Name: Um carcinoma de células Singênico Rato Modelo de metastático renal para Quantitativa e Longitudinal Avaliação da pré-clínicos Terapias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Aprenda a estabelecer tumores renais ortotópicos em camundongos imunocompetentes através da implantação intrarrenal de células Renca. Este modelo permite estudar crescimento tumoral, metástase pulmonar e avaliar terapias anticâncer em oncologia urológica.

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Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional do Câncer (R15CA173657 para AW e R01CA109446 para TSG), o Instituto do Câncer Simmons (a AW), e da Universidade de Minnestoa Suba Cancer Foundation 4 Kidney (a TSG). Agradecemos ao Dr. Kristin Anderson para a assistência com a imunofluorescência.

O protocolo seguinte descreve um procedimento experimental para a indução e monitorização do crescimento de tumores ortoticos renais experimentais e quaisquer potenciais metástases espontâneas. Todos os seguintes procedimentos são feitos de acordo com as políticas institucionais e procedimentos aprovados em relação ao uso humano dos animais experimentais. 1. A manutenção de linhas celulares <ol><li> Manter a linha celular de adenocarcinoma renal murino, Renca, no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina, e 1 mM de cada um dos não-aminoácidos essenciais, L-glutamina , e piruvato de sódio (designado por RPMI completo). Células de cultura numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. NOTA: Como com qualquer linha celular estabelecida, é recomendado o uso de baixa passagem-Número células Renca para a transfecção e implantação subsequente para minimizar quaisquer fenotípicas ou genéticas alterações que podem ocorrer após culto longo prazoure. <ol><li> Usar um sistema de transposões para manipular células Renca para expressar de forma estável a proteína verde fluorescente (GFP) e luciferase de pirilampo. <ol><li> Usando uma poliacrilamida catiónica à base de lipossomas reagente de transfeco, a co-transfectar células Renca com um vector de expressão de transposase (pPGK-SB11) e uma codificação de transposão vector para a expressão de luciferase do pirilampo, bem como um gene que codifica a fusão para GFP e o gene de resistência à zeocina , ambos sob o controlo transcricional de um promotor bidireccional (pKT2 / Lubig) 19. </li><li> Dois dias mais tarde, as células transfectadas placa, a uma diluição limitante e permitir que as células a expandir-se em meio RPMI completo suplementado com zeocina (300? G / mL). Confirmar a expressão da GFP em cada um dos clones por citometria de fluxo. Estas células são denominadas Renca-GL. NOTA: clonagem Limitando-diluição irá permitir que as células seleccionadas para ser derivadas de uma única célula. </li></ol></li></ol></li><li> Para implantar células Renca intrarenally, preparar células Renca into uma suspensão de uma única célula a 2 x 10 6 culas / mL em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS). <ol><li> Remover as células Renca aderentes a partir do balão de cultura de tecidos usando tripsina a 0,25% em HBSS. Após ~ 5 minutos, adiciona-RPMI completo ao frasco para neutralizar a tripsina e transferência das células para um tubo de centrífuga para a lavagem. Centrifugar as células a 300 g de força centrífuga relativa (RCF xg) durante 5 min a 25 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender as células em HBSS. Contar as células utilizando um hemocitómetro e ajustar o volume com HBSS para se obter 2 X 10 6 células / ml. </li><li> Desenhar as células para uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de calibre 18 para evitar que a tensão de corte sobre as células. Substituir a agulha de calibre 18 com uma agulha de calibre 28, antes da injecção das células tumorais. Uma injecção de 0,1 mL de entrega 2 x 10 5 culas para o rim. </li></ol></li></ol> 2. Preparação área cirúrgica <ol><li> Prepare um cirúrgica estérilárea em uma cabine de segurança biológica, colocando uma cortina cirúrgica estéril sobre uma almofada