Name: A cirurgia de derivação, coração direito Cateterismo e Vascular morfometria em um modelo de rato para induzida Fluxo de Hipertensão Arterial Pulmonar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprenda a criar um modelo de hipertensão arterial pulmonar induzida por fluxo em ratos, utilizando cirurgia de derivação, cateterismo cardíaco direito e morfometria vascular. Este método padronizado permite avaliar alterações hemodinâmicas e remodelamento vascular para pesquisa translacional.

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Este estudo foi apoiado pela Iniciativa de Pesquisa Cardiovascular da Holanda, pela Fundação Holandesa do Coração, pela Federação Holandesa de Centros Médicos Universitários, pela Organização Holandesa para Pesquisa e Desenvolvimento em Saúde e pela Academia Real de Ciências da Holanda (CVON nr. 2012-08, PHAEDRA, The Sebald fund, Stichting Hartekind).

Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comité Central Holandês para Experimentação Animal e do Comité de Cuidados com Animais da Universidade Medical Center Groningen (NL). foram usados ​​tanto em ratos Wistar e Lewis com pesos entre 180 e 300 g. 1. Habitação e aclimatação <ol><li> Depois da chegada ao biotério central, ratos de casas em grupos de 5 por gaiola. Durante um período de aclimatação de 7 dias, acostumar os ratos a manipulação humana, mas não realizar quaisquer procedimentos experimentais. </li></ol> 2. Preparação e Injecção de estéril Monocrotalin <ol><li> Para 1 mL de 60 mg / mL monocrotalin (MCT) solução, pesar 60 mg de monocrotalin num tubo de 2 mL. Adicionar 700 ul de NaCl a 0,9%. Adicionar 200 mL de HCl 1M. Aquecer a solução no tubo sob água corrente da torneira quente e vortex-lo. Use N NaOH 6 para levar o pH no sentido 7.0. Use técnica estéril para a preparação do MCT para injeção em roedores. </li&gt; <li> Injectar 1 mL de ml de solução estéril de 60 mg / MCT por kg por via subcutânea no pescoço (0,3 mL de 60 mg / ml para uma MCT-300 g de rato). NOTA: Nós não preferem usar volumes menores devido à maior chance de que a dose injectada não será apropriado. </li></ol> Cirurgia Shunt 3. Aorta-cava <ol><li> Anestesia. <ol><li> Encher a câmara de indução com 5% de isoflurano / O2 a 100% (fluxo: 1 L / min) e colocar o rato na câmara. Verifique para a profundidade adequada da anestesia através da realização de uma pitada dedo do pé traseiro. Pesa-se o rato. </li><li> Raspar e limpar o abdômen por uma área que é de aproximadamente 8 cm de comprimento e 3 cm de largura. Coloque o rato em sua parte traseira em uma esteira de calor (37 ° C) coberto por um tapete estéril. </li><li> Colocar o focinho num ventilação máscara / capa com 2-3% de isoflurano / O2 a 100% (fluxo: 1 L / min). Verifique a profundidade da anestesia através da realização de uma pitada dedo da pata traseira. Aplicar pomada para evitar a secura e sob anestesia. </li></ol></li><li> shunt Surgery. <ol><li> Esfregar a pele com cloreto de-hexidine para a desinfecção. Injectar 0,01 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea para analgesia pós-operatória. </li><li> Utilize instrumentos estéreis para a cirurgia. Faça uma incisão com uma lâmina de bisturi nº 10 no abdômen na linha média, a partir de 1 cm abaixo do diafragma uma estendendo-se para baixo a apenas acima da genitália. </li><li> Levanta o intestino com um cotonete de algodão, cobrir os intestinos em, uma gaze molhada estéril (NaCl a 0,9%), e colocá-los para o lado esquerdo do animal. </li><li> Use cotonetes para separar as membranas que se ligam a aorta abdominal e veia cava inferior para os tecidos circundantes. NOTA: Não dissecar as membranas entre a aorta ea veia cava. </li><li> Usando fórceps lasca, remover a gordura da aorta perivascular acima da bifurcação, apenas no lado direito da aorta e apenas no local onde a agulha será inserida. </li><li> Use cotonetes para separar a aorta ea veia cava a partir mm supe 2rior ao local onde a agulha será inserida, de modo a criar espaço para uma braçadeira Biemer. </li><li> Nesta área, em primeiro lugar colocar uma ligadura solta (5-0 sutura) em torno da aorta. Criar tensão na ligadura, colocando um grampo Kocher sobre ele, e, em seguida, colocar o Kocher superior ao da incisão (Figura 1A). Coloque a braçadeira Biemer apenas superior à ligadura (Figur e 1A). </li><li> Com um cotonete de algodão, comprimir a veia cava como distalmente possível para obstruir o fluxo (Figura 1A). Dobrar uma agulha (18 L neste protocolo) num ângulo de 45 graus, com o orifício de apontador para o exterior (Figura 1A). </li><li> Em um ângulo de 90 graus, inserir a agulha na aorta, acima da bifurcação, com o orifício da agulha que aponta para a esquerda (Figura 1A). Manipular a ponta da agulha para a esquerda e inseri-lo na veia cava. NOTA: A ponta da agulha deve ser agora visible na veia cava (Figura 1B). </li><li> Usar um segundo cotonete para empurrar o restante sangue na aorta para fora do local de inserção para prevenir a trombose. Seca-se a área em torno da derivação com uma gaze estéril a fim de que a cola para colar de forma adequada. </li><li> Retire a agulha toda para fora da aorta e aplicar imediatamente uma gota de cola de tecido para o local da punção na aorta. Certifique-se não cola o cotonete para o tecido. Soltar a aorta. </li><li> Verifique se o shunt manualmente puxando e soltando a ligadura na proximal aorta para o shunt. Afrouxamento deve colorir a distal da veia cava para a derivação no vermelho brilhante e criar turbulência no local shunt. NOTA: O aperto vai virar o sangue na veia cava volta ao vermelho