Name: Mapear o sítio de ligação de um Aptamer no ATP Usando MicroScale termoforese (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a caracterizar interações entre aptâmeros de DNA e pequenas moléculas usando MicroScale Thermophoresis. Este método quantifica afinidade e mapeia sítios de ligação em minutos.

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Os autores não têm confirmações.

1. Preparação de Trabalho Aptamer a Bolsa <ol><li> Seguir as instruções do fabricante e dissolve-se o oligonucleótido (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, a sequência de referência 18) em água, alcançando uma concentração final de 100 uM. </li><li> Preparar a solução de aptâmero de trabalho por diluição da oligonucleótido a 200 nm com tampão de ligação (Tris 20 mM, pH 7,6; NaCl 300 mM; MgCl2 5 mM; 0,01% Tween 20). </li><li> Incubar a mistura durante 2 min a 90 ° C, deixar a amostra arrefecer imediatamente para baixo sobre o gelo, e usar a amostra à temperatura ambiente. </li></ol> 2. Preparação da série de diluição Ligand <ol><li> Para cada ligando (trifosfato de adenosina (ATP), difosfato de adenosina (ADP), monofosfato de adenosina (AMP), adenina, guanosina trifosfato (GTP), trifosfato de citosina (CTP), desoxiadenosina-trifosfato (dATP), e s-adenosilmetionina (SAM) ; estoque 10 mM cada), preparar uma diluti série de 16 passosem em 200 ul tubos micro reação. NOTA: A centrifugação de ações ligando por 5 min a 14.000 xg pode ajudar a remover agregados. Baixo volume, tubos de reacção de ligação baixas são recomendadas para evitar a adsorção de moléculas com as paredes do tubo. </li><li> Comece com uma concentração máxima de, pelo menos, 50 vezes mais elevada do que a afinidade estimada e reduzir a concentração do ligando em 50% em cada passo de diluição. NOTA: A ferramenta concentração localizador implementado no software de controle simula dados de ligação e ajuda a encontrar o intervalo de concentração correta para a série de diluição. </li><li> Encher 20 ul de estoque o ligando (10 mM) no tubo 1. Adicionar 10 uL de tampão de ligação em tubos de reacção aptâmero micro 2-16. </li><li> Transferência de 10 ml de tubo 1 para o tubo 2 e misturar bem, pipetando para cima e para baixo várias vezes. Transferir 10 mL para o próximo tubo e repetir esta diluição para os tubos restantes. </li><li> Descartar o excesso de 10 ul a partir do último tubo. Evitar qualquer befeitos de diluição pode ser prejudicado. O tampão no tubo 1 e em tubos de 2-16 deve ser idêntica. </li></ol> 3. Preparação da Mistura final Reacção <ol><li> Preparar as reacções de ligação individuais com um volume de 20 ul (10 ul de solução de trabalho do aptâmero + 10 ul de diluição do respectivo ligando) para minimizar erros de pipetagem. Um volume de apenas 4 l é su fi ciente para encher o capilar. </li><li> Adicionar 10 ul da solução de trabalho de 200 nM de aptâmero de 10 ul de cada diluição de ligando e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo várias vezes. </li><li> Incubar as amostras durante 5 minutos a temperatura ambiente e encher as amostras padrão em capilares por meio de imersão dos capilares para a amostra. tempos de incubação mais longos podem ser necessários para algumas interacções; no entanto, 5 minutos é adequado para a maioria. Toque os capilares apenas sobre os lados, não na parte do meio, em que a medição óptica irá ser feita. </li><li> Coloque os capilares Onto thbandeja capilar e e iniciar o dispositivo MST. </li></ol> 4. Iniciar o dispositivo MST NOTA: O aparelho oferece dois pacotes de software pré-instalado, o &#39;&#39; &quot;software para a configuração técnica das condições experimentais e de controle &#39;&#39; análise de&quot; software para a interpretação dos dados produzidos. <ol><li> Antes de colocar a bandeja do capilar para o dispositivo MST, inicie o software de controle e ajustar a temperatura desejada geral, selecionando &#39;&#39; permitem controle de temperatura manual &quot;no &#39;&#39; controle de temperatura&quot; menu suspenso. Ajustar a temperatura para 25 ° C no presente modo. NOTA: Os instrumentos MST pode ser 22 a 45 ° C de temperatura controlada. </li><li> Aguarde até que a temperatura para atingir o nível esperado e, em seguida, colocar a bandeja do capilar para o dispositivo MST. </li><li> Ajuste o canal de LED para &#39;&#39; vermelho &quot;para corantes Cy5 e ajustar a potência de LED para ganhar uma fl uorescence sinal de 300 a 1000 unidades de fluorescência a do dispositivo com um sensor de MST padrão. 