de aquecimento. Reunir todas as fontes, incluindo fórceps, bisturi, tesouras, gotas para os olhos, 5% gaze povidona-iodo-séptico, e estéril. Autoclave todos os instrumentos antes de usar. </li><li> Realizar a cirurgia usando uma técnica de ponta asséptica. instrumentos reesterilizar entre animais com um esterilizador talão. Usar luvas estéreis, um jaleco e uma máscara facial. </li></ol> 3. Preparação de animais <ol><li> Anestesiar os ratos com cetamina / xilazina (87,5 mg / kg e 12,5 mg / kg, respectivamente, IP), de acordo com as orientações institucionais. Determinar a profundidade da anestesia através da realização de um dedo do pé-pitada. </li><li> Quando o animal é considerado não-responsivo, preparar o local da injecção (por exemplo, flanco esquerdo) em ratos Balb / c por depena (com os dedos) ou de barbear (usando cortadores) da pele. </li><li> Mover os ratinhos a partir da área de preparação a cirurgia (por exemplo, a caixa de alojamento) para a área cirúrgica e aplicar pomada veterinário para oolhos para prevenir o ressecamento. Liberalmente pincelar o local da incisão preparado com anti-séptico 5% de povidona-iodo. </li><li> Injectar cloridrato de bupivacaa (0,1 mL de uma 2,5 mg / mL de solução, SC) na área onde a incisão será feita como uma analgesia pré-operatória. </li><li> Fazer uma única incisão (~ 1,0 - 1,5 cm) no flanco esquerdo dos animais utilizando um bisturi ou tesouras estéril, com cuidado para não penetrar o peritoneu. Separa-se a derme do peritoneu com uma tesoura estéreis. Dab o local da incisão com gaze de algodão estéril para remover qualquer vestígio de sangue. </li><li> Segure o mouse com ambas as mãos, usando a mão esquerda para segurar a cabeça ea mão direita para apoiar o flanco. </li><li> Identificar o baço através do peritoneu e, com um dedo da mão direita, apalpar o rato a partir de baixo; o rim agora deve ser visível através do peritônio. Mantenha um firme do animal para fornecer tensão em todo o peritônio e rim. </li><li> Ter uma segunda pessoa injetar o ce tumorlls (preparada na secção 1.2.) através do peritoneu intacto para o centro do rim, utilizando uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de calibre 28. Proporcionar-se lentamente 0,1 mL (2 x 10 5) de células. Uma vez que as células são injectadas, segure a agulha no lugar, durante 5 - 10 s para reduzir o refluxo de células. É importante observar a necessidade de cuidado extremo durante este passo, como a pessoa injectando as células irá trazer a agulha em estreita proximidade com os dedos da pessoa que segura o rato. </li><li> Remover a agulha e fechar a incisão com uma fina camada de adesivo de tecido de cianoacrilato. </li><li> Colocar o animal de volta para uma gaiola limpa com uma toalha de papel estéril. Que os animais possam se recuperar em uma almofada de aquecimento. Não deixar os animais sem vigilância durante o período de recuperação. Não retornar os animais às condições de alojamento padrão até que estejam na posição vertical e esternal. Siga as orientações institucionais em todos os procedimentos que utilizam animais de laboratório. </li></ol> 4. BioImagem luminescente <ol><li> Monitorar o crescimento do tumor por imagem de bioluminescência. NOTA: detalhes de procedimento para a execução de imagiologia bioluminescente pode ser obtido a partir de Lim et al. 20 O sinal da luciferase pode ser detectada tão cedo quanto 24 h após implantação de células de tumor. Como não há nenhum tumor visível do exterior, neste modelo, é essencial para monitorar o crescimento do tumor periodicamente. Dependendo da experiência concebida, o crescimento do tumor ortotico pode prosseguir durante períodos de tempo variáveis. Uma vantagem de usar as células Renca-expressar luciferase é que o crescimento do tumor pode ser repetidamente monitorizada no mesmo animal em intervalos regulares durante todo o período da experiência, e uma interrogação específica de portador de tumor e órgãos livres de tumor pode ser feito numa ponto final definido. <ol><li> Injectar luciferina (0,1 mL de uma solução a 15 mg / ml em