escuro. </li><li> Colocar os intestinos de volta no animal. Feche a camada de músculo e pele com reabsorvíveis 4-0. Ventilar o animal com 100% de O2 para se recuperar da anestesia. NOTA: Não deixe um animal autônoma até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. </li></ol></li><li> Cirurgia Sham. <ol><li> Executar todos os procedimentos anteriores excepto para a inserção da agulha no interior da aorta. </li></ol></li><li> cuidados pós-cirúrgicos. <ol><li> Colocar o rato em uma gaiola única e em uma incubadora a 37 ° C até à manhã seguinte. </li><li> Cerca de 6 horas após a cirurgia, injetar de 0,01 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea para analgesia pós-operatória. Repita na manhã seguinte se o rato mostra sinais de desconforto. NOTA: Os primeiros 3 dias após a cirurgia, os ratos tendem a comer e beber menos (isto é particularmente importante quando ração ou água potável são misturados com drogas). A maioria dos ratos mostram um comportamento normal de 3 dias após a cirurgia. Se não, acompanhar de perto. A perda de peso superior a 15% em uma semana é considerada anormal, e esses ratos deve ser sacrificados por a extracção do volume de sangue circulante, enquanto sob anestesia. </li></ol></li></ol> NOTA: Neste protocolo, o animal é sacrificado pela extração do volume de sangue circulante, enquanto sob anestesia. <ol><li> Sacrificar um dia após a cirurgia (MF8) para as primeiras respostas celulares e funcionais ao aumento do fluxo sanguíneo pulmonar (por exemplo, gene-regulação ou fatores de transcrição precoce). </li><li> Sacrificar uma semana após a cirurgia (MF14) para um fenótipo PAH vascular em estágio inicial (hipertrofia medial sem lesões neointimais). </li><li> Sacrifício 2 semanas após a cirurgia (MF21) para um fenótipo PAH vascular em estágio avançado (marcada hipertrofia medial ea formação neointimal) com elevação ligeira na RVP e PAP. </li><li> Sacrificar 3 semanas após a cirurgia (MF28) para um fenótipo PAH vascular em fase terminal (oclusão neointimal marcada) e elevação forte na RVP e PAP. Os sinais clínicos de falência ventricular direita são comuns nesta fase. </li><li> Sacrifício após o dia 28 (MF-RVF) Para a falência do ventrículo direito associada à HAP (RVF), clinicamente definida como dispneia, letargia grave, e perda de peso (&lt;10% em 1 semana). Terminar ratos quando um desses sinais está presente. Frequentemente, os ratos desenvolvem estes sintomas entre os dias 28 e 35 e, se deixada sem vigilância, morrer espontaneamente durante este intervalo de tempo. </li></ol> 5. Direito cateterismo cardíaco <ol><li> Anestesia. <ol><li> Encher a câmara de indução com 5% de isoflurano / O2 a 100% (fluxo: 1 L / min) e colocar o rato na caixa. Verifique para a profundidade adequada da anestesia através da realização de uma pitada dedo do pé traseiro. Pesa-se o rato. </li><li> Raspar e limpar o pescoço no lado direito-ventral do rato e, para o protocolo de ecocardiografia, o tórax e abdômen superior. </li><li> Colocar o rato de costas sobre um tapete de calor (37 ° C) e colocar o focinho num ventilação máscara / capa com 2-3% de isoflurano / O2 a 100% (fluxo: 1 L / min). O focinho deve ser enfrentado para o pesquisador. </li><li&gt; Verifique a profundidade da anestesia. Tenha cuidado com os ratos com hipertensão pulmonar grave. Se a taxa cardíaca diminui, reduzir a profundidade da anestesia. Preferível, executar todas as medidas dentro de 20 min. Aplicar pomada para evitar a secura e sob anestesia. </li></ol></li><li> protocolo de ecocardiografia. <ol><li> Realizar a ecocardiografia de acordo com o protocolo descrito por Brittain et ai. em JoVE 13. </li></ol></li><li> protocolo de cateterismo. NOTA: Este protocolo utiliza uma cânula rígida pré-formada com uma ponta dobrada a 20 graus para guiar o cateter de silicone de 15 cm com uma esfera de 2 mm da ponta. Uma agulha 20-G com seu orifício ligeiramente dobrados para o interior é usado para inserir a cânula na veia jugular direita (veja a lista de materiais). Os ratos em qualquer fase de progressão e controlo HAP podem ser utilizados no presente protocolo. <ol><li> Desinfectar o pescoço com cloreto de-hexidine. Faça um 1,5 cm incisão com uma lâmina de bisturi # 10 no lado direito-ventraldo pescoço, da clavícula direita ao osso mandibular. </li><li> Espalhe o tecido com uma tesoura. Com uma pinça, puxe o tecido separados até a veia jugular aparece. Dissecar as membranas em torno da veia jugular com a pinça dissidentes. </li><li> Coloque a tensão na veia jugular, colocando uma ligadura soltas (5-0 sutura) em torno do vaso. Aumentar a tensão e fita a ligadura sobre a máscara de ventilação (Figura 2A). </li><li> A jusante do local de inserção, colocar uma ligadura solta em torno do vaso para apertar depois de a cânula in situ, de modo a evitar fugas e perdas de pressão. </li><li> Utilizando as alças de uma pinça, dobrar ligeiramente a ponta de uma agulha de 20-L com o orifício para o interior para realizar a cânula com o cateter. </li><li> Introduzir a ponta da agulha 20-G para dentro da veia e rapidamente colocar a cânula que contém o cateter no interior do vaso. Retire a agulha e, em seguida, feche a ligaduraque foi preparado no passo 5.3.4. </li><li> Conduzir a cânula que contém o cateter na veia jugular. A ponta da cânula é uma curva de 20 graus (ver o passo 5.3.5). Manobra da cânula sob a clavícula e avançar um pouco para entrar no átrio direito (Figura 2C). </li><li> Para entrar no ventrículo direito, momento a ponta da cânula para a esquerda, para o coração (Figura 2D). No monitor de cabeceira, uma curva