25% de energia LED é utilizado neste estudo. NOTA: 6.000 a 18.000 unidades de fluorescência são recomendados para o MST com um sensor de alta sensibilidade. </li></ol> 5. Capilar de digitalização <ol><li> Realize uma verificação capilar para verificar aspectos diferentes de qualidade da amostra, escolhendo a posição capilar no software &quot;Control&quot; e clicar em &quot;Start Scan cap&quot; antes de iniciar a medição MST. </li><li> Inspecione a varredura capilar para fluorescência realce / têmpera e efeitos degola (em forma de U ou achatadas picos) no software. NOTA: Mais detalhes sobre a detecção e tratamento de fluorescência e efeitos degola pode ser encontrada na discussão. </li></ol> 6. Medição MST NOTA: Antes de iniciar a medição MST, certifique-se de excluir degola efeitos, realce / efeitos de têmpera, ouerros de pipetagem, e garantir que a digitalização capilar indica que o sinal de fluorescência é su fi ciente. Para mais detalhes, veja a discussão. <ol><li> Atribuir os concentrações de ligando a partir da série de diluição para a respectiva posição capilar no software &quot;&quot; controle &quot;Considere o passo de diluição da mistura do aptâmero e o ligando. (1: 1). </li><li> Digite a maior concentração de ligando (5 mM) para capilar # 1, selecione o tipo de diluição correta (aqui, 1: 1), clique sobre a concentração máxima e use a função arrastar para atribuir automaticamente as concentrações restantes capilares # 2- 16. A concentração mais baixa é de 152,6 nm. </li><li> Introduza a concentração de aptâmero uorescente FL (aqui, 100 nM) na respectiva secção do software de controlo. </li><li> Use as configurações padrão, que detectam a fluorescência durante 5 segundos, registrar o MST durante 30 segundos, e registrar a fluorescência por mais 5 segundos após a inativação do laser t<html> o monitorar a difusão volta das moléculas. </li><li> Ajustar a potência do laser para 20% na respectiva secção do software de controlo. NOTA: A fim de receber a melhor relação sinal-ruído e para evitar os efeitos não específicos, uma potência de laser de 20-40% é recomendada. Em casos específicos, a potência do laser maior pode ser necessária para obter uma boa separação de moléculas não ligadas e ligados. </li><li> Salve o experimento depois de selecionar a pasta de destino e iniciar a medição do MST, premindo o botão &#39;&#39; de medição Iniciar MST &quot;. NOTA: O arquivo .ntp será gerado na pasta de destino. Usando esta configuração, uma medida dura 10-15 min. </li><li> Repetir o procedimento experimental pelo menos duas vezes para uma determinação mais precisa do valor de CE 50. NOTA: Para testar a reprodutibilidade técnica, os mesmos capilares podem ser digitalizados várias vezes (repete técnicas). </li></ol> 7. Análise de Dados MST nt &quot;&gt; NOTA: O software de análise permite a análise de dados sobre a fl y durante a medição O software de análise de traça os traços de tempo MST e mudanças no normalizada fluorescência (norma F) versus a concentração do ligando 37.. <ol><li> Inicie o software de análise de MST (Análise MO.Affinity) e carregar o arquivo .ntp da pasta de destino. Selecione &quot;MST&quot; como o tipo de análise no menu de seleção de dados. Nota: Em caso de efeitos de fluorescência dependente do ligando, a fluorescência inicial pode ser escolhida para análise. </li><li> Adicionar o respectivo prazo (s) técnica ou biológica com uma nova análise por arrastar-e-soltar ou pressionando o botão &quot;+&quot; abaixo do respectivo prazo experimental. </li><li> Pressione o botão informações abaixo do respectivo prazo experimental para obter informações sobre as propriedades do experimento, os traços do MST, varredura capilar, forma capilar, fluorescência inicial e taxa de branqueamento. Nota: Estes dados brutos podem alpor isso ser inspecionados em etapas posteriores da análise. </li><li> Inspecione visualmente os vestígios do MST para efeitos de agregação e precipitação, visível como colisões e picos. NOTA: Para mais informações sobre a detecção e tratamento dos efeitos de agregação, leia a discussão. </li><li> inspecionar visualmente a varredura capilar e a sobreposição de forma capilar para efeitos de adsorção, visível como picos achatadas ou em forma de U. inspecionar visualmente a varredura capilar e a fluorescência inicial para efeitos de fluorescência. inspecionar visualmente a taxa de branqueamento para efeitos fotodegradação. </li><li> Alternar para o modo de dose-resposta e altere a configuração de análise para o modo &quot;expert&quot; pressionando o respectivo botão. Selecione &quot;T-Jump&quot;, como a estratégia de avaliação MST. </li><li> Selecione o modelo de &quot;Hill&quot; para a curva fi tting. Os parâmetros de ligação será automaticamente calculado. Normalizar os dados, escolhendo o respectivo tipo de normalização no menu &quot;comparar os resultados&quot;. exportar odados tanto como um .xls ou .pdf. NOTA: A tabela abaixo do gráfico de ligação resume os parâmetros obrigatórios calculados. </li></ol>