PBS estéril) ip e permitir que ele se circular durante 10 minutos antes de colocar o rato para o sistema de imagem de bioluminescência. Coloque o mo<html> usar com o lado dorsal para cima, laminagem ligeiramente de lado, a fim de ter o rim injectado para cima. </li><li> Medir o peso do tumor em fotões de luz emitidos por segundo (fluxo de fotões) dentro de uma região definida de interesse (ROI), usando software de análise de imagem. </li></ol></li><li> Quantificação da carga tumoral em órgãos individuais. NOTA: A quantificao pode ser realizada em pontos de tempo definidos em órgãos individuais após a sua remoção a partir de ratos sacrificados. <ol><li> Injectar os ratinhos com luciferina, tal como no passo 4.1. </li><li> Após 10 min, sacrificar os ratinhos utilizando um procedimento aprovado. </li><li> Dissecar os órgãos de interesse (por exemplo, os rins e pulmões; ver secção 5 abaixo). Transferir o tecido a placas de Petri de 35 x 10 mm e colocá-las no sistema de imagem de bioluminescência. </li><li> Medir o peso do tumor em fotões de luz emitidos por segundo (fluxo de fotões) dentro de um ROI definida usando software de análise de imagem. </li></ol></li></ol><html> e_title &quot;&gt; 5. Órgão Colheita <ol><li> Em um ponto final definido para o experimento indivíduo, eutanásia ratos portadores de tumores de acordo com as orientações institucionais preferidos (por exemplo, CO 2, deslocamento cervical, overdose de anestesia). No entanto, evitar a deslocação cervical se os pulmões devem ser recolhidas após a inflação tinta da China. </li><li> Realizar uma avaliação bruta do crescimento do tumor primário renal no rim injectado através da medição do peso dos órgãos molhado. <ol><li> Para determinar a massa de tumor (em g), isolar 21 e pesar o rim com tumor e o rim contralateral do mesmo ratinho, onde a diferença de pesos de rim define a massa do tumor. Cuidadosamente dissecar afastado qualquer tecido conjuntivo estranho a partir dos rins excisados ​​antes de medir os seus pesos. </li></ol></li><li> Avaliar o grau de metástase do tumor para os pulmões por inflar os pulmões com tinta da Índia antes da excisão e fixa imediatamente os pulmões em solução de Feketelass = &quot;xref&quot;&gt; 22. Cálculo manual de lesões metastáticas na superfície do pulmão pode então ser realizada. <ol><li> Faça uma incisão na linha média com uma tesoura a partir de meados do abdômen, através da caixa torácica, e através das glândulas do pescoço / salivares. Cuidadosamente remover a caixa torácica utilizando tesouras e pinças, sem comprometer o tecido pulmonar. </li><li> Expor a traqueia através da remoção do tecido conjuntivo. </li><li> Prepara-se uma seringa de 3 mL com uma agulha de 18 gauge cheia com uma solução de tinta da China 10% em HBSS. </li><li> Utilizando uma pinça, passe cuidadosamente uma sutura de seda sob a traquéia. Isso será usado para amarrar a traqueia, uma vez inflado. </li><li> Cuidadosamente inserir a agulha para baixo a traqueia e lentamente deprimir a seringa para inflar os pulmões com a solução de tinta Índia. Cerca de 1 - 1,5 mL de uma solução de tinta Índia vai insuflar completamente os pulmões. </li><li> Comprima a traqueia fechada atando vários nós, com o fio de sutura abaixo da agulha para inibir o escoamento de retorno da tinta. </li><li> REMOVe a agulha e cortar cuidadosamente o tecido conjuntivo para remover os pulmões inflados. </li><li> Em uma coifa química, colocar os pulmões para um tubo cónico de 15 mL contendo 5 mL de solução de Fekete (35 mL de 95% de EtOH, 15 ml de dH 2 O, 5 ml de formaldeído e 2,5 mL de ácido acídico glacial uma garrafa de vidro de 100 mL) 23. </li><li> Permitir que os pulmões de corrigir / destain durante 24 - 48 h à temperatura ambiente antes da contagem manualmente os nódulos tumorais descorados. </li><li> Remover os pulmões intactos após descoloração e dissecar cuidadosamente os pulmões fixados por lóbulo em um 35 x 10 mm placa de Petri. Contar o número de nódulos de tumor (nódulos branco) em cada lóbulo sob um microscópio de dissecação. </li></ol></li></ol>

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Apresenta-se um protocolo para um modelo de ratinho RCC ortotópico. O implante de células tumorais de adenocarcinoma renal de ratinho na rim de ratinho proporciona um modelo clinicamente relevante da mRCC. Este modelo resulta num tumor primário dentro do rim e metástases distantes nos pulmões, os quais são características de CCR avançado. A descrição aqui apresentada é específico para a linha de células Renca em imunocompetentes ratinhos Balb / c. Usando este modelo ortotópico, mostrámos que os tumores Renca são sensíve...

Carcinoma de células renais (RCC) é responsável pela maioria das neoplasias malignas nos rins e aproximadamente 3% de todas as malignidades adultos no mundo inteiro 1, 2. Devido à falta de sintomas, diagnóstico errado, e ferramentas de rastreio insuficientes para RCC, quase 30% dos pacientes apresentarão com RCC metastático (CCRm) no momento do diagnóstico, com um 20-30% adicional de pacientes que evoluíram para um estágio metastático 2. Estes casos resultam em ~ 13.500 mortes por ano 1, 3. Embora a detecção e tratamento de carcinoma de células renais primário anterior melhorou, a taxa de morte relacionada com o RCC continua a aumentar, o que sugere que a doença metastática é em grande parte responsáveis pela mortalidade 3. desenvolvimento terapia para RCC progrediu na última década com a descoberta e implementação de terapias direcionadas e imunoterapias. Infelizmente, surviv livre de progressãoai e sobrevivência global dos casos avançados ainda são bem menores de 2 anos para a maioria dos doentes com 4, 5, 6. Estas estatísticas justificam a necessidade de mais investigação sobre a identificação e desenvolvimento de tratamentos eficazes para RCC. Para avançar adequadamente intervenções terapêuticas para mRCC, modelos pré-clínicos traducionalmente relevantes da doença são primeiro necessário. Desenvolvimento de um modelo relevante e consistente para recapitular a condição humana de CCR avançado deve abordar várias questões-chave: 1) é o modelo anatomicamente relevante; 2) A progresso do tumor de forma semelhante à patologia humana; 3) Fazer metástases surgir a partir do tumor primário; e 4) pode progressão do tumor primário e metastático ser monitorado ao longo do tempo? Dependendo do tipo de tratamento a ser investigados, as linhas de rato tumorais RCC celulares, linhas celulares de tumores humanos, e RCC RCC xenog humana derivada de pacientejangadas pode ser usado em ratos imunocompetentes ou imunodeficientes. Um hospedeiro com um sistema imunitário intacto e funcional é necessário para aqueles estudos que avaliaram a algum aspecto da imunoterapia, que implique a utilização da linha de células Renca bem descrito derivada de um adenocarcinoma renal espontâneo de ratinhos Balb / c 7. A maioria dos estudos de injectar células Renca por via subcutânea (SC), que forma um local do tumor fácil de medida, ou por via intravenosa (iv) em ratos Balb / c para produzir experimentais pulmonares &quot;metástases&quot; 8, 9, 10, 11, 12. Uso de um tumor Renca implantou-sc para modelar RCC humana tem um número de limitações, incluindo inervação impreciso da vasculatura 13, as diferenças em microambiente 14, 15, e uma falta de órgão / tumor Communic celularção 13, 16. Além disso, muitos tumores sc (especialmente Renca) não metastizar para órgãos distantes, inibindo o estudo de um evento que é uma característica comum clínico 17. Para estudar mRCC, culas RENCA pode ser injectado iv para estabelecer a carga de tumor nos pulmões-o local principal de metástases em doentes RCC. O método de injecção iv de iniciar tumores metastáticos, no entanto, não permite a investigação de como, quando, ou porque as células migraram do órgão primário (isto é, o rim) para o local distante. Um modelo com ambas as doenças primário e metastático evidente no mesmo animal é crucial para estudar a progressão e tratamento de doença avançada, especialmente considerando que as metástases são tipicamente a causa de mortalidade nesses pacientes. Nosso laboratório desenvolveu um modelo murino de mRCC que incorpora todas as características acima descritas. Para estabelecer prtumores imary, ortotópicos, células Renca são implantadas directamente no rim do animal através do peritoneu translúcido. Uma pequena incisão no flanco esquerdo permite a visualização do baço (como uma referência) e o rim esquerdo. Utilizando uma agulha de calibre pequeno, as células de tumor Renca são injectados directamente no rim através do peritoneu para implante ortotópico. Em comparação com outros métodos de implantação de células Renca abaixo da cápsula renal 18, este método de implantação permite um caudal mais elevado, uma vez que é relativamente não invasivo, não requer sutura, é de uma classe de dor, e é eficiente tempo quando praticada. A bem caracterizados os resultados do modelo de carga primário reprodutível tumoral (~ 99% taxa de absorção) no rim injectado, bem como carga de tumor metastático nos pulmões. As vantagens significativas deste modelo incluem a sua natureza singeneicos, permitindo para as investigações de imunoterapia; as suas metástases espontâneas, para estudar umdoença dvanced; e a sua implantação ortotópica, para modelar o impacto anatómica na progressão da doença e do tratamento. Terapias destinadas a alvejando RCC beneficiariam muito a utilização deste modelo durante o desenvolvimento pré-clínico.

<table><tbody><tr><td>Pomada oftálmica de lágrimas artificiais</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo de tecido Vetbond</td><td>3M</td><td>Solução de CBGBIW011019</td><td></td></tr><tr><td>Betadine (iodopovidona, 5%)</td><td>Purdue Products, LP</td><td>NDC 67618-155-32</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Marcaine (injeção de bupivavaine HCl)</td> <td>Hospira</td><td>0409-1587-50&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>Seringas Sunbeam</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Venture</td><td>908291</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>NDC 57319-609-02</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-111</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Sais Balanceados</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>IVIS</td><td>Caliper</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferina, Sal de Potássio</td><td>GoldBio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>Tinta da Índia</td><td>Chartpak Inc</td><td>44201</td><td></td></tr> Tesoura <tr><td>Fórceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A Bela Adormecida (SB) sistema de transposon</td><td>Neurômica</td><td></td><td></td>SBT0200</tr><tr><td>Renca</td><td>ATCC</td><td>CRL-2947</td><td></td></tr></tbody></table>

um carcinoma de células singênico rato modelo de metastático renal para quantitativa e longitudinal avaliação da pré-clínicos terapias

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

carcinoma de células renais (RCC) afeta&gt; 60.000 pessoas nos Estados Unidos anualmente, e ~ 30% dos pacientes com CCR têm múltiplas metástases no momento do diagnóstico. Metastático RCC (mRCC) é incurável, com um tempo médio de sobrevivência de apenas 18 meses. Intervenções imunológicas baseadas em (por exemplo, o interferão (IFN) e interleucina (IL) -2) induzir respostas duradouras em uma fracção de pacientes mRCC, e inibidores multiquinase (por exemplo, sunitinib ou sorafenib) ou anti-receptor de VEGF anticorpos monoclonais (mAbs) são em grande medida paliativa, como remissões completas são raras. Tais deficiências em terapias actuais para doentes mRCC proporcionar a base racional para o desenvolvimento de novos protocolos de tratamento. Um componente chave na testes pré-clínicos de novas terapias para mRCC é um modelo animal adequado. características benéficas que recapitulam a condição humana incluem um tumor primário renal, metástases de tumores renais, e um sistema imune intacto para investigar qualquer effecto imune accionada-terapiarespostas r e a formação de factores imunossupressores induzida por tumor. Este relatório descreve um modelo de camundongo ortotópico mRCC que tem todos esses recursos. Descrevemos uma técnica de implante intra-renal utilizando o rato renal linha celular de adenocarcinoma Renca, seguindo-se a avaliação do crescimento tumoral no rim (sítio primário) e pulmões (local metastático).

<html> A implantação bem sucedida de células Renca irá resultar em desenvolvimento tumoral no rim e metástases para os pulmões dos ratinhos. Após a excisão do portador de tumor e os rins contralaterais, pesos de tecido húmido (g) foram medidas para demonstrar a carga de tumor com base no aumento de peso (Figura 1). Tumores RENCA podem ser identificados por imuno-histoquímica através citoqueratina 8 e 18, a coloração (Figura 2). Para os estudos longitudina...

Implementação de um modelo ortotópico de carcinoma de células renais, em ratinhos imunocompetente proporciona o investigador um sistema clinicamente relevante definida pela presença de um primárias metástases tumorais e pulmonares renais no mesmo animal. Este sistema pode ser usado para testar pré-clinicamente uma variedade de tratamentos in vivo.

Um carcinoma de células Singênico Rato Modelo de metastático renal para Quantitativa e Longitudinal Avaliação da pré-clínicos Terapias

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer tumores renais ortotópicos em camundongos por meio da implantação intrarrenal de células tumorais, para o estudo do crescimento tumoral e da metástase, bem como da eficácia de terapias antitumorais. Este método pode ser utilizado para responder perguntas fundamentais na área de oncologia urológica, como, por exemplo, qual é a eficácia de uma nova terapia em um modelo pré-clínico de câncer de rim. A principal vantagem desta técnica é que a implantação tumoral intrarrenal estabelece um tumor renal primário com metástase pulmonar, imitando a patogênese clínica do carcinoma de células renais.Para preparar as células tumorais Renca, primeiro desprenda o cultivo celular com tripsina a 0,25% e HBSS após lavagem com PBS. Neutralize a reação após cinco minutos com meio RPMI completo. Transfira as células para um tubo cônico para centrifugação e re-suspenda o pellet em HBSS fresco.Após a contagem, ajuste o volume para uma concentração de dois vezes dez elevado à sexta células por mililitro em HBSS e aspire as células para uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 18. Em seguida, coloque um campo cirúrgico estéril sobre uma manta térmica e confirme o nível adequado de sedação por meio do aperto do dedo do pé. Remova os pelos do flanco esquerdo do camundongo e aplique pomada oftálmica veterinária nos olhos.Em seguida, limpe o local de implante com anti-séptico de iodo-povidona a 5% e use um bisturi estéril para fazer uma única incisão de um a um centímetro e meio na região do flanco esquerdo, tomando cuidado para não penetrar o peritônio. Com o auxílio de uma tesoura, separe a derme do peritônio, tamponando o local da incisão com gaze estéril para remover qualquer sangue. Em seguida, segure a cabeça com a mão esquerda e apoie o flanco com a mão direita para localizar o baço através do peritônio.Usando um dedo da mão direita, palpe o camundongo por baixo. O rim deve ficar visível. Mantendo uma firme segura no animal para proporcionar tensão sobre o peritônio e o rim, peça a um assistente que lentamente administre 0,1 mililitros das células Renca através do peritônio intacto até o centro do rim.Mantenha a agulha no lugar por cinco a 10 segundos para reduzir o refluxo das células. Em seguida, feche a incisão com uma camada fina de adesivo tecidual de cianoacrilato. No ponto final do experimento, use uma tesoura para fazer uma incisão mediana, começando na região abdominopelvina média, passando pelo tórax, pescoço e glândulas salivares.Usando tesoura e pin&ccedil;as, remova cuidadosamente as costelas sem comprometer o tecido pulmonar e remova o tecido conjuntivo para expor a traqueia. Encha uma seringa de tr&ecirc;s mililitros equipada com uma agulha de calibre 18 com Tinta da &Iacute;ndia a 10% e PBS. Em seguida, use pin&ccedil;as para passar cuidadosamente um fio de seda sob a traqueia e, depois, d&ecirc; um n&oacute; solto.Em seguida, insira cuidadosamente a agulha na traqueia e infle lentamente os pulmões com um a um e meio mililitro da solução de tinta nanquim. Aperte o nó ao redor da traqueia para impedir o refluxo da tinta, depois remova a agulha e corte cuidadosamente o tecido conjuntivo para retirar os pulmões inflados. Fixe os pulmões em um tubo cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros da solução de Fekete, em capela de exaustão química à temperatura ambiente.Após 24 a 48 horas, remova os pulmões intactos e descoloridos e separe cuidadosamente os lobos em uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros. Em seguida, conte o número de nódulos tumorais brancos sob um microscópio estereoscópico. Um implante bem-sucedido de células Renca em rim de camundongo resulta no desenvolvimento de tumor no rim e metástase para os pulmões, com os animais portadores de tumor apresentando uma carga tumoral acentuada, medida pelo aumento do peso dos rins com tumor implantado.Como observado, os tumores Renca podem ser identificados por coloração imuno-histoquímica para Citoqueratina oito e 18. O implante de uma linhagem celular Renca que expressa luciferase permite o rastreamento da carga tumoral no rim e da metástase para o pulmão por meio de imagem bioluminescente, conforme confirmado adicionalmente pela insuflação pulmonar com tinta da Índia. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em menos de cinco minutos por camundongo, se realizada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de identificar claramente o rim através do peritônio para garantir uma implantação tumoral intrarrenal precisa. Após este procedimento, outros métodos, como testes pré-clínicos de fármacos, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, tais como até que ponto um fármaco novo afeta o crescimento ou a metástase de tumores intrarrenais? Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a implantação de células tumorais intrarrenais para estabelecer tumores renais ortotópicos no camundongo.Não se esqueça de que trabalhar com animais vivos e instrumentos cirúrgicos pode ser perigoso e que precauções, como seguir as diretrizes institucionais de manejo de animais e manter uma área cirúrgica estéril e instrumentos esterilizados, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Neste vídeo, desenvolvemos um modelo ortotópico de carcinoma de células renais em camundongos. Esse modelo resulta em tumores primários reprodutíveis no rim injetado e tumores metastáticos no pulmão, permitindo a avaliação da progressão da doença e do tratamento.

