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia e doenças do músculo esquelético. Por exemplo, quais são os efeitos regenerativos após lesão muscular e quais são os efeitos da entrega de genes virais por injeção intramuscular?A vantagem deste método é que os dados histológicos e moleculares podem ser diretamente correlacionados a partir de um único tecido. Isso torna a análise de dados mais eficaz e melhor uso dos tecidos experimentais. Cinco minutos antes de completar as dissecações, resfrie o banho de criopreservação.Quando as amostras de tecido estiverem prontas para serem incorporadas, aplique primeiro a resina de incorporação no terço inferior até a metade do tecido, onde o músculo encontra a rolha. Isso deve ser feito de forma organizada para reduzir a interferência da resina nas etapas a jusante. Em seguida, solte imediatamente a rolha no banho de 2-metilbutano resfriado a 140 graus Celsius negativos.Inclua até oito preparações de tecido por lote. No banho, mexa os lenços de papel durante 30 segundos, ras

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Aprenda a técnica de crioseccionamento de regiões contíguas de músculo esquelético de camundongo para análises histológicas e de expressão gênica. Este método permite correlacionar dados moleculares e histológicos de um único tecido.

Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas

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