de pressão RV deve aparecer, combinando Figura 2D. </li><li> Quando a curva de pressão VD é constante, anote a pressão do ventrículo direito sistólica e diastólica 1 (sRVP1 / dRVP1). </li><li> Manipular a ponta da cânula para a esquerda e para cima. Avançar o cateter no interior da cânula (Figura 2E). </li><li> Avance o cateter na artéria pulmonar principal (PA). Nenhuma resistência deve ser sentida quando se passa da válvula pulmonar. NOTA: Quando o cateter entra na artéria pulmonar principal, o dpressão iastolic vai subir. No monitor de cabeceira, uma curva de pressão PA deve aparecer, combinando Figura 2E. </li><li> Quando a curva de pressão PA é constante, anote as pressões sistólica, diastólica e média pressão PA 1 (sPAP1, dPAP1, mPAP1). </li><li> Além disso avançar o cateter no interior da cânula até que a bola na ponta do cateter fica entalado numa artéria pulmonar. Observar a curva de pressão sobre a queda monitor de cabeceira e combinar a curva de pressão em cunha na Figura 2F. </li><li> Quando a curva de pressão em cunha é constante, anote as pressões sistólica, diastólica e média pressão em cunha. </li><li> Puxe o cateter lentamente e, posteriormente, medir e anotar os valores para sPAP2, dPAP2, mPAP2, sRVP2 e dRVP2, como exibido no monitor de cabeceira. </li><li> Quando no RV, ligeiramente puxar a cânula e cateter para medir a pressão média do átrio direito (PAD). A curva deve coincidir com a curva RAP na Figura 2A. NÃOTE: Neste protocolo, os ratos são sacrificados após o protocolo de cateterismo por a extracção do volume de sangue circulante, enquanto sob anestesia. </li></ol></li></ol> 6. Morfologia Avaliação e morfometria NOTA: Neste protocolo, o animal é sacrificado pela extração do volume de sangue circulante, enquanto sob anestesia. Os ratos em qualquer fase de progressão e controlo HAP podem ser utilizados no presente protocolo. <ol><li> Após o sacrifício, tirar os pulmões, cortando a traqueia cerca de 5 mm acima da bifurcação brônquica e os navios que ligam os pulmões ao coração. Coloque os pulmões em soro fisiológico frio. Dissecar o pulmão esquerdo. Corte o brônquio principal esquerdo na bifurcação. </li><li> Encha uma seringa de 50 ml com paraformaldeído a 4%, anexar um tubo com uma cânula para a seringa, e pendurar a seringa cerca de um metro acima da tabela de trabalho. Encaixar a cânula no brônquio principal esquerdo para passivamente encher o pulmão com paraformaldeído.Lidar com paraformaldeído com cautela. </li><li> Incubar o pulmão esquerdo em paraformaldeído durante 48 h. </li><li> Desidratar o pulmão esquerdo por incubação consecutivamente em 70% de etanol (1 hora), 80% de etanol (1 hora), 90% de etanol (1 hora), etanol a 100% (3 h), xilol (2 h), e parafina ( 2 h). </li><li> Incorporar o pulmão esquerdo em parafina, com o hilo do pulmão de frente para a cassete. </li><li> Corar as secções de pulmão, 4 mícrons embebidos em parafina usando uma coloração Verhoeff ou Elastica-van Gieson, de acordo com as instruções do fabricante 29. Certifique-se as lâminas elásticas são bem diferenciados (como na Figura 3). Digitalizar os cortes corados em 40X. </li><li> Divida o pulmão em 4 quadrantes. Em cada quadrante, encontrar 10 navios, com um diâmetro exterior &lt;50 mm (intra-acinares) e 10 navios, com um diâmetro exterior&gt; 50 mm (pré-acinares). Tire uma foto (2 x 40 imagens por pulmão). Zoom aleatoriamente até 20x e fotografar todos os naviosneste campo de visão para minimizar o viés de seleção. </li><li> Excluir embarcações que têm uma proporção mais longo / curto de diâmetro&gt; 2, uma forma circular incompleto, ou um colapso de mais do que um quarto da parede do vaso. NOTA: Um exemplo de um vaso excluída é mostrada na Figura 3b Faça cada foto na mesma ampliação (40x) e incluem uma barra de escala. </li><li> Abrir ImageJ e a primeira imagem. Desenhar uma linha reta na barra de escala na imagem para definir a escala através de &quot;Analyse&quot; e &quot;escala Set.&quot; Por &quot;distância conhecida,&quot; utilizar o valor na barra de escala da imagem. Use micrómetros (um) como a unidade de comprimento. Defina a escala para global. </li><li> Usando &quot;seleções à mão livre&quot;, desenhar uma linha sobre o bordo interior da área luminal (Figura 3), e usar &quot;medir&quot; (Crtl m) para medir nesta área. Em seguida, desenhe uma linha ao redor do exterior elástica lIC lâmina (Figura 3) para medir a área total do vaso. </li><li> Calcular luminal e o diâmetro exterior ( <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq1.jpg" /> ) usando <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq2.jpg" /> . </li><li> Calcular a espessura de parede utilizando <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq3.jpg" /> . </li><li> Calcula-se a razão de parede / lúmen usando <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq4.jpg" /> . </li><li> Calcular a pontuação oclusão usando <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq5.jpg" /> . </li><li> Pontuação do navio em muscularização (sem, muscularização parcial, ou total) (Figura 3B). Nota: Os recipientes com uma lâmina elástica dupla para mais de metade da circunferência são definidos como totalmente muscularização. As embarcações com uma lâmina elástica dupla menos de metade da circunferência são definidos como parcialmente muscularização. </li><li> Marcar o recipiente na presença de um NeoiNtima (sim ou não) (Figura 3C). Nota: Os recipientes sem uma lâmina elástica interna claramente definido combinado com oclusão (muitas vezes excêntrico) luminal são definidas como lesões neointimal. </li></ol>