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</ol>

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controles de qualidade: Inespecífica colagem / adsorção do material da amostra para as superfícies, bem como os efeitos de agregação, ter uma influência dramática na qualidade dos dados de afinidade. No entanto, apenas algumas tecnologias state-of-the-art oferecem opções precisas e rápidas para monitorar e evitar esses efeitos. MST oferece controlos de qualidade integrados que detectam e ajudar a ultrapassar estes problemas, permitindo a optimização gradual da configuração técnica. informações ...

A interacção entre as moléculas é a base da natureza. Assim, os cientistas em diversas áreas de pesquisa básica e aplicada tentar entender os princípios fundamentais de interacções moleculares de diferentes tipos. MicroScale termoforese (MST) permite aos cientistas realizar a caracterização rápida, precisa e de custo eficiente e de qualidade controlada de interações moleculares em solução, com uma livre escolha de buffers. Já existem mais de 1.000 publicações utilizando MST, a partir de 2016 sozinho, descrevendo diferentes tipos de análises, incluindo rastreios de bibliotecas, a ligação validações de eventos, ensaios de competição, e experimentos com múltiplos parceiros de ligação 1-8. Em geral, o MST permite o estudo dos parâmetros de ligação clássicos, tais como a afinidade de ligação (pM para mM), estequiometria, e termodinâmica, de qualquer tipo de interacção molecular. Uma grande vantagem de MST é a possibilidade de estudar eventos de ligação independentes do tamanho dos parceiros de interacção. mesmo chalinteracções entre lenging aptâmeros de ácidos nucleicos pequenos (15-30 nt) e alvos, tais como pequenas moléculas, drogas, antibióticos, ou metabolitos podem ser quantificados. Atuais tecnologias state-of-the-art para caracterizar as interações aptâmero-alvo são ou lab-intenso e altamente complexa ou não quantificar aptâmero-pequena molécula interações 9,10. Superfície Plasmon Resonance (SPR) à base de ensaios de 11,12 e abordagens calorimétricos verdadeiramente livre de rótulo, como Calorimetria isotérmica de titulação (ITC) 13-15, eluição isocrática 16, o equilíbrio infiltração 17,18, em linha sondagem 19, distribuição do gel mudar ensaios, stopped- fluxo de fluorescência espectroscopia 20,21, anisotropia de fluorescência (FA) 22,23, uma única molécula de fluorescência de imagem 24,25, e Bio-camada de interferometria (BLI) 26 também são ou imprecisa ou incompatível com a molécula do aptâmero-small interacções. Outros principal questões de estes métodos são de baixa sensibilidade, o consumo elevado de amostras, imobilização, as limitações de transporte de massa em superfícies, e / ou restrições de buffer. Apenas algumas destas tecnologias oferecem controles integrados para efeitos de agregação e de adsorção. MST representa uma ferramenta poderosa para os cientistas para superar esta limitação para estudar as interacções entre os aptâmeros e pequenas moléculas 27-29, bem como outros objectivos, tais como proteínas de 30-33. A tecnologia baseia-se no movimento de moléculas através de gradientes de temperatura. Este movimento dirigido, chamado &quot;termoforese,&quot; depende do tamanho, carga, e camada de hidratação da molécula 34,35. A ligação de um ligando para a molécula irá alterar directamente, pelo menos, um destes