Gerando Modelo de Carcinoma de Células Renais: Um Protocolo para Desenvolver Modelo Murino de CCR Ortotópico por Implantação Intrarrenal de Células Cancerígenas

Este modelo ortotópico de cancro de próstata humana permite a quantificação do tamanho do tumor, as células tumorais, e a formação de metástases distinta circulante para o pulmão. Como as células deve escapar o principal órgão, entrar na corrente sanguínea, e implantar em um site secundário, este modelo recapitula efetivamente o cenário em seres humanos.

Um Modelo murino de próstata humana Metástase Ortotópico

Todos os modelos de metástase espontânea do carcinoma de células renais (RCC), a progressão da doença podem ser utilizados para avaliar os tratamentos em um ambiente clinicamente relevante. Este protocolo demonstra procedimentos diferentes para a implantação de células tumorais renal ortotópico, nefrectomia adequada, e, finalmente, apresenta um guia de necropsia para avaliação visual e bioluminescente de carga metastático e localização.

Modelagem espontânea metastático carcinoma de células renais (mRCC) em ratos após nefrectomia

A modelo pré-clínico, murino de metástases hepáticas realizado através de uma técnica de injeção hemispleen.

Um Modelo murino de metástases hepáticas pré-clínica

A propagação metastática do câncer é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer. Nós fornecemos uma descrição detalhada da nossa metodologia cirurgia sobrevivência para o estabelecimento de um sistema modelo singï¿½ico rato "paciente-like" orthotopic para o estudo dos mecanismos de metástases em tumores de órgãos sólidos.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Singênico Rato Modelo de carcinoma hepatocelular Metástase

Este protocolo descreve a geração de tumores da bexiga ortotópico de murídeo em Ratinhos C57BL / 6J e a monitorização do crescimento do tumor.

Um modelo de tumor de murino de bexiga ortotópico e Tumor Detection System

Carcinoma de células renais metastáticas claras é uma doença sem um modelo animal abrangente para investigação pré-clínica completa. Este protocolo ilustra dois novos modelos animais para a doença: o modelo de camundongo sutópicamente implantado e o modelo de membrana chorioallantoico de frango, ambos demonstram metástase pulmonar semelhante a casos clínicos.

Comparando modelo de carcinoma de célula séuológica metastática clara estabelecida no rim do rato e na membrana chorioallantoico de frango

A abordagem descrita combina ensaios experimentais de metástase da veia da cauda com imagens de animais vivos in vivo in vivo para permitir o monitoramento em tempo real da formação e crescimento da metástase do câncer de mama, além da quantificação do número e tamanho da metástase nos pulmões.

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

Este é um método eficaz para testar supressores ou condutores de metástase de câncer. As células, transduzidas com uma biblioteca de expressão, são injetadas na vasculatura da membrana corioallantóica do frango para formar colônias metastáticas. Colônias que têm diminuído ou aumentado a invasividade são extirpadas, expandidas, reinjetadas para confirmar seu fenótipo e, finalmente, analisadas usando alto sequenciamento de rendimento.

Descoberta de reguladores metastáticos usando um modelo de membrana corioallantóica intravital rápida e quantitativa

Este artigo descreve um fluxo de trabalho de técnicas empregadas para testar novos mediadores candidatos de metástase de melanoma e seus mecanismos de ação.

Uma plataforma robusta de descoberta para a identificação de novos mediadores de metástase de melanoma

Um grande desafio do desenvolvimento de novas terapias para o câncer de pulmão inclui a modelagem do microambiente tumoral à medida que a doença regional progride para a doença metastática. Aqui, descrevemos um método simples de estabelecer um modelo singênico ortotópico de câncer de pulmão que permite o rastreamento in vivo da doença ao longo do tempo.

Um método minimamente invasivo para gerar um modelo ortotópico singênico de câncer de pulmão em camundongos

Aprenda a estabelecer tumores renais ortotópicos em camundongos imunocompetentes através da implantação intrarrenal de células Renca. Este modelo permite estudar crescimento tumoral, metástase pulmonar e avaliar terapias anticâncer em oncologia urológica.

Um carcinoma de células Singênico Rato Modelo de metastático renal para Quantitativa e Longitudinal Avaliação da pré-clínicos Terapias (Vídeo) | JoVE Journal

Um carcinoma de células Singênico Rato Modelo de metastático renal para Quantitativa e Longitudinal Avaliação da pré-clínicos Terapias

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