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<li>Sakao, S., Taraseviciene-Stewart, L., Lee, J. D., Wood, K., Cool, C. D., Voelkel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+apoptosis+is+followed+by+increased+proliferation+of+apoptosis-resistant+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Initial apoptosis is followed by increased proliferation of apoptosis-resistant endothelial cells.</a> FASEB J. 19 (9), 1178-1180 (2005).</li>
<li>Spiekerkoetter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FK506+activates+BMPR2%2C+rescues+endothelial+dysfunction%2C+and+reverses+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">FK506 activates BMPR2, rescues endothelial dysfunction, and reverses pulmonary hypertension.</a> J Clin Invest. 123 (8), 3600-3613 (2013).</li>
<li>Nickel, N. P., Spiekerkoetter, E., Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elafin+reverses+pulmonary+hypertension+via+caveolin-1-dependent+bone+morphogenetic+protein+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Elafin reverses pulmonary hypertension via caveolin-1-dependent bone morphogenetic protein signaling.</a> Am J Respir Crit Care Med. 191 (11), 1273-1286 (2015).</li>
<li>Meloche, J., Potus, F., Vaillancourt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodomain-containing+protein+4%3A+The+epigenetic+origin+of+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Bromodomain-containing protein 4: The epigenetic origin of pulmonary arterial hypertension.</a> Circ Res. 117 (6), 525-535 (2015).</li>
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<li>Elastic (Connective Tissue Stain) Instructions for Use. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf">http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf</a> (1506).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este método descreve o procedimento cirúrgico de shunt aorto-cava em ratos pré-tratados com MCT para criar HAP induzida pelo fluxo e as técnicas para avaliar o princípio hemodinâmica e pontos finais histopatológicos que caracterizam HAP e este modelo. Passos críticos dentro do Protocolo e solução de problemas Cirurgia e pós-cirurgia. Durante a cirurgia de derivação aorto-cava, a etapa mais crítica é a dissecção da aorta e veia cava. As membranas que envolvem a aorta...