parâmetros, o que resulta em uma mobilidade alterada thermophoretic. Ligantes com tamanhos pequenos podem não ter um impacto considerável em termos de mudança de tamanho do não ligado ao estado ligado, mas eles podem ter dr<html> efeitos AMATIC sobre a camada de hidratação e / ou carga. As mudanças no movimento das moléculas após thermophoretic interacções com o parceiro de ligação permite a quantificação dos parâmetros de ligação de base 2,7,34,36,37. Tal como representado na Figura 1A, o dispositivo consiste MST de um laser infravermelho focalizada sobre a amostra, dentro dos capilares de vidro utilizando a mesma óptica como para a detecção de fluorescência. O movimento thermophoretic de proteínas através da fluorescência intrínseca dos resíduos de triptofano 6 ou de um parceiro de interacção 3,8 marcado por fluorescência podem ser monitorizadas enquanto o laser estabelece um gradiente de temperatura (AT de 2-6 ° C). A diferença de temperatura, resultando em espaço, AT, conduz à depleção ou da acumulação de moléculas na zona de temperatura elevada, que pode ser quantificado pelo coeficiente Soret (S T): g &quot;/&gt; c representa quente a concentração na região aquecida, e c frio é a concentração na região fria inicial. Como mostrado na Figura 1B, uma típica MST os resultados da experiência em um perfil de movimento MST (traço do tempo), que consiste em diferentes fases, que podem ser separadas pelos respectivos prazos. A fluorescência é medida inicial nos primeiros 5 s na ausência do gradiente de temperatura para definir a fluorescência a partir preciso e para verificar a fotobranqueamento ou photoenhancement. O salto de temperatura (T-Jump) representa a fase em que a fluorescência mudanças antes do movimento thermophoretic. Essa redução inicial na fluorescência depende de mudanças dependentes do calor de fl uorophore rendimento quântico. A fase termoforese segue, em que as reduções de fluorescência (ou aumento), devido ao movimento das moléculas de thermophoretic até que a distribuição em estado estacionário é atingido.O TJump reversa e concomitante difusão de moléculas de volta uorescent fl pode ser observado como indicado na figura 1B após o laser é desligado. De modo a aceder aos parâmetros de ligação de base, diferentes razões molares dos parceiros de interacção são analisados ​​e comparados. Tipicamente, 16 diferentes proporções são estudadas numa experiência MST, enquanto que a molécula visível óptico é mantido constante e é fornecido com uma quantidade crescente de ligando não marcado. A interacção entre os dois parceiros de ligação induz alterações na termoforese, e, assim, na fluorescência normalizada, F norma, que é calculada como se segue: <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F quente e fria F representam em média intensidades fluorescência na de fi nidas pontos no tempo dos traços do MST. As afinidades de ligação (Kd ou valores de EC50) pode ser calculada por Curve encaixe (Figura 1C). No geral, o MST é uma ferramenta poderosa para estudar interações moleculares de qualquer tipo. Este manuscrito oferece um protocolo para caracterizar a interação desafio entre a pequena molécula de trifosfato de adenosina (ATP; 0,5 kDa) e do 25-nt curta ssDNA aptâmero DH25.42 (7,9 kDa). Ao longo do manuscrito, o local de ligação do aptâmero na molécula de ATP é mapeado para baixo para o grupo de adenina do ATP.

