Sintonizável hidrogéis a partir de Pulmonar Matriz Extracelular para Cultura Celular 3D
17 de janeiro de 2017
Este é um método para criar uma estrutura de suporte de cultura de células 3-dimensional a partir da matriz extracelular pulmonar. pulmão intacto é transformado em hidrogéis que podem suportar o crescimento das células em três dimensões.
O objetivo geral deste método para fazer hidrogéis personalizados é estudar células e condições de cultura que replicam a complexidade da matriz extracelular do pulmão. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo pulmonar, como como as células pulmonares interagem com a ECM em condições saudáveis e patológicas. A principal vantagem desta técnica é que os hidrogéis de ECM pulmonar são adaptáveis à sua aplicação em cultura 2D ou 3D.
Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à complexidade das técnicas de descelularização, às vezes exigindo várias pessoas e atenção aos detalhes para otimizar a quantidade de tecido viável. Para este protocolo, tenha um pulmão suíno pronto para descelularização. Detalhes sobre sua preparação podem ser encontrados no protocolo de texto.
Uma vez que o pulmão esteja preparado, use uma bomba manual canulada para ajustar a artéria pulmonar. Primeiro, infunda cerca de um litro de água na vasculatura e, em seguida, 1,5 litro na traqueia. Faça isso três vezes, aumentando o volume de água perfundido à medida que os detritos celulares são removidos.
Em seguida, perfunda o tecido com Triton X-100, também usando a bomba manual. Em seguida, mergulhe o tecido em um banho de solução Triton X-100 a quatro graus Celsius por 24 horas. Após 24 horas, enxágue a vasculatura e a traqueia três vezes com água destilada.
Após os enxágues, use a bomba manual para perfundir o tecido com desoxicolato. E então submergir o tecido em desoxicolato por 24 horas a quatro graus Celsius. No dia seguinte, enxágue o tecido três vezes com água destilada, como antes.
Após os enxágues, use a bomba manual para perfundir o tecido com cloreto de sódio filtrado. Em seguida, mergulhe o tecido em cloreto de sódio filtrado por uma hora a quatro graus Celsius. Após o banho, perfundir a vasculatura e a traqueia três vezes com água destilada para enxaguar.
Após os enxágues, perfunda o tecido com solução de DNase e, em seguida, mergulhe-o na solução de DNase por uma hora a quatro graus Celsius. Depois de uma hora, perfunda a vasculatura e a traqueia cinco vezes usando PBS, não água. Agora, usando apenas tecido branco opaco, disseque todos os túbulos com dois milímetros de diâmetro ou maiores.
Eles são encontrados principalmente ao redor do hilo e das porções mediais dos pulmões. Deixe as zonas respiratórias intactas, que estão principalmente na periferia. Depois de remover os túbulos, disseque o tecido em seções de uma polegada ou menores.
A orientação desses blocos não é importante. Depois de drenar os blocos de tecido, transfira-os para um tubo cônico de 50 mililitros e congele-os a 80 graus Celsius. Alguns blocos podem ser reservados para histologia para confirmar a remoção das células e detritos.
Para processar o tecido pulmonar em pó descelularizado, recoloque a tampa do tubo de tecido congelado por um papel de filtro e prenda-o com um elástico. Em seguida, liofilize o tecido até que todo o excesso de líquido desapareça usando um liofilizador de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, armazene o tecido a 80 graus Celsius até que possa ser moído.
Para preparar o moinho, primeiro carregue-o com nitrogênio líquido, deixando espaço para o tubo do moinho. Em seguida, do tubo do moinho, remova a barra magnética do moinho e cubra o fundo do tubo com lenço de papel. Em seguida, recoloque a barra do moinho e embale frouxamente mais tecido para encher o tubo.
Em seguida, feche o tubo do moinho, coloque-o no freezer / moinho e encha o moinho com nitrogênio líquido até sua capacidade máxima. Agora, opere o moinho por aproximadamente cinco minutos com uma taxa de impactação de cerca de 600 por minuto. Em seguida, armazene o pó descelularizado a 80 graus Celsius, até que seja necessário.
Para fazer o material de pré-gel, adicione pó de tecido descelularizado e pepsina a um tubo cônico. Em seguida, adicione ácido clorídrico molar 0,01 ao tubo, para uma concentração final de 1% de pó de tecido descelularizado e 0,01% de pepsina. Mantenha esta solução sob agitação constante à temperatura ambiente durante 48 horas para digerir os tecidos.
Após 48 horas, coloque a solução no gelo por cinco minutos. Agora ajuste o pH da solução para 7,4 usando hidróxido de sódio molar frio 0,1 e, em seguida, traga a concentração de PBS da solução para 1X adicionando 10X PBS. Temos alguma experiência com a alteração de tempos e do pH do pré-gel.
