Um carcinoma de células Singênico Rato Modelo de metastático renal para Quantitativa e Longitudinal Avaliação da pré-clínicos Terapias

Implementação de um modelo ortotópico de carcinoma de células renais, em ratinhos imunocompetente proporciona o investigador um sistema clinicamente relevante definida pela presença de um primárias metástases tumorais e pulmonares renais no mesmo animal. Este sistema pode ser usado para testar pré-clinicamente uma variedade de tratamentos in vivo.

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer tumores renais ortotópicos de camundongos por meio do implante intrarrenal de células tumorais para o estudo do crescimento e metástase tumoral e a eficácia de terapias antitumorais. Este método pode ser usado para responder a perguntas-chave no campo da oncologia urológica, como a eficácia de uma nova terapia em um modelo pré-clínico de câncer renal. A principal vantagem dessa técnica é que o implante de tumor intrarrenal estabelece um tumor renal primário metastático pulmonar mimetizando a patogênese clínica do carcinoma de células renais.

Para preparar as células tumorais Renca, primeiro separe a cultura de células com 0,25% de tripsina e HBSS após enxaguar com PBS. Neutralize a reação após cinco minutos com o Complete RPMI Medium. Transfira as células para um tubo cônico para centrifugação e ressuspenda o pellet em HBSS fresco.

Após a contagem, ajuste o volume para uma concentração de duas vezes dez elevado a seis células por mililitro no HBSS e coloque as células em uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 18. Em seguida, coloque uma cortina cirúrgica estéril sobre uma almofada de aquecimento e confirme o nível apropriado de sedação com a pinça do dedo do pé. Remova o cabelo do flanco esquerdo do mouse e aplique pomada veterinária nos olhos.

Em seguida, esfregue o local de implantação com anti-séptico de iodopovidona a 5% e use um bisturi estéril para fazer uma única incisão de um a um centímetro e meio no flanco esquerdo, tomando cuidado para não penetrar no peritônio. Usando uma tesoura, separe a derme do peritônio, enxugando o local da incisão com gaze de algodão estéril para remover o sangue. Em seguida, segure a cabeça com a mão esquerda e apoie o flanco com a mão direita para localizar o baço através do peritônio.

Usando um dedo da mão direita, palpe o mouse por baixo. O rim deve se tornar visível. Mantendo um aperto firme no animal para fornecer tensão através do peritônio e do rim, peça a um assistente que forneça lentamente 0,1 mililitros das células Renca através do peritônio intacto até o centro do rim.

Segure a agulha no lugar por cinco a 10 segundos para reduzir o refluxo das células. Em seguida, feche a incisão com uma fina camada de adesivo tecidual de cianoacrilato. No ponto final experimental, use uma tesoura para fazer uma incisão na linha média, começando no meio do abdômen através da caixa torácica, pescoço e glândulas salivares.

Usando tesouras e pinças, remova cuidadosamente as costelas sem comprometer o tecido pulmonar e remova o tecido conjuntivo para expor a traqueia. Encha uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de calibre 18 com tinta nanquim 10% e PBS. Em seguida, use uma pinça para enfiar cuidadosamente uma sutura de seda sob a traqueia e, em seguida, dê um nó solto.

Em seguida, insira cuidadosamente a agulha na traqueia e infle lentamente os pulmões com um a um mililitro e meio da solução de tinta nanquim. Puxe o nó firmemente ao redor da traqueia para inibir o refluxo da tinta, remova a agulha e corte cuidadosamente o tecido conjuntivo para remover os pulmões inflados. Fixe os pulmões em um tubo cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros da solução de Fekete em uma capela de exaustão química à temperatura ambiente.

Após 24 a 48 horas, remova os pulmões intactos e separados cuidadosamente os lóbulos em uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros. Em seguida, conte o número de nódulos tumorais brancos sob um microscópio de dissecação. Um implante bem-sucedido de células Renca intrarrenais em camundongos resulta no desenvolvimento de tumores nos rins e metástases para os pulmões com animais portadores de tumores, demonstrando uma carga tumoral robusta, medida pelo aumento do peso dos rins implantados no tumor.

Como observado, os tumores Renca podem ser identificados por coloração imuno-histoquímica para citoqueratina oito e 18. A implantação de uma linhagem celular Renca que expressa luciferase permite o rastreamento da carga tumoral no rim e metástase para o pulmão por imagem bioluminescente, conforme confirmado pela inflação pulmonar da liga da Índia. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em menos de cinco minutos por mouse, se executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de identificar claramente o rim através do peritônio para garantir uma implantação precisa do tumor intrarrenal. Após esse procedimento, outros métodos, como testes pré-clínicos de drogas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como até que ponto a nova droga afeta o crescimento ou a metástase de tumores intrarrenais? Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar o implante de células tumorais intrarrenais para estabelecer tumores renais ortotópicos no camundongo.

Não se esqueça de que trabalhar com animais vivos e instrumentos cirúrgicos pode ser perigoso e que precauções, como seguir as diretrizes institucionais de manuseio de animais e manter uma área cirúrgica e instrumentos estéreis, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.