Name: Sintonizável hidrogéis a partir de Pulmonar Matriz Extracelular para Cultura Celular 3D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Aprenda a criar hidrogéis ajustáveis a partir de matriz extracelular pulmonar para cultura celular 3D. Este método permite estudar interações celulares em condições que replicam a complexidade do pulmão.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nós gostaríamos de agradecer fazendas Smithfield pela doação do tecido pulmonar porcina intacta. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Hu Yang, Dr. Christina Tang e do Departamento de Cirurgia Plástica VCU por nos permitir usar o seu equipamento. amostras de hidrogel e de tecido foram preparados para MEV no Departamento de Anatomia e Neurobiologia Microscopia Facility VCU apoiado, em parte, pelo financiamento do NIH-NINDS Centro Núcleo Grant 5 P30 NS047463 e, em parte, pela forma de financiamento NIH-NCI Cancer Center Support Grant CA016059 P30. SEM imagem de amostras no VCU Nanotechnology Núcleo Caracterização Facility (NCC). Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation, CMMI 1.351.162.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Solução </td><td> filtro esterilizado </td><td> Instruções </td></tr><tr><td> 2 O DIH </td><td> sim </td><td> DIH 2 O; esterilizada por filtração </td></tr><tr><td> 0,1% de solução de Triton X-100 </td><td> sim </td><td> Sob hotte adicionar 100 uL de Triton X-100 a 100 ml solução DIH 2 O e agitar até à dissolução; filtro esterilizado. </td></tr><tr><td> 2% de desoxicolato Solução </td><td> sim </td><td> Sob exaustor adicionar 2 g solução de desoxicolato de sódio por 100 ml DIH 2 O e agitar até à dissolução; Filtrar em condições estéreis </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> sim </td><td> Adicionar 58,44 g de NaCl para 1 L de DIH 2 O; agitar até se dissolver; filtro esterilizado </td></tr><tr><td> solução de DNase </td><td> sim </td><td> Adicione 12.000unidades de ADNase a 1 L DIH 2 O; Adicionar 0,156 g MgSO4 (Anidro), e 0,222 g de CaCl 2; agitar até se dissolver; filtro esterilizado </td></tr><tr><td> PBS </td><td> sim </td><td> Combine 27,2 g de Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (dibico hepta-hidratado), 80 g de NaCl e 2 g de KCl com 10 L DIH 2 O; agitar até se dissolver; ajustar o pH para 7,4; filtro esterilizado </td></tr></tbody></table> Tabela 1: soluções necessárias para Decelularização Tissue. Faça as soluções acima para o processo de descelularização. Armazenar a 4 ° C. Cerca de 2,5 L será necessário para um pulmão de porco. 1. Formação Hidrogel <ol><li> Porcina Lung Decelularização (adaptado a partir de referências 9,10) <ol><li> Obter, um en bloc pulmão de porco normal, de um matadouro, com coração e vasculature intacta. </li><li> Use tesouras de tecidos ou um bisturi para dissecar afastado do coração, vasculatura tão próximo quanto possível do coração de corte, mantendo-se a vasculatura irá ser usado em passos posteriores para perfusão. </li><li> Dissecar cuidadosamente afastado o tecido conjuntivo em torno da traqueia, brônquios e vasculatura utilizando um bisturi ou tesoura. NOTA: Determinar o melhor pulmão para usar para o resto do procedimento, escolhendo um pulmão sem grandes cortes ou perfurações através da pleura e grandes quantidades de atelectasia ou oclusão vascular que podem impedir a eficácia do processo de descelularização. </li><li> Cortar o pulmão subóptima deixando tanto brônquio ligados à traqueia quanto possível (coração, o tecido conjuntivo e os lóbulos dos pulmões removidos podem ser eliminados). Deve haver um pulmão que continuem ligadas ao traqueia e vasculatura. NOTA: Manter seções para histologia, se desejar. 9 </li><li> Feche brônquios desconectados com grampos ou suturas para prevent excesso de refluxo. </li></ol><ol start="6"><li> Preparar as soluções de decelularização e refrigerar a 4 ° C até serem necessárias (Tabela 1). </li><li> Usando uma bomba manual canulada para se ajustar a artéria pulmonar, a perfusão do tecido pulmonar 3 vezes com água desionizada, tanto através da artéria pulmonar e traqueia. Perfundir vasculatura primeiro de cada vez. Comece com cerca de 1 L para a vasculatura e 1,5 L em cada traqueia para perfusão, mas como os detritos celulares são removidos mais líquido pode ser perfundido através do sistema. </li><li> Perfundir tanto vasculatura e traquéia com Triton solução X-100. </li><li> Submerge tecido pulmonar em solução de Triton X-100 durante 24 h a 4 ° C. </li><li> Perfundir vasculatura e traquéia 3 vezes com água DI para enxaguar. </li><li> Perfundir tanto vasculatura e traquéia, com solução de desoxicolato. </li><li> Submergir as secções de tecido em desoxicolato durante 24 h a 4 ° C. </li><li> Perfundir vasculatura e traquéia 3 vezes com água DI para enxaguar. </li><li>Perfundir tanto vasculatura e traquéia, com solução de NaCl. </li><li> Submergir o tecido em solução de NaCl filtrada durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Perfundir vasculatura e traquéia 3 vezes com água DI para enxaguar. </li><li> Perfundir tanto vasculatura e traquéia, com solução de DNase. </li><li> Submergir o tecido em solução de ADNase filtrada durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Perfundir tanto vasculatura e traqueia 5 vezes com PBS. </li><li> Dissecar o tecido cartilaginoso perceptível, traqueia e todos os túbulos de 2 mm ou maior em diâmetro (encontrado principalmente em torno do hilo e porções mediais dos pulmões) de condução das vias aéreas, deixando apenas a zona respiratória (principalmente nas áreas periféricas). </li><li> Dissecar tecido em 1 seções polegadas ou menores. Orientação do tecido não interessa para este passo. </li><li> Deitar fora o excesso de tecido líquido e coloque em tubos de 50 ml cônico. Congelar o tecido a -80 ° C. NOTA: Manter seções para histologia para assegurar a remoção de células e debri celulars, se desejado. Usamos H &amp; E, α-galactosidase, PicoGreen, hidroxiprolina, ninidrina, azul de alcian, SDS-PAGE e espectrometria de massa para caracterizar. 9 </li></ol></li><li> Lung Processing <ol><li> Retirar as tampas de tubos congelados contendo tecido pulmonar decelularizado. </li><li> Coloque papel de filtro sobre a abertura do tubo e prenda com elástico. NOTA: Tubo e conteúdo ainda deve ser congelado qualquer outro modo, em -80 ° C até congelados. </li><li> Liofilizar o tecido até que todo o excesso de líquido está desaparecido, usando um secador de gelo de acordo com as instruções do fabricante. Armazenar a -80 ° C até estar pronto para moinho. </li><li> Antes de iniciar adicionar nitrogênio líquido para fábrica de freezer para esfriar isolamento e componentes internos às condições de trabalho. </li><li> Retirar bar mill magnético do tubo moinho e adicionar o tecido para cobrir parte inferior. </li><li> Substitua bar moinho e adicionar o tecido ligeiramente comprimido. O bar moinho ainda deve mover-se livremente. </li><li> Fechar o tubo moinho e place no moinho congelador. </li><li> Preencha nitrogênio líquido para linha de preenchimento máximo. </li><li> Moinho congelador todo o tecido em pó fino (aproximadamente 5 min, taxa de compactação de ~ 600 min-1), em um cilindro de policarbonato com um pêndulo de aço inoxidável, bem como tampões de extremidade de aço inoxidável usando o moinho de congelador de acordo com as instruções do fabricante. Armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para uso. </li></ol></li><li> A formação do gel micro-porosa (8 mg / ml) (adaptado a partir de referências 9,11) <ol><li> Adicionar 1% (w / v) do pó descelularizado e 0,1% (w / v) de pepsina a HCl 0,01 M, sob agitação constante (deve ser capaz de ver o fluxo no nível superior do líquido), à temperatura ambiente, durante 48 hr. NOTA: O pó é estaticamente carregada, então a adição do HCl, depois do pó proporciona a oportunidade para lavar o excesso de fora das paredes do tubo. </li><li> Após a digestão durante 48 h, e colocar a solução de reagentes em gelo durante 5 min. </li><li> Usando refrigerado 10% (v / v) de NaOH 0,1 M, umad 11,11% (v / v) de PBS 10X (para trazer toda a solução de concentração 1x), levar a solução de proteína digerida a pH fisiológico de 7,4. NOTA: A solução pode agora ser armazenada a 4 ° C durante até uma semana. Execute cinética de gelificação utilizando reometria 9 se desejar. </li></ol></li></ol> 2. Cross-ligando hidrogéis para melhorar a força mecânica <ol><li> Soluções de 1%, 0,1%, e 0,01% w / v solução de genipina de reticulação foram preparadas por dissolução da quantidade necessária de pó de genipina em 10% de DMSO. </li><li> Vortex a solução cada 15 minutos durante 1 hr. </li><li> Adicionar solução genipina para cobrir hidrogéis ECM (100 uL para cada poço de uma placa de 96 poços) que foram previamente montados na parte 1.3.4. </li><li> Deixar cada hidrogel ECM para reticular durante 24 h a 37 ° C. </li><li> Lavar o hidrogel ECM 3 vezes com PBS até a solução de lavagem não é mais azul. Os hidrogéis reticulados então estará pronta para posterior caracterização e ceEstudos de cultura II. </li></ol> 3. Cultura de Células com microporosa Gel <ol><li> Revestimento Bidimensional <ol><li> Usando a solução de 1.3.3, adicionar 20 ul de solução Pregel a cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços não tratados. </li><li> refrigere durante a noite a 4 ° C para permitir a adsorção de proteína à placa. </li><li> solução Aspirar Pregel e enxaguar com PBS. </li><li> Células de passagem 9. </li><li> Adicionar células 10.000 / cm 2 a poços. </li><li> Aumentar a mídia para 100 jil por poço e incubar a 37 ° C. </li></ol></li><li> Três de cultura de células tridimensional 9 <ol><li> Utilizando uma solução a partir de 1.3.3, ressuspender as células peletizadas a uma concentração de 1.000.000 células / ml de solução Pregel. </li><li> dispensar rapidamente 16 ul de suspensão de células Pregel em cada poço de uma placa de 96 poços, de modo a formar um hidrogel de espessura ~ 500 um para a cultura de células em 3D. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 30min para o gel para formar. </li><li> Adicionar 100 ul de meios de comunicação para o topo de hidrogeles formados e incubar a 37 ° C. </li></ol></li><li> Três de cultura de células tridimensional em geles de rigidez variável <ol><li> Utilizando uma solução a partir de 1.3.3, pipeta 100 uL de solução Pregel em cada poço de uma placa de 96 poços. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 30 minutos para formar gel. Nota: Cross-ligando passos da parte 2 podem ser usados ​​aqui. </li><li> Células de passagem 9. </li><li> Adicionar células 10.000 / cm 2 a poços. </li><li> Aumentar a mídia para 100 jil por poço e incubar a 37 ° C. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+J+%22Three-Dimensional+Cell+Culture+Matrices%3A+State+of+the+Art%22">Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art</a>. 14, (2008).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaycock%2C+JW+%223D+Cell+Culture%22">3D Cell Culture</a>. , Humana Press. (2011).</li>
<li>Walker, J. M., Ed, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22Epithelial+cell+culture+protocols%22">Epithelial cell culture protocols</a>. , Humana Press: Springer. New York: New York. (2012).</li>
<li>Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+as+a+biological+scaffold+material%3A+Structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function.</a> Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Koo, H. -J., Lim, K. -H., Jung, H. -J., Park, E. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+evaluation+of+gardenia+extract%2C+geniposide+and+genipin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin.</a> J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).</li>
<li>Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+Material+Properties+of+Cardiac+Matrix+Hydrogels+to+Induce+Endothelial+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).</li>
<li>Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+bone+regeneration+using+porcine+small+intestinal+submucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Surg%22%5BJournal%5D)">Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa.</a> J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).</li>
<li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Res.+J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).</li>
<li>Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPouliot%2C+RA+%22J.Biomed.Mater.Res.A%22">J.Biomed.Mater.Res.A</a>. , (2016).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).</li>
<li>Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+rheological+characterization+of+a+gel+form+of+the+porcine+urinary+bladder+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix.</a> Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).</li>
<li>Tilghman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+rigidity+regulates+cancer+cell+growth+and+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype.</a> PloS One. 5 (9), e12905(2010).</li>
<li>Ratner, B. D., Bryant, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials%3A+where+we+have+been+and+where+we+are+going%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomaterials: where we have been and where we are going.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).</li>
<li>Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+initiation+and+growth+of+tumor+cell+lines%2C+cancer+stem+cells+and+biopsy+material+in+mice+using+basement+membrane+matrix+protein+%28Cultrex+or+Matrigel%29+co-injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).</li>
<li>Zhang, W. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstruction+of+lung+alveolus-like+structure+in+collagen-matrigel%2Fmicrocapsules+scaffolds+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro.</a> J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).</li>
<li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+Normal+and+Fibrotic+Human+Lung+Matrices+as+a+Culture+System+for+In+Vitro+Investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).</li>
<li>Matsuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+human+lung+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Evidence for human lung stem cells.</a> N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).</li>
<li>Zuo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63%2BKrt5%2B+distal+airway+stem+cells+are+essential+for+lung+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration.</a> Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).</li>
<li>Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+ineffective+decellularization+of+biologic+scaffolds+on+the+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response.</a> Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).</li>
<li>Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Um dos aspectos integrais da biologia é a auto-organização das moléculas em estruturas hierárquicas que executam uma tarefa específica. 13 No laboratório, a auto-montagem depende de numerosos factores tais como a concentração de sal, pH, e a duração de digestão. Como mostrado, uma auto-organização de formas de hidrogel quando as proteínas solubilizadas retornar a uma temperatura fisiológica. O hidrogel formado é capaz de promover a adesão celular e a proliferação in vitro. <p class="jove_content"...

Traduzir resultados in vitro para a clínica é uma das questões mais desafiadoras enfrentadas pelos pesquisadores biomédicos. A pesquisa in vitro em plástico de cultura de tecidos é mais fácil, mais conveniente e mantém alta viabilidade celular. 1 Essa abordagem é um ponto de partida razoável, mas os resultados têm tradução clínica limitada. Cada vez mais, os laboratórios estão incorporando construções tridimensionais para substituir os métodos bidimensionais tradicionais. As revisões estão disponíveis para muitos ambientes tridimensionais, desde andaimes biológicos até andaimes poliméricos. 2,3
As estruturas biológicas podem imitar as características de ambientes in vivo, pois contêm muitos dos componentes proteicos e glicosaminoglicanos da matriz nativa e fornecem locais de ligação familiares para as células se ligarem e reconhecerem. Os materiais derivados da matriz extracelular (MEC) demonstraram ser scaffolds capazes de fixação e proliferação celular. 4 Um desafio que limita a aplicação de plataformas de hidrogel ECM decorre de suas propriedades mecânicas inerentemente fracas após a gelificação. O tecido nativo geralmente tem propriedades mecânicas que são magnitudes maiores do que os hidrogéis. Agentes de reticulação não tóxicos podem aumentar as propriedades mecânicas dos hidrogéis para melhor imitar o ambiente do tecido nativo. A genipina é um reticulador natural não tóxico derivado de plantas de gardênia com a capacidade de adaptar de perto as propriedades mecânicas da ECM com mudanças na concentração de genipina5,6. 
Quase todas as células do corpo existem e se organizam na ECM que produzem ou mantêm. O novo foco na importância universal da ECM na organização, condição e função em cada órgão ou sistema desencadeou a produção de plataformas baseadas em matrizes para investigação in vitro. A submucosa do intestino delgado suíno é o suporte de origem natural mais amplamente estudado e tem sido usado para regenerar tendões, ligamentos, músculo esquelético4 e até mesmo osso7. Matrizes de outros órgãos e espécies doadoras também demonstraram bom potencial de regeneração tecidual. O uso de componentes estranhos da ECM causa problemas mínimos com a imunomodulação. Após a eliminação da matéria celular do hospedeiro, a ECM restante será semelhante em conteúdo e organização de aminoácidos a todas as outras espécies de mamíferos8. Há uma linha de pensamento crescente de que a melhor maneira de examinar as interações célula-ECM in vitro é utilizar andaimes de ECM específicos de órgãos. Cada órgão fornece uma composição única de proteínas e proteoglicanos para criar nichos celulares. Os nichos fornecem a quebra estrutural, funcional e até enzimática da matriz extracelular, contribuindo para a sinalização biofísica. Para atingir um microambiente in vitro mais semelhante ao microambiente in vivo, o uso de ECM específico do tecido otimizaria os nichos celulares para pesquisa. 
O objetivo deste protocolo é fornecer um método para estabelecer uma estrutura de hidrogel exclusiva para a ECM pulmonar. Este método fornece uma plataforma para pesquisa in vitro sobre as interações célula-MEC do pulmão.

<table><tbody><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>Use em capela de exaustão com proteção para os olhos e luvas.</td></tr><tr><td>Desoxicolato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100g</td><td>Use no capuz com proteção para os olhos e luvas.</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500g</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-500g</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML</td><td>Use com proteção para os olhos e luvas.</td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-5G</td><td>Use em capela de exaustão com proteção para os olhos e luvas.</td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td>Use com proteção para os olhos e luvas.</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Wako Chemicals</td><td>078-03021</td><td>Use em capela de exaustão com proteção para os olhos e luvas.</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-151</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>45000-448</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Papel de Filtro</td><td>Whatman</td><td>8519</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Bomba Manual</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-239-1</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Copo de Graduação</td><td>VitLab</td><td>445941</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cryomill</td><td>SPEX</td><td>6700</td><td>Use criogludas e olho proteção.</td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>FTS FlexiDry</td><td></td><td>Use luvas.</td></tr><tr><td>Reômetro</td><td>Discovery</td><td>HR-2</td><td>Use luvas e proteção para os olhos.</td></tr></tbody></table>

sintonizável hidrogéis a partir de pulmonar matriz extracelular para cultura celular 3d

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Aqui é apresentado um método para o estabelecimento de múltiplos componentes hidrogéis de cultura de células para a cultura de células em pulmão in vitro. Começando com saudável en bloc tecido pulmonar de porcino, rato ou ratinho, o tecido é submergido perfundidos e em detergentes químicas subsequentes para remover os detritos celulares. Comparação histológica do tecido antes e depois do processamento confirma a remoção de mais de 95% de ADN de cadeia dupla coloração e alfa-galactosidase sugere a maioria dos detritos celulares são removidos. Após a descelularização, o tecido é, em seguida, liofilizado e cryomilled em um pó. O pó de matriz é digerido durante 48 horas numa solução de pepsina a digestão ácida e, em seguida, neutralizou-se para formar a solução Pregel. A gelificação da solução Pregel pode ser induzida através da incubação a 37 ° C e pode ser utilizada imediatamente após a neutralização ou armazenado a 4 ° C durante até duas semanas. Os revestimentos podem ser formados utilizando a solução Pregel sobre uma chapa não tratada para Capego ell. As células podem ser suspensas no Pregel antes de auto-montagem para alcançar uma cultura 3D, plaqueadas sobre a superfície de um gel formado a partir do qual as células podem migrar através do andaime, ou revestida sobre os revestimentos. Alterações à estratégia apresentada pode ter impacto na temperatura de gelificação, força ou tamanhos dos fragmentos de proteína. Além formação de hidrogel, o hidrogel de rigidez pode ser aumentada usando genipina.

Usando este método, temos produzido a partir de hidrogéis de porco normal, rato, e pulmões de ratinho (Figura 1). pulmões transformados fornecer um valor estimado de 5 mg, 40 mg, e 10 g de ECM em pó respectivamente. Uma visão geral do processo é mostrado na Figura 2. visualizações chave durante o processo incluem: aparência branca dos pulmões após a lavagem desoxicolato; após a formação Pregel, a solução deve ser opaco e a solução deve aparecer homogénea...

Este é um método para criar uma estrutura de suporte de cultura de células 3-dimensional a partir da matriz extracelular pulmonar. pulmão intacto é transformado em hidrogéis que podem suportar o crescimento das células em três dimensões.

Sintonizável hidrogéis a partir de Pulmonar Matriz Extracelular para Cultura Celular 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

O objetivo geral deste método para produzir hidrogéis personalizados é estudar as células e as condições de cultivo que replicam a complexidade da matriz extracelular pulmonar. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área pulmonar, como, por exemplo, como as células pulmonares interagem com a MEC em condições saudáveis e patológicas. A principal vantagem desta técnica é que os hidrogéis de MEC pulmonar podem ser adaptados conforme a aplicação, em cultivos 2D ou 3D.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido à complexidade das técnicas de descelularização, às vezes exigindo várias pessoas e atenção aos detalhes para otimizar a quantidade de tecido viável. Para este protocolo, tenha um pulmão suíno pronto para descelularização. Detalhes sobre seu preparo podem ser encontrados no protocolo textual.Uma vez que o pulmão esteja preparado, utilize uma bomba manual que esteja canulada para se ajustar à artéria pulmonar. Primeiro, perfundir cerca de um litro de água na vasculatura e, em seguida, 1,5 litro na traqueia. Repita este procedimento três vezes, aumentando o volume de água perfundida conforme os detritos celulares forem removidos.A

tunable-hydrogels-from-pulmonary-extracellular-matrix-for-3d-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Técnicas simples são descritos para a produção rápida de microfabricated sistemas de cultura neural usando um dispositivo de microespelhos digitais para litografia dinâmica máscara de projeção em substratos de cultura de células regulares. Estes sistemas cultura pode ser mais representativo da arquitectura biológica natural, e as técnicas descritas podem ser adaptadas para inúmeras aplicações.

Fabricação de hidrogéis micropatterned para Sistemas de Cultura Neural usando fotolitografia Projeção Dinâmica Máscara

Descrevemos a fabricação de folhas de hidrogel micropadronizadas usando um processo simples, que pode ser montado e manipulado de forma independente. Usando essas folhas modulares de hidrogel, um sistema simples de cultura de células 3D em escala macro pode ser gerado com um microambiente celular controlado.

Construção de Fichas de hidrogel modular para micropadronadas Macro-escalado 3D Cellular Arquitetura

A imagem de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET) é uma ferramenta poderosa para estudos de biologia celular em tempo real. Aqui é apresentado um método para imagens de células FRET em microambientes fisiológicos de hidrogel tridimensional (3D) usando microscopia de epifluorescência convencional. Uma análise para sondas FRET raciométricas que produz razões lineares ao longo da faixa de ativação é descrita.

FRET Imaging no hidrogéis tridimensionais

Diferentes métodos para manipular a arquitetura tridimensional em hidrogel à base de proteínas são avaliados aqui com respeito a propriedades do material. As redes se são acrescidas com um peptídeo de célula-adesivo, e sua viabilidade na cultura de pilha é avaliada usando duas linhas de células de modelo diferente.

Fácil manipulação das arquiteturas em hidrogel à base de proteínas para aplicações de cultura de células

Este protocolo descreve a fabricação de microcryogels elástica 3D se integrando microfabrication com tecnologia cryogelation. Durante o carregamento com células, microtissues 3D são gerados, que pode ser facilmente injetado em vivo para facilitar a terapia regenerativa ou montadas em matrizes para em vitro triagem de drogas de alto rendimento.

Microtissues 3D para terapia regenerativa injetável e triagem de drogas de alto rendimento

Modelos de cultura BICAMADA atuais não permitem para estudos funcionais em vitro que imitam o microambiente que na vivo . Usando o glicol de polietileno e um método de modelagem de óxido de zinco, este protocolo descreve o desenvolvimento de uma membrana basal de biomimetic ultrafinos com rigidez sintonizável, porosidade e composição bioquímica que imita pròxima na vivo matrizes extracelulares.

Cultura de células de hidrogel ultrafinos Porated elástico como uma membrana do porão biomimético para Dual

Hidrogel engenharia de proteínas recombinantes é vantajosos para cultura celular 3D, já que permitem completo pré-definido a espinha dorsal do polímero e, portanto, o microambiente celular. Aqui, descrevemos o processo de purificação de proteínas recombinantes de elastina, como e sua aplicação no encapsulamento de célula de hidrogel 3D.

Produção de elastina, como proteína hidrogel para encapsulamento e imunocoloração de células em 3D

Desenvolvemos um modelo de câncer de mama heterogênea consistindo de células de tumor e fibroblasto imortalizadas incorporadas em um bioink de alginato/gelatina de bioprintable. O modelo recapitula o microambiente do tumor na vivo e facilita a formação de esferoides tumor multicelulares, produzindo insights sobre os mecanismos de condução tumorigênese.

Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D em Vitro sistemas modelo induzem a formação de esferoide de célula

O método apresentado envolve alongamento uniaxial de hidrogéis macios 3D embutidos na borracha de silicone, permitindo microscopia confocal ao vivo. Demonstra-se a caracterização das cepas de hidrogel externos e internos, bem como o alinhamento de fibras. O dispositivo e o protocolo desenvolvidos podem avaliar a resposta das células a vários regimes de tensão.

Tensão controlada de hidrogéis 3D sob imagem de microscopia ao vivo

O presente protocolo descreve uma plataforma experimental para avaliar os efeitos de pistas mecânicas e bioquímicas sobre as respostas quimioterápicas de células glioblastoma derivadas pelo paciente em culturas mímicas de matriz 3D usando um dispositivo de iluminação UV feito sob medida facilitando o fotocrosslinking de alto rendimento de hidrogéis com características mecânicas incompáveis.

Matrizes de hidrogel permitem aumento de rendimento para efeitos de triagem de componentes matriciais e terapêuticos em modelos de tumor 3D

Este artigo descreve como bioimprimir hidrogéis fototáveis em 3D para estudar o enrijecimento da matriz extracelular e a ativação de fibroblastos.

Bioimpressão 3D de hidrogéis fototáveis para estudo da ativação de fibroblastos

Aprenda a criar hidrogéis ajustáveis a partir de matriz extracelular pulmonar para cultura celular 3D. Este método permite estudar interações celulares em condições que replicam a complexidade do pulmão.

Sintonizável hidrogéis a partir de Pulmonar Matriz Extracelular para Cultura Celular 3D

Explorar mais vídeos