<table><tbody><tr>Tampão <td></td><td></td><td>de ligação aptâmero</td><td>20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20</td></tr><tr><td>ATP marcado com fluorescência aptâmero</td><td>IDT, Leuven, Bélgica</td><td></td><td>sequência: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich, Alemanha&nbsp;</td><td>A2383</td><td>10 mM de soluções de estoque armazenadas a - 20 °; C</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma Aldrich, Alemanha&nbsp;</td><td>A2754</td><td>10 mM de soluções de reserva armazenadas a - 20 °; C</td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma Aldrich, Alemanha&nbsp;</td><td>A2252</td><td>10 mM de soluções de reserva armazenadas a - 20 °; C</td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma Aldrich, Alemanha&nbsp;</td><td>A8626</td><td>10 mM soluções de reserva armazenadas a - 20 °; C</td></tr><tr><td>SAM</td><td>Sigma Aldrich, Alemanha&nbsp;</td><td>A7007</td><td>10 mM soluções de estoque armazenadas a - 20 &graus; C</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Sigma Aldrich, Alemanha&nbsp;</td><td>11934511001</td><td>10 mM de soluções de reserva armazenadas a - 20 °; C</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma Aldrich, Alemanha&nbsp;</td><td>C1506</td><td>10 mM de soluções de reserva armazenadas a - 20 °; C</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich, Alemanha&nbsp;</td><td>G8877</td><td>Soluções de estoque de 10 mM armazenadas a - 20 graus; Monólito C</td></tr><tr><td>NT.115&nbsp;</td><td>NanoTemper Technologies, Munique, Alemanha</td><td>Dispositivo MO-G008</td><td>Blue/Red Channel MST com detector padrão, Monolith NT115 pico é um dispositivo MST com detector de alta sensibilidade</td></tr><tr><td>Monolith NT.115 capilares Standard</td><td>NanoTemper Technologies, Munique, Alemanha</td><td>MO-K002</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR tubes Eppendorf</td><td>, Alemanha</td><td>30124537</td><td></td></tr><tr><td>Software de controle Monolith. 2.1.33, pré-instalado em o dispositivo</td><td>NanoTemper Technologies, Munique, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MO.affinity analysis v2.1.1</td><td>NanoTemper Technologies, Munique, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph 4.5.2</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapear o sítio de ligação de um aptamer no atp usando microscale termoforese

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

A caracterização das interações moleculares em termos de parâmetros básicos de ligação, como afinidade de ligação, estequiometria e termodinâmica, é uma etapa essencial na ciência básica e aplicada. A termoforese em microescala (MST) é um método biofísico sensível para obter essas informações importantes. Contando com um efeito físico chamado termoforese, que descreve o movimento das moléculas através de gradientes de temperatura, essa tecnologia permite a determinação rápida e precisa dos parâmetros de ligação em solução e permite a livre escolha das condições de tampão (de tampão a lisados/soros). O MST usa o fato de que uma molécula não ligada exibe um movimento termoforético diferente de uma molécula que está em complexo com um parceiro de ligação. O movimento termoforético é alterado no momento da interação molecular devido a mudanças no tamanho, carga e hidratação da casca. Ao comparar os perfis de movimento de diferentes proporções moleculares dos dois parceiros de ligação, informações quantitativas como afinidade de ligação (pM a mM) podem ser determinadas. Mesmo interações desafiadoras entre moléculas de tamanhos pequenos, como aptâmeros e pequenos compostos, podem ser estudadas pelo MST. Usando a interação do modelo bem estudada entre o aptâmero de DNA DH25.42 e o ATP, este manuscrito fornece um protocolo para caracterizar as interações aptâmero-moléculas pequenas. Este estudo demonstra que o MST é altamente sensível e permite o mapeamento do sítio de ligação do aptâmero de DNA de 7,9 kDa à adenina do ATP.

