Uso da técnica de sobreposição de Soft-agar para triagem de compostos inibidores produzida por bactérias

O objetivo geral deste procedimento é rastrear agentes produzidos por uma cepa bacteriana, que são inibitórios em relação à segunda cepa bacteriana. Este método pode ajudar a responder a perguntas em vários campos microbiológicos, mas é particularmente útil na ecologia microbiana, na compreensão das interações bacterianas antagônicas. A principal vantagem dessa técnica é que ela é barata e fácil de executar e interpretar.

Demonstrando o procedimento estará Aretha, uma estudante do laboratório. Para iniciar o experimento, inocule uma única colônia de P syringae em 3 mililitros de caldo King's Medium B, ou KB. Incube a cultura durante a noite. Na manhã seguinte, dilua a cultura do caldo de 1 a 100 em 3 mililitros de caldo KB fresco.

Incube a cultura por três a quatro horas agitando em temperatura ambiente. Certifique-se de que a cultura tenha um aumento perceptível na turbidez e, em seguida, adicione Mitomicina C. Em seguida, incube a cultura durante a noite com agitação em temperatura ambiente. No dia seguinte, um pellet a dois mililitros de mitomicina C induziu culturas em uma microcentrífuga de bancada.

Remova e esterilize os sobrenadantes da cultura passando o sobrenadante por um filtro de tamanho de poro de 0,22 micrômetro. Adicione cloreto de sódio para atingir uma concentração de um molar e adicione polietilenoglicol, ou PEG 8000, a uma concentração final de 10% ao sobrenadante estéril. Inverta repetidamente as amostras até que o cloreto de sódio e o PEG estejam completamente dissolvidos.

Incubar as amostras em banho de gelo durante uma hora. Em seguida, centrifugue as amostras. Após a centrifugação, decantar o sobrenadante e voltar a suspender o pellet em tampão pipetando repetidamente.

Remover o PEG residual por duas extrações sequenciais com um volume igual de clorofórmio. Combine com clorofórmio com o pellet ressuspenso e vortex a mistura por 15 segundos. Em seguida, centrifugue a mistura a 20 000 vezes G durante cinco minutos.

Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrífugas. Repetir esta extracção duas vezes, até que não seja visível uma interface branca entre a fase aquosa e a fase orgânica. Deixar evaporar o clorofórmio residual dos sobrenadantes extraídos numa hotte.

Inocular uma única colónia de uma estirpe de P syringae em três mililitros de KB e incubar a cultura durante a noite agitando à temperatura ambiente. Na manhã seguinte, dilua a cultura de 1 a 100 em KB fresco. Incube a cultura por três a quatro horas agitando em temperatura ambiente. Em seguida, prepare o ágar água esterilizado autoclavando uma suspensão de ágar em água ultrapura.

Mantenha o ágar mole derretido em banho-maria a 60 graus Celsius antes de usar. Usando uma pipeta sorológica estéril, transfira três mililitros de ágar mole para um tubo de cultura estéril. Retorne o tubo de cultura ao banho-maria para mantê-lo em estado fundido.

Antes de despejar a cobertura, deixe o ágar derretido esfriar, mas não deixe solidificar. É fundamental que o ágar seja mantido em um estado quente e completamente fundido antes da inoculação. Caso contrário, a sobreposição terá uma aparência granulada e será mais difícil de interpretar.

Em uma coifa estéril, inocule 100 microlitros da cultura da cepa do testador no ágar macio e no vórtice para misturar. Gire a cultura manualmente por 10 a 15 segundos e despeje no fundo de um prato de ágar. Incline a placa em todas as direções para garantir que o ágar macio cubra uniformemente o ágar inferior.

Cubra o prato e deixe solidificar por 20 a 30 minutos. Tenha cuidado para não mexer na placa durante a solidificação. Depois de solidificado, coloque de dois a cinco microlitros de sobrenadante na cobertura.

Deixe as placas incubarem durante a noite em temperatura ambiente. Observe e registre os resultados na manhã seguinte. Usando este método, duas cepas de P syringae são inibidas por diferentes bacteriocinas.

A cepa A é sensível a uma bacteriocina de alto peso molecular, a tailocina, mas não é sensível a uma bacteriocina alternativa de baixo peso molecular. Por outro lado, a cepa B é insensível à tailocina, mas é sensível à bacteriocina de baixo peso molecular. A Tailocin é eficientemente recuperada após a precipitação de PEG, enquanto as Bacteriocinas de menor peso molecular não são.

A morte mediada por bacteriófagos é diferenciada de outros antimicrobianos não replicativos comparando uma série de diluição. No caso de clareamento mediado por bacteriófagos, a diluição do sobrenadante foi resolvida em placas individuais ou zonas de clareamento, enquanto a clareamento mediada por bacteriocina não se resolveu em tais placas. Este procedimento pode ser usado como uma triagem inicial para identificar agentes inibitórios e pode ser combinado com manipulações genéticas a jusante para identificar ou confirmar a fonte dessa atividade.