Há alguma flexibilidade no intervalo que pode ser usado, mas as propriedades podem mudar drasticamente se o procedimento for alterado de maneiras menores. A solução não é considerada pré-gel e pode ser usada para revestir placas não tratadas para formar hidrogéis para formar células, para formar hidrogéis para formar células, ou pode ser modificada antes de formar hidrogéis para aumentar a rigidez dos hidrogéis. Para cultivar células em revestimento de gel microporoso bidimensional, adicione 20 microlitros de solução de pré-gel aos poços de uma placa de cultura de tecidos não tratada de 96 poços.
Em seguida, leve a placa à geladeira durante a noite a quatro graus Celsius para que as proteínas sejam absorvidas na placa. No dia seguinte, aspire a solução de pré-gel e enxágue os poços com PBS. Em seguida, adicione 3.200 células a cada poço e complete o volume de mídia em cada poço para 100 microlitros.
As placas podem então ser incubadas. Para uma cultura de células tridimensional com células dentro do gel microporoso, ressuspenda as células de interesse a um milhão por mililitro em solução de pré-gel. Em seguida, dispense rapidamente 16 microlitros da suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços para formar uma cultura de células 3D com cerca de 500 mícrons de espessura.
O gel se formará em 30 minutos depois de incubado a 37 graus Celsius. Após a formação dos géis, adicione mídia aos poços até as marcas de 100 microlitros. Para uma cultura de células tridimensional com células no topo do gel microporoso, adicione os 100 microlitros da solução de pré-gel aos poços de uma placa de 96 poços não tratada.
Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos para gelificação. Assim que os géis se formarem, adicione 3.200 células em meio de 100 microlitros em cima dos hidrogéis e prossiga para incubar a placa. Os hidrogéis foram produzidos a partir de pulmões normais de porco, rato e camundongo usando o método descrito.
Os testes reológicos confirmaram que mais de 90% da gelificação ocorre nos primeiros minutos após atingir 37 graus Celsius. Os hidrogéis formados foram estáveis por longos períodos em PBS, mas a fixação e proliferação celular podem mudar com o tempo. A solução de pré-gel foi testada como uma codificação para melhorar a ligação celular.
A fixação e proliferação de células endoteliais da veia umbilical humana foi medida usando um MTTSA. Melhorias foram observadas revestindo os poços com ECM. Ao fazer géis 3D, a adição de Genipin aumentou a reticulação do hidrogel.
Usando varreduras de frequência em um reômetro, a rigidez do hidrogel foi diretamente correlacionada com a concentração de Genipin, com a concentração mediana e mais relevante sendo 0,01%Testando os géis mais rígidos, a proliferação celular foi medida como sendo maior por um MTTSA nos géis com reticulação aumentada. Uma vez dominada, a descelularização pode ser realizada em oito horas ao longo de quatro dias. A solução pré-gel pode ser feita em uma hora durante dois dias, e a formação do gel pode ser realizada em duas horas ao longo de dois dias.
Após este procedimento, outros métodos como AFM, western blots, coloração e imuno-histoquímica podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como módulo de elasticidade, composição proteica e resposta celular ao material.
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Visão Geral
Este método descreve a criação de uma estrutura tridimensional para cultivo celular utilizando matriz extracelular pulmonar. O processo envolve a descelularização de tecido pulmonar intacto para produzir hidrogéis que facilitam o crescimento celular em três dimensões.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Cultura celular
- Pesquisa sobre matriz extracelular
- Biologia pulmonar
Contexto
- Este método tem como objetivo replicar a complexidade da matriz extracelular pulmonar.
- Aborda como as células pulmonares interagem com a MEC em diversas condições.
- A técnica permite a personalização de hidrogéis para aplicações específicas.
- A descelularização exige atenção cuidadosa aos detalhes e pode necessitar de múltiplos profissionais.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver hidrogéis que imitem a MEC pulmonar para fins de pesquisa.
- Investigar o comportamento celular em condições pulmonares saudáveis e patológicas.
- Fornecer um método confiável para estudar as interações entre células pulmonares.
Métodos Utilizados
- Descelularização de tecido pulmonar suíno.
- Preparação de hidrogéis a partir da matriz extracelular.
- Cultivo celular em ambientes 2D e 3D.
- Otimização da viabilidade do tecido durante o processo.
Resultados Principais
- Criação bem-sucedida de hidrogéis personalizáveis de ECM pulmonar.
- Melhor compreensão das interações celulares pulmonares com a ECM.
- Comprovado potencial para aplicação em diversos contextos de pesquisa.
- Identificação de desafios no processo de descelularização.
Conclusões
- O método fornece uma ferramenta valiosa para a pesquisa pulmonar.
- Os hidrogéis podem ser ajustados conforme necessