Electroforese Capilar Separação de Anticorpo Monoclonal isoformas utilizando um capilar de ponto morto

Atualmente, a técnica de eletroforese capilar de células constitui um dos estados mais resolutivos e sensíveis para a análise de biomoléculas, como anticorpos monoclonais. No entanto, a implementação bem-sucedida dessa técnica depende do conhecimento e das habilidades do analista nas etapas críticas durante os preparos da amostra e do sistema. Este tutorial tem como objetivo orientar sobre como realizar uma análise bem-sucedida, com explicações verdadeiramente detalhadas sobre o preparo de soluções e amostras, a preparação do sistema de eletroforese capilar, a configuração do método no instrumento e a interpretação e processamento dos dados.

No geral, este protocolo pode ser utilizado para o desenvolvimento e aprimoramento das habilidades do pessoal envolvido na preparação de laboratórios de química analítica. Pese a quantidade de HPMC para obter uma concentração final de 0,05 por cento em 100 mililitros. Como o HPMC é um polímero elástico básico, como primeiro passo, despeje o pó em um béquer de vidro e adicione lentamente 80 mililitros de água para desagregar o pó.

Em seguida, enxágue a bandeja umedecida com água para remover vestígios de pó. Adicione os reagentes restantes conforme o normal e agite a solução. Ajuste o valor de pH para 4,8 com ácido acético a 50 por cento.

E deixe a solução estabilizar por cinco minutos. Após isso, ajuste o pH conforme necessário. Adicione água para completar o volume final de 100 mililitros.

Filtre a solução de BG preparada através de uma membrana neutrofílica e despeje em um frasco de vidro. Por fim, rotule adequadamente o frasco de vidro e armazene sob refrigeração. Para preparar a amostra, como primeiro passo, adicione 162 microlitros de solução tampão traço em um tubo de 1,5 mililitro.

Em seguida, adicione 18 microlitros de uma amostra de map previamente preparada na concentração de 10 miligramas por mililitro. Como terceira etapa, adicione 20 microlitros de uma solução de histamina a um por cento previamente preparada para obter um volume final da amostra de 200 microlitros. Próxima etapa, prepare uma amostra durante cinco segundos.

Centrifugue por cinco segundos. Aspire todo o volume da amostra. Em seguida, transfira para cima em um microtubo para evitar a introdução de bolhas.

Por fim, tampe o tubo e mantenha sob refrigeração. Desligue o instrumento de eletroforese capilar pressionando o interruptor de energia. E abra a porta frontal.

Coloque uma nova toalha descartável sob o bloco de interface. Enxágue os eletrodos através do bloco de interface com água utilizando um frasco de lavagem. Deixe a água escorrer pelos orifícios e seque bem o bloco de interface.

Remova cuidadosamente o excesso de água dos eletrodos utilizando o lenço. Tenha cuidado para não tocar nos eletrodos durante este procedimento. Remova o lenço do sistema de fixação da amostra.

Limpe a superfície das bandejas de amostra com uma nova toalha umedecida com água, sem movimento. E a superfície das bandejas de tampão. Deslize as bandejas de tampão para cima, levante o sistema de fixação de amostras e limpe sua superfície utilizando a toalha.

Volte as bandejas de tampão para a posição original. Depois disso, limpe completamente o bloco de interface. Limpe a barra de fixação e o alojamento da lâmpada UV.

No final, certifique-se de testar o sistema antes do uso. Enxágue as alavancas de abertura com água utilizando um frasco de lavagem. Limpe sua superfície cuidadosamente com uma toalha nova e sem partículas para remover poeira e sais acumulados.

Por fim, certifique-se de testá-los antes da instalação. Limpe as duas extremidades do cabo de fibra óptica com um pano de microfibra umedecido com água e confirme a passagem da luz entre as extremidades. Remova uma nova capilar neutra de sua embalagem.

Leve agora uma extremidade do tubo protetor do capilar até a bancada de trabalho. Desenrole e alinhe o tubo plástico, e retire cuidadosamente o capilar do tubo. Fixe um pedaço de papel na bancada de trabalho com as seguintes marcas de medição.

Alinhe a janela do capilar com o ponto zero das marcas de medição em centímetros da seguinte forma: Em seguida, fixe as extremidades do capilar na bancada com fita adesiva. Marque as extremidades do capilar a dois milímetros fora das marcas de medição. Corte a tampa protetora na extremidade do capilar mais distante da janela.

E mergulhe a extremidade do capilar em um frasco de CE preenchido com água para evitar danos permanentes ao revestimento interno do capilar. Remova o capilar do frasco e insira esta extremidade cuidadosamente no lado de saída da cartucho. Uma vez que o capilar apareça no outro lado, puxe o necessário até que a janela do capilar esteja centralizada com a janela do cartucho conforme a seguir.

Após isso, vire o cartucho e insira o tampão de abertura na janela do cartucho, pressionando até encaixar. Tenha cuidado para não quebrar a janela capilar durante este procedimento. Confirme que a luz passa através da janela quando exposta a uma fonte ampla de luz.

Introduza a capilaridade na tubulação pré-formada de refrigerante com a tubulação pré-instalada não feral e anel de vedação. Empurre a capilaridade através da tubulação até que ela apareça no outro lado. Em seguida, insira a extremidade da tubulação no lado de saída do cartucho e aperte as porcas da tubulação.

Insira a extremidade de entrada da capilar no lado da entrada do cartucho. Uma vez que a capilar tenha aparecido no outro lado, puxe conforme necessário. Em seguida, insira a extremidade da tubulação no lado da entrada do cartucho e aperte as porcas da tubulação.

Corte a tampa protetora na extremidade do capilar mais próxima da janela. E instale os grampos fixadores da célula sobre as extremidades do capilar, pressionando para encaixar na posição conforme a seguir. Corte as extremidades do capilar abaixo das linhas de referência nas placas alongadas do capilar.

Certifique-se de inspecionar as extremidades dos capilares com uma lupa. Se as extremidades dos capilares não estiverem lisas, alise-as utilizando a pedra cleven. Coloque a junta de vedação no orifício azul da abertura.

E insira-o cuidadosamente utilizando a ferramenta de inserção de o-ring. Por fim, instale os frascos CE preenchidos com água na cartela, e coloque o cartucho na cartela imediatamente, com as extremidades capilares inseridas nos frascos, armazenando sob refrigeração. Ajuste o volume da pipeta.

Adicione o volume correto de água ao orifício do tampão nas coordenadas da bandeja A1, B1 e F6. E à bandeja de saída do tampão nas coordenadas A1, B1, C1, E6 e F6. Adicione HCl 0,1 normal à bandeja de entrada do tampão nas coordenadas C1 e E6. E adicione BGE à bandeja de entrada do tampão nas coordenadas D1 e E6. E à coordenada da bandeja de saída do tampão D1. Por fim, tampe todos os frascos de CE nas bandejas de entrada e saída do tampão. Durante o procedimento, evite molhar as tampas dos frascos para prevenir vazamento de carbono. Abra a porta frontal do instrumento de CE.

Primeiro, instale o detector de UV e fixe-o girando o parafuso no sentido horário. Levante a porta interna e instale as alavancas de abertura pressionando-as para cima, encaixando-as no bloco de interface. Insira o cabo de fibra óptica no prendedor e gire no sentido horário.

E conecte a outra extremidade ao detector. Manipule o cabo de fibra óptica com cuidado, pois dobrá-lo pode causar sua fratura. Coloque a bandeja da amostra no sistema de suporte de amostras e encaixe-a na posição.

Seguindo o mesmo procedimento, coloque as bandejas de tampão no sistema de suporte de amostras. Levante a barra de fixação e coloque o cartucho de capilar no bloco de interface. Pressione a barra de fixação em ambas as extremidades e aperte os botões girando no sentido horário.

Feche a porta interna e feche a porta frontal. Por fim, ligue o instrumento CE pressionando o interruptor de energia. Crie o método de condicionamento do instrumento.

Configure os parâmetros no painel de condição inicial, incluindo tensão, cartucho, temperatura de armazenamento da amostra e configurações de gatilho. Selecione dois mil e catorze como o comprimento de onda de aquisição. Declare as ações a serem realizadas pelo instrumento configurando os parâmetros nas células programadas por tempo.

Incluindo as configurações específicas para cada etapa de lavagem, injeção e separação. Realize este procedimento para criar os métodos de condicionamento, operação e desligamento do instrumento. O próximo passo é criar uma nova sequência.

Configure a cápsula para condicionamento utilizando o método de condicionamento. Se a cápsula for usada pela primeira vez, configure quatro repetições. Caso contrário, configure duas repetições.

Em seguida, programe as amostras para serem analisadas utilizando o método de operação. Por fim, programe o capilar para armazenamento utilizando o método de desligamento. A análise por eletroforese capilar é concluída em até 30 minutos.

O primeiro resultado corresponde ao padrão interno de histamina como uma medida do desempenho do sistema adeque. Em seguida, observam-se as formas básicas, principais e ácidas distintivas do anticorpo monoclonal ebaluadith. A separação completa é realizada sob uma corrente constante de aproximadamente 30 microampères.

Após realizar o experimento, exporte os dados brutos do software grab e importe-os pelo software empower para processamento. O teor percentual de cada forma de gelo é obtido após a integração vertical por linha de queda do perfil eletroforético. Aqui apresentamos um guia detalhado, passo a passo, para conduzir a análise das atividades monoclonais geradas por eletroforese capilar de células.

Juntamente com várias recomendações para mitigar possíveis problemas, o protocolo adicionalmente apresentado oferece a vantagem de ser facilmente personalizável para a análise de outras proteínas mediante breves modificações nos parâmetros de condutividade e pH.