Mapear o sítio de ligação de um Aptamer no ATP Usando MicroScale termoforese

O objetivo geral deste experimento é caracterizar as interações de pequenas moléculas de aptâmeros de DNA, incluindo mapeamento de locais de ligação, usando termoforese em microescala. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre parâmetros básicos de ligação de interações moleculares. A principal vantagem dessa tecnologia é que ela é independente do tamanho do parceiro de interação, permitindo a obtenção de dados de controle de qualidade de interações desafiadoras entre aptâmeros e pequenas moléculas.

Embora esse método possa fornecer informações sobre as interações de pequenas moléculas do aptâmero, ele também pode ser aplicado a outras interações moleculares, como interações medicamento-alvo ou antígeno/anticorpo. Para iniciar o procedimento, prepare uma solução estoque de 100 micromolares do aptâmero DNA DH25.42 marcado com Cy5 em água destilada. Em seguida, dilua a solução estoque de aptâmero para 200 nanomolares com tampão de ligação.

Incube a solução de trabalho do aptâmero por dois minutos a 90 graus Celsius. Resfrie a solução à temperatura ambiente no gelo. Em seguida, rotule e coloque tubos de microcentrífuga de 200 microlitros de baixa ligação para uma diluição em série de 16 etapas do ligante a ser testado.

Pipete 20 microlitros de uma solução estoque de 10 milimolares de ligante e tampão de ligação no tubo 1. Pipete 10 microlitros de tampão de ligação nos tubos 2 a 16. Em seguida, transfira 10 microlitros de estoque de ligante do tubo 1 para o tubo 2 e misture bem com a pipeta.

Transfira 10 microlitros da mistura diluída para o tubo 3 e misture bem. Continue a diluição em série desta forma, corrigindo os efeitos de diluição do tampão, se necessário, e descarte os 10 microlitros excedentes do tubo 16 quando terminar. Adicione 10 microlitros da solução de trabalho do aptâmero a cada diluição e misture bem com a pipeta.

Incubar as amostras durante cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, desenhe cada mistura em um capilar padrão limpo, certificando-se de tocar apenas o capilar nas extremidades. Coloque os capilares no suporte da bandeja em ordem decrescente de concentração.

Inicie o dispositivo MST e abra o software de controle do instrumento. Ative o controle manual de temperatura e defina a temperatura do instrumento para 25 graus Celsius. Quando o instrumento estiver na temperatura correta, insira a bandeja capilar.

Defina o canal de LED para vermelho para aptâmero rotulado como Cy5. Defina a potência do LED para atingir um sinal de fluorescência de 500 unidades. Em seguida, faça uma varredura capilar para obter as posições capilares e verificar a qualidade da amostra.

Se os picos resultantes forem em forma de U ou achatados, prepare novas amostras em capilares codificados para minimizar os efeitos de aderência. No software do instrumento MST, preencha a concentração do ligante e o tipo de diluição para o primeiro capilar. Clique e arraste para preencher as concentrações e diluições dos capilares restantes.

Insira a concentração do aptâmero na mistura final. Certifique-se de que o método do experimento esteja configurado para detectar fluorescência por cinco segundos, registre o MST por 30 segundos e, em seguida, registre a fluorescência por cinco segundos após desligar o laser. Defina a potência do laser para 20%Defina o caminho do arquivo e salve o arquivo do experimento.

Em seguida, inicie a medição do MST. Obtenha pelo menos três medições desta forma. Para iniciar a análise de dados, abra o software de análise MST e carregue o arquivo de experimento.

Selecione MST para o tipo de análise. O software de análise permite comparar repetições técnicas onde todas as medições foram do mesmo conjunto de capilares. Repetições biológicas de um conjunto diferente de capilares também podem ser adicionadas à análise.

Clique no botão de informações abaixo da primeira medição. Inspecione os traços MST em busca de saliências ou picos que indiquem efeitos de agregação ou precipitação. Em seguida, inspecione a varredura capilar e a sobreposição da forma capilar em busca de picos achatados ou em forma de U, indicando efeitos de aderência ou absorção.

Como os efeitos agregados e de absorção são rapidamente detectáveis no MST, o método permite uma otimização rápida e rápida da configuração técnica para garantir a qualidade ideal dos dados. Verifique se há efeitos de extinção ou realce de fluorescência dependentes de ligante na varredura capilar e na fluorescência inicial. Inspecione a mudança de fluorescência ao longo do tempo em busca de sinais de branqueamento ou aprimoramento de fotos.

Uma vez verificada a qualidade dos dados, mude para o modo de resposta à dose. Selecione a configuração de análise especializada na estratégia de avaliação T Jump MST. Em seguida, selecione o modelo de colina para ajuste de curva para calcular automaticamente os parâmetros de vinculação.

No menu comparar resultados, selecione um tipo de normalização. Exporte os dados normalizados como uma planilha ou arquivo PDF. Neste procedimento, o MST foi usado para investigar as interações de ligação de um aptâmero de DNA de fita única com uma seleção de ligantes de moléculas pequenas.

As curvas do MST foram ajustadas com a equação de hill e os valores de concentração efetiva da metade máxima foram determinados. Em cinco medições de repetições biológicas independentes do aptâmero com ATP, a interação do aptâmero ATP mostrou uma amplitude de ligação negativa de 6 a 13 unidades e um valor médio de EC50 de cerca de 52,3 micromolar. Os dados para cada ligante foram normalizados para a fração de moléculas ligadas e depois comparados.

Os valores de EC50 para ADP, AMP e SAM em comparação com ATP sugerem que o número de grupos fosfato tem no máximo uma influência menor no comportamento de ligação do aptâmero. A remoção do grupo hidroxal robo C2 também mostrou apenas um efeito menor na afinidade de ligação do aptâmero. O aptâmero não se ligou na ausência de um grupo de emparelhamento ou se o grupo de emparelhamento foi alterado para guanina.

O aptâmero se ligou apenas à adenina, indicando ainda que o grupo adenina é o principal local de ligação do aptâmero. Uma vez dominada, essa técnica pode fornecer informações essenciais sobre os parâmetros básicos de ligação em minutos a horas, se executada corretamente.