Neste estudo, o MST foi aplicado para caracterizar o local de ligação do aptâmero ADN DH25.42 18 em ATP. Em contraste com outros estudos que caracterizam a interacção de ATP ou ATP-imitando as moléculas pequenas com as proteínas marcadas aleatoriamente com um ou mais fluoróforos 38-40, este estudo inclui uma versão marcada do aptâmero 7,9 kDa ADNcs com uma molécula de Cy5 na extremidade 5&#39; . Diferentes derivados de ATP e de moléculas relacionadas, todos diferind...

A termoforese em microescala (MST) é uma tecnologia sensível para caracterizar as interações aptâmero-alvo. Este manuscrito descreve um protocolo MST para caracterizar as interações aptâmero-pequenas moléculas.

Mapear o sítio de ligação de um Aptamer no ATP Usando MicroScale termoforese

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

O objetivo geral deste experimento é caracterizar interações entre aptâmeros de DNA e moléculas pequenas, incluindo o mapeamento do sítio de ligação, utilizando termoforese em microescala. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre parâmetros básicos de ligação em interações moleculares. A principal vantagem desta tecnologia é que ela é independente do tamanho do parceiro de interação, permitindo obter dados de controle de qualidade de interações desafiadoras entre aptâmeros e moléculas pequenas.Embora este método possa fornecer informações sobre as interações entre aptâmeros e moléculas pequenas, ele também pode ser aplicado a outras interações moleculares, como interações fármaco-alvo ou antígeno/anticorpo. Para iniciar o procedimento, prepare uma solução estoque de 100 micromolar do aptâmero de DNA marcado com Cy5 DH25.42 em água destilada. Em seguida, dilua a solução estoque do aptâmero para 200 nanomolar com tampão de ligação.Incube a solução de trabalho do aptâmero por dois minutos a 90 graus Celsius. Resfrie a solução até a temperatura ambiente em gelo. Em seguida, rotule e prepare tubos microcentrífugos de baixa ligação de 200 microlitros para uma diluição seriada de 16 etapas do ligante a ser testado.Pipete 20 microlitros de uma solução estoque de 10 milimolar do ligante e tampão de ligação para o tubo 1. Pipete 10 microlitros de tampão de ligação para os tubos 2 a 16. Em seguida, transfira 10 microlitros da solução estoque do ligante do tubo 1 para o tubo 2 e misture bem com a pipeta.Transfira 10 microlitros da mistura diluída para o tubo 3 e misture bem. Continue a diluição em série desta forma, corrigindo os efeitos da diluição do tampão, se necessário, e descarte os 10 microlitros excedentes do tubo 16 ao finalizar. Adicione 10 microlitros da solução de trabalho do aptâmero a cada diluição e misture bem com a pipeta.Incube as amostras por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, aspire cada mistura para dentro de um capilar padrão limpo, tomando cuidado para tocar o capilar apenas nas extremidades. Coloque os capilares no suporte da bandeja em ordem decrescente de concentração.Inicie o dispositivo de MST e abra o software de controle do instrumento. Habilite o controle de temperatura manual e ajuste a temperatura do instrumento para 25 graus Celsius. Quando o instrumento atingir a temperatura correta, insira a bandeja de capilares.Defina o canal de LED para vermelho para o aptâmero marcado com Cy5. Ajuste a potência do LED para obter um sinal de fluorescência de 500 unidades. Em seguida, realize uma varredura capilar para obter as posições dos capilares e verificar a qualidade da amostra.Se os picos resultantes forem em forma de U ou achatados, prepare novas amostras em capilares codificados para minimizar os efeitos de aderência. No software do instrumento MST, preencha a concentração do ligante e o tipo de diluição para o primeiro capilar. Clique e arraste para preencher as concentrações e diluições dos capilares restantes.Insira a concentração do aptâmero na mistura final. Certifique-se de que o método do experimento esteja configurado para detectar fluorescência por cinco segundos, registrar a MST por 30 segundos e, em seguida, registrar a fluorescência por cinco segundos após desligar o laser. Ajuste a potência do laser para 20%. Defina o caminho do arquivo e salve o arquivo do experimento.Em seguida, inicie a medição de MST. Obtenha pelo menos três medições desta forma. Para iniciar a análise dos dados, abra o software de análise de MST e carregue o arquivo do experimento.Selecione MST para o tipo de análise. O software de análise permite comparar repetições técnicas em que todas as medições foram feitas no mesmo conjunto de capilares. Repetições biológicas provenientes de um conjunto diferente de capilares também podem ser adicionadas à análise.Clique no botão de informações abaixo da primeira medição. Inspecione os traços de MST em busca de irregularidades ou picos que indiquem agregação ou efeitos de precipitação. Em seguida, examine a varredura do capilar e a sobreposição da forma do capilar em busca de picos achatados ou em formato de U, indicativos de aderência ou efeitos de absorção.Como os efeitos de agregação e absorção são rapidamente detectáveis na MST, o método permite uma otimização rápida e eficiente da configuração técnica para garantir qualidade ideal dos dados. Verifique a presença de efeitos de quenching ou aumento da fluorescência dependentes do ligante na varredura do capilar e na fluorescência inicial. Examine a variação da fluorescência ao longo do tempo em busca de sinais de fotoesbranquecimento ou fotoaumento.Após a qualidade dos dados ter sido verificada, mude para o modo de resposta à dose. Selecione a configuração de análise avançada na estratégia de avaliação de T Jump MST. Em seguida, selecione o modelo de Hill para ajuste da curva a fim de calcular automaticamente os parâmetros de ligação.No menu comparar resultados, selecione um tipo de normalização. Exporte os dados normalizados como uma planilha ou arquivo PDF. Neste procedimento, a MST foi utilizada para investigar as interações de ligação de um aptâmero de DNA de fita simples com uma seleção de ligantes de moléculas pequenas.As curvas de MST foram ajustadas com a equação de Hill e os valores de concentração efetiva máxima metade foram determinados. Em cinco medições biológicas independentes repetidas do aptâmero com ATP, a interação entre o aptâmero e o ATP mostrou uma amplitude de ligação negativa de 6 a 13 unidades e um valor médio de EC50 de aproximadamente 52,3 micromolar. Os dados para cada ligante foram normalizados à fração de moléculas ligadas e, em seguida, comparados.Os valores de CE50 para ADP, AMP e SAM em comparação com ATP sugerem que o número de grupos fosfato tem, no máximo, uma influência mínima no comportamento de ligação do aptâmero. A remoção do grupo hidroxila C2 do robo também mostrou apenas um efeito menor na afinidade de ligação do aptâmero. O aptâmero não se ligou na ausência de um grupo pareado ou se o grupo pareado foi alterado para guanina.O aptâmero realmente se ligou à adenina isolada, indicando ainda mais que o grupo de adenina é o sítio principal de ligação para o aptâmero. Uma vez dominada, esta técnica pode fornecer informações essenciais sobre parâmetros básicos de ligação em minutos a horas, se realizada corretamente.

mapping-binding-site-an-aptamer-on-atp-using-microscale

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Protocolos SELEX compreendem várias rodadas de seleção, cada um dos que exigem a regeneração de ligantes vinculado, que por sua vez requerem seqüências de primers que flanqueiam as regiões fixo biblioteca aleatória. Essas seqüências de primers fixo pode interferir com o processo de seleção (falsos positivos e negativos). Aqui apresentamos um primer sem protocolo.

Primer-Free Seleção Aptamer usando uma biblioteca de DNA Aleatório

Este vídeo demonstra a termoforese em microescala para estudar a interação proteína-lipídio. O ensaio detecta a interação entre as moléculas quantificando o movimento termoforético de proteínas marcadas com fluorescência em resposta a um gradiente de temperatura. A molécula fluorescente é misturada com diferentes concentrações das moléculas lipídicas não fluorescentes, e a mistura de moléculas na solução é carregada nos capilares. Um gradiente de temperatura é aplicado às amostras nos capilares...

Termoforese em microescala para estudar interações proteína-lipídio em solução

Termoforese microescala (MST) pode ser amplamente utilizado para a determinação da afinidade de ligação sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O protocolo envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida, a lise das células em condições não desnaturantes, e detecção de sinal MST na presença de várias concentrações do ligando.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

Um protocolo é fornecido para selecionar aptâmeros de comutação de estrutura para alvos de moléculas pequenas com base em um método de seleção de esferas magnéticas de rigor ajustável. Os aptâmeros selecionados com propriedades de comutação de estrutura são benéficos para ensaios que requerem uma mudança conformacional para sinalizar a presença de um alvo, como o ensaio de nanopartículas de ouro descrito.

Um método para selecionar Aptamers de comutação Estrutura Aplicado a um colorimétrico nanopartículas de ouro Assay

É apresentado um protocolo para a seleção em vitro e caracterização de aptamers de DNA de ligação éster ácido ftálico de grupo específico. A aplicação do aptamer selecionado em um aptasensor eletroquímico também está incluída.

Seleção de Aptamer de DNA de ligação éster de ácido ftálico, caracterização e aplicação de um Aptasensor eletroquímica

A termoforese de microescala obtém constantes de ligação rapidamente a baixo custo de material. A termoforese de microescala rotulada ou sem rótulo está comercialmente disponível; no entanto, a termoforese livre de rótulos não é capaz da diversidade de medidas de interação que podem ser realizadas usando rótulos fluorescentes. Fornecemos um protocolo para medições de termoforese rotuladas.

Uso de Termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas

Este protocolo apresenta um método para medir a ligação de adenina nucleotídica a receptores em tempo real em ambiente celular. A ligação é medida como transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre derivados de nucleotídeos trinitrofenila e proteínas marcadas com um aminoácido fluorescente não canônico.

Medindo a ligação de nucleotídeos a proteínas de membrana intactas e funcionais em tempo real

O presente protocolo descreve o uso da Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) para analisar a cinética de associação e dissociação da ligação entre um aptâmero de DNA e tetraciclina, incluindo a preparação de amostras, padrões de corrida e amostras, e a interpretação dos dados resultantes.

Determinando a associação termodinâmica e cinética de um aptamer de DNA e tetraciclina usando calorimetria de titulação isotérmica

Um passo necessário no desenvolvimento do aptâmero anticâncer é testar sua ligação ao alvo. Demonstramos um ensaio baseado em citometria de fluxo para estudar essa ligação, enfatizando a importância de incluir um aptâmero de controle negativo e células cancerígenas que são positivas ou negativas para essa proteína em particular.

Um ensaio de ligação de proteínas de superfície celular baseado em citometria de fluxo para avaliar a seletividade e a especificidade de um Aptamer anticancerígeno

O presente protocolo demonstra o uso de um ensaio rápido de amplificação exponencial baseado em aptâmeros de 3 estágios para detectar alvos. A preparação da amostra, a amplificação do sinal e o desenvolvimento da cor são abordados para implementar este sistema para reconhecer a presença de teofilina sobre a cafeína.

Detecção de alvos baseada em aptâmero facilitada por uma reação de amplificação exponencial isotérmica G-quadruplex de 3 estágios

Este protocolo descreve o projeto de sondas de hibridização dividida utilizando o aptâmero de luz fluorescente DAP-10-42 como repórter de sinal e sua aplicação para detecção de ácido nucleico e diferenciação entre alvos com substituições de nucleotídeo único.

Sonda de hibridização dividida utilizando um aptâmero de luz fluorescente de DNA como repórter de sinal para análise de ácido nucleico de sequência específica

Aprenda a caracterizar interações entre aptâmeros de DNA e pequenas moléculas usando MicroScale Thermophoresis. Este método quantifica afinidade e mapeia sítios de ligação em minutos.

Mapear o sítio de ligação de um Aptamer no ATP Usando MicroScale termoforese

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