O objetivo desse método é criar um modelo reproduzível para a hipertensão arterial pulmonar grave, induzida por fluxo em ratos e medir o seu princípio hemodinâmica e pontos finais histopatológicos. A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma síndrome clínica que engloba um aumento progressivo na resistência vascular pulmonar, levando à falência ventricular direita e morte. Dentro do espectro da doença subordinador de doenças de hipertensão pulmonar (PH), HAP é a forma mais grave e uma que permanece sem cura 1. A arteriopatia subjacente na HAP é caracterizada por uma forma típica de remodelação vascular que provoca a oclusão do lúmen do vaso. Muscularização de navios não muscularização normais e hipertrofia da camada navio medial são considerados fenômenos precoce da doença em HAP, também são vistos em outras formas de PH 2, e são pensados para ser reversível 3. Conforme a HAP umdvances, a camada íntima começa a remodelar, eventualmente formando lesões neointimais característicos 2. -Type neointimal remodelamento vascular pulmonar é exclusivo para PAH e está actualmente a ser considerada irreversível 4. Conforme a HAP é uma doença rara, os avanços na sua compreensão pathobiological e desenvolvimento de novas terapias têm se baseou fortemente em modelos animais. O modelo monocrotalin (MCT) em ratos é um simples modelo de hit single que tem sido, e ainda é, frequentemente utilizado. MCT é uma toxina que causa lesão aos arteríolas pulmonares e inflamação regionais 5. 60 mg / kg de MCT leva a um aumento da pressão arterial pulmonar média (PAP), a resistência vascular pulmonar (RVP), e a hipertrofia ventricular direita (HVD) depois de 3 - 4 semanas 6. O histomorfologia é caracterizada por hipertrofia medial isolada, sem lesões neointimais 5. o MCTmodelo de rato representa, assim, uma forma moderada de PH, e não HAP, embora seja normalmente apresentado como o último. Em crianças com HAP associada a um shunt congênita da esquerda para a direita (HAP-CHD), aumento do fluxo sanguíneo pulmonar é considerado como o gatilho essencial para o desenvolvimento de lesões neointimais 7, 8, 9. Em ratos, o aumento do fluxo sanguíneo pulmonar pode ser induzida através da criação de uma derivação entre a aorta abdominal e a veia cava, uma técnica descrita pela primeira vez em 1990 10. Alternativas para criar aumento do fluxo pulmonar são por pneumonectomia unilateral ou subclávia à anastomose da artéria pulmonar 11. desvantagens conceituais desses modelos consistem em potencial de crescimento compensatório do pulmão remanescente e ativação da via de adaptação induzida pela pneumonectomia, ou de lesão iatrogênica da vasculatura pulmonar devidoa anastomose da artéria pulmonar, tanto confundindo os efeitos do aumento do fluxo sanguíneo pulmonar. Quando um shunt aorto-cava é criado e aumento do fluxo sanguíneo pulmonar é induzida como um segundo hit em ratos tratados com MCT, lesões neointimais característicos ocorrem, e uma forma grave de HAP e falência do ventrículo direito associada (RVF) Desenvolver 3 semanas após o aumento fluir 12. A progressão hemodinâmica da HAP neste modelo pode ser avaliada in vivo pelo ecocardiograma e cateterismo cardíaco direito. O histomorfologia vascular, espessura da parede do vaso, o grau de oclusão arteriolar, e os parâmetros para a falência do ventrículo direito formam os pilares da caracterização ex vivo da HAP. Este método descreve protocolos detalhados para a cirurgia de derivação aorto-cava (AC-shunt), cateterismo cardíaco direito e avaliação qualitativa e quantitativa de histomorfologia vascular.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Shunt Surgery</td></tr><tr><td>Luvas</td><td></td><td></td><td></td>cirúrgicas estéreis</tr><tr><td>Duratears Pomada para os olhos</td><td>Alcon</td><td>10380</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto-Hexidina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes</td><td></td><td></td><td></td>de algodão</tr><tr><td>Cola de tecido histoacrílico</td><td>B. Braun Medical</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Silkam 5-0 suturas pretas não reabsorvíveis</td><td>B. Braun Medical</td><td>F1134027</td><td></td></tr><tr><td>Safil 4-0 suturas violeta reabsorvíveis</td><td>B. Braun Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 G agulha</td><td>Luer</td><td>NN1838R ponta BD</td><td>dobrada em orifício de 45 graus para o exterior</td></tr><tr><td>Gazes 10 x 10 cm</td><td>Paul Hartmann</td><td>407825</td><td></td></tr><tr><td>Temgesic Buprenorfina</td><td>RB Pharmaceuticals</td><td>5429</td><td>subcutânea injeção</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio 0.9%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máscara de ventilação Lâmina</td> de bisturi de rato <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Braçadeira Biemer 18 mm, abertura de 5 mm&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td><a href="https://www.google.nl/url?sa=i&amp; rct = j & q=& esrc=s& fonte=imagens& cd=& cad=rja& uact=8& ved=0ahUKEwitqICpkITNAhWiL8AKHe6iCC8QjhwIBQ& url=http%3A%2F%2Fwww.agnthos.se%2Fquote%2Fquote%2Fcaturl%2Fid%2F242%2FBiemer& psig=AFQjCNEnfRXuMQ6Doi4_-2KMYu3qeRovMA& ust=1464777707579746">AgnTho</a></td><td>64-562</td><td></td></tr><tr><td>Tapete</td><td></td><td></td><td></td>de calor</tr><tr><td>Kocher Clamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina de</td><td></td><td></td><td></td>barbear</tr><tr><td>Microscópio</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cateterismo cardíaco direito</td></tr><tr><td>Luvas</td><td></td><td></td> <td>cirúrgicas estéreis</td></tr><tr><td>Pomada para os olhos</td><td>Duratears</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloride-Hexidine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes Gazes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 x 10 cm</td><td>Paul Hartmann</td><td>407825</td><td></td></tr><tr><td>Silkam 5-0 suturas pretas não reabsorvíveis</td><td>B. Braun Medical</td><td>F1134027</td><td></td></tr><tr><td>Agulha 20 G</td> Ponta <td>Luer</td><td></td><td>ligeiramente dobrada para dentro</td></tr><tr><td>Cânula 20 G</td><td>Luer</td><td></td><td>para introduzir cateter, ponta pré-formada em 20 graus</td></tr><tr><td>Cateter Silastic 15 cm de comprimento</td><td></td><td></td><td>0,5 mm bola 2 mm da ponta</td></tr><tr><td>Transdutor de pressão</td><td>Ailtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monitor de cabeceira Cardiocap/5</td><td>Datex-Ohmeda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina</td><td></td><td></td><td></td>de barbear</tr><tr><td>Seringa</td><td></td><td></td> de 10 mL<td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio 0,9%</td><td></td><td></td> <td>para lavagem</td></tr><tr><td colspan="4">Morfologia Vascular</td></tr><tr><td>50 mL Seringa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% Formaldeído</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 G cânula com tubo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloração Verhoef</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en&amp; region=NL">HT254</a></td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Scanner de slides digital</td><td>Hamamatsu</td><td>C9600</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elastic (Mancha de Tecido Conjuntivo)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab150667</td><td>http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html 
http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(site).pdf</td></tr></tbody></table>

a cirurgia de derivação, coração direito cateterismo e vascular morfometria em um modelo de rato para induzida fluxo de hipertensão arterial pulmonar

Shunt Surgery, Right Heart Catheterization, and Vascular Morphometry in a Rat Model for Flow-induced Pulmonary Arterial Hypertension

Neste protocolo, a HAP é induzida pela combinação de uma injeção de monocrotalina (MCT) de 60 mg/kg com aumento do fluxo sanguíneo pulmonar através de um shunt aorto-caval (MCT+Flow). O shunt é criado inserindo uma agulha 18-G da aorta abdominal na veia cava adjacente. O aumento do fluxo pulmonar tem sido demonstrado como um gatilho essencial para uma forma grave de HAP com fases distintas de progressão da doença, caracterizada por hipertrofia medial precoce seguida de lesões neointimais e oclusão progressiva dos pequenos vasos pulmonares. Para medir a hemodinâmica cardíaca direita e pulmonar neste modelo, o cateterismo cardíaco direito é realizado inserindo uma cânula rígida contendo um cateter flexível de ponta esférica através da veia jugular direita no ventrículo direito. O cateter é então avançado para as artérias pulmonares principal e mais distais. A histopatologia da vasculatura pulmonar é avaliada qualitativamente, por meio da pontuação dos vasos pré e intra-acinares quanto ao grau de musculatura e presença de neoíntima, e quantitativamente, pela mensuração da espessura da parede, da relação parede-lúmen e do escore de oclusão.

Os resultados representativos são apresentados na Figura 4. Os resultados apresentados mostram características do MCT + FLUXO em ratos Lewis nos seguintes grupos: Controle (n = 3), MF8 (n = 5), MF14 (n = 5), MF28 (n = 5) e MF-RVF ( n = 10). As análises estatísticas foram realizadas utilizando o one-way ANOVA com correção de Bonferroni. 60 mg / kg MCT e aumentou a vantagem fluxo sanguíneo pulmonar a um aumento ...

Este protocolo descreve um procedimento cirúrgico para criar um modelo de hipertensão arterial pulmonar (HAP) induzida por fluxo em ratos e os procedimentos para analisar os principais desfechos hemodinâmicos e histológicos neste modelo.

A cirurgia de derivação, coração direito Cateterismo e Vascular morfometria em um modelo de rato para induzida Fluxo de Hipertensão Arterial Pulmonar

In this protocol, PAH is induced by combining a 60 mg/kg monocrotalin (MCT) injection with increased pulmonary blood flow through an aorto-caval shunt ...

Os objetivos gerais desses procedimentos são criar um modelo para hipertensão arterial pulmonar induzida por fluxo em ratos e analisar seus principais desfechos hemodinâmicos e histológicos por cateterismo cardíaco direito e morfometria vascular. Apresentamos a criação de um modelo de rato para hipertensão pulmonar associada ao fluxo que se caracteriza por um novo remodelamento vascular do tipo intimal semelhante à hipertensão arterial pulmonar humana, e que é induzido por um gatilho clinicamente bem reconhecido, o aumento do fluxo sanguíneo pulmonar. Essas características irão melhorar a tradução dos achados deste modelo para a doença humana.Também mostramos métodos padronizados para avaliação hemodinâmica e caracterização da histopatologia por meio de morfometria quantitativa. As implicações dessas técnicas se estendem à descoberta e avaliação de novas estratégias de tratamento e permitem a avaliação dos efeitos específicos na hemodinâmica pulmonar e na morfologia vascular. Demonstrando os procedimentos estarão Annemieke Smit-Van Oosten e Michel Weij, microcirurgiões deste laboratório.Antes de iniciar a cirurgia, esfregue a pele de um rato anestesiado com cloreto hexadeno para desinfecção e injete buprenorfina por via subcutânea para analgesia pós-operatória. Em seguida, use uma tesoura para fazer uma incisão na linha média ao longo do abdômen, começando um centímetro abaixo do diafragma, estendendo-se até logo acima da genitália. Transfira os intestinos para uma gaze estéril umedecida com solução salina a 0,9% para o lado esquerdo do animal e cubra o órgão com mais gaze úmida e estéril.Use novos cotonetes para separar as membranas que ligam a aorta abdominal e a veia cava inferior aos tecidos circundantes. Sob um microscópio de dissecação, use uma pinça de lasca para remover a gordura aórtica perivascular logo acima da bifurcação no lado direito da aorta, onde a agulha será inserida. Em seguida, separe a aorta e a veia cava de dois milímetros acima do local, o local de inserção da agulha, para criar espaço para uma pinça de projetor.Agora coloque uma sutura 5-O solta ao redor da aorta e coloque uma pinça Kocher na sutura para criar tensão na ligadura superior à incisão. Coloque a pinça do projetor logo acima da sutura e use uma nova troca para comprimir a veia cava o mais distalmente possível para obstruir o fluxo. Em seguida, dobre uma agulha de calibre 18 em um ângulo de 45 graus com o chanfro posicionado para fora e, segurando a agulha 90 graus em relação ao animal, insira a ponta da agulha na aorta logo acima da bifurcação com o chanfro voltado para a esquerda.Disseque as membranas que envolvem a aorta e a veia cava apenas o suficiente para criar uma boa visibilidade da área de inserção do shunt, pois a dissecção excessiva fará com que o shunt vaze. Manipule a ponta da agulha para a esquerda e insira a agulha na veia cava até que possa ser observada dentro do vaso. Para evitar trombose, use um novo cotonete para empurrar o sangue restante para fora da aorta através do local de inserção e use uma gaze estéril para secar a área ao redor do shunt.Remova a agulha e aplique imediatamente uma gota de cola de tecido no local da punção. Em seguida, remova a pinça da aorta e solte manualmente a ligadura na aorta promixal para o shunt. A veia cava distal ao shunt deve ficar vermelha brilhante e criar turbulência no local do shunt.Após verificar o shunt, retorne os intestinos à cavidade abdominal e use suturas reabsorvíveis 4-0 para fechar as camadas muscular e cutânea. Em seguida, ventile o animal com oxigênio a 100% para recuperação da anestesia. Para cateterismo cardíaco direito, desinfete o pescoço com cloreto hexadeno e use uma lâmina de bisturi número 10 para fazer uma incisão de 1,5 centímetro no lado ventral direito do pescoço, da clavícula direita até o osso mandibular.Sob o microscópio de dissecação, use uma tesoura para espalhar o tecido e, em seguida, use uma pinça para separar suavemente o tecido até que a veia jugular apareça. Disseque as membranas ao redor da veia jugular usando uma pinça de lasca. Em seguida, coloque uma sutura de 5-O solta ao redor do vaso e prenda a ligadura na máscara de ventilação para aumentar a tensão na veia.A jusante do local de inserção, coloque uma ligadura solta ao redor do vaso. Em seguida, use as alças da pinça para dobrar levemente a ponta de uma agulha de calibre 20 com o chanfro voltado para dentro e introduza a ponta da agulha na veia. Coloque rapidamente uma cânula contendo um cateter dentro do vaso e remova a agulha, fechando a ligadura a jusante ao redor da cânula para prender a cânula no lugar.Agora conduza a cânula e o cateter para a veia jugular, manobrando a cânula sob a clavícula para entrar no átrio direito. Aponte a ponta da cânula em direção ao coração para entrar no ventrículo direito. Uma curva de pressão do ventrículo direito deve aparecer no monitor de cabeceira.Quando a curva de pressão do ventrículo direito for constante, registre a pressão sistólica e diastólica do ventrículo direito e manipule a ponta da cânula para a esquerda e para cima. Avance o cateter dentro da cânula e, em seguida, avance o cateter para a artéria pulmonar principal. Quando a curva de pressão da artéria pulmonar for constante, registre as curvas sistólica, diastólica e média da pressão da artéria pulmonar.Em seguida, avance o cateter dentro da cânula até que a bola na ponta do cateter fique presa em uma artéria pulmonar. A queda na curva de pressão deve ser observada no monitor de cabeceira. Quando a curva de pressão do calço for constante, registre as pressões sistólica, diastólica e média do calço.Em seguida, puxe lentamente o cateter para trás e, guiado pelas curvas no monitor de cabeceira, registre os respectivos valores de pressão de PA e VD. Quando o cateter atingir o ventrículo direito, puxe levemente a cânula e o cateter para trás e meça a pressão média do átrio direito. Neste experimento representativo, 28 dias após a administração do MCT e um aumento do fluxo sanguíneo pulmonar, observa-se um aumento médio nas pressões sistólica do ventrículo direito, artéria pulmonar sistólica e artéria pulmonar média.As relações de peso do ventrículo direito para o ventrículo esquerdo e o peso do septo aumentam significativamente desde o dia 14 após o tratamento até o estágio de insuficiência ventricular direita, indicando hipertrofia do ventrículo direito. A relação úmido/seco do fígado também é significativamente aumentada no estágio de insuficiência ventricular direita, indicando edema do fígado, bem como insuficiência ventricular direita congestiva. A musculatura dos vasos interacinares aumenta progressivamente durante a progressão da hipertensão arterial pulmonar, com quase metade dos vasos exibindo meios musculares totais no dia 14 pós-tratamento em quase todas as arteríolas muscularizadas no estágio final da doença.Além disso, as lesões neointimais são observadas pela primeira vez no dia 21, com aproximadamente 65% de todas as arteríolas exibindo uma camada neointimal no final da progressão da doença. Isso resulta em oclusão vascular progressiva com até 60% do lúmen ocluído no estágio final da doença. Uma vez dominadas, essas técnicas podem ser concluídas em 20 minutos por técnica.Após este procedimento, outros métodos, como ecocardiografia ou loop de volume de pressão, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a função ventricular direita. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para que pesquisadores da área de hipertensão arterial pulmonar explorem os efeitos do aumento do fluxo sanguíneo na vasculatura pulmonar. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar um modelo para hipertensão arterial pulmonar induzida por fluxo em ratos e como analisar seus principais desfechos hemodinâmicos e histológicos.

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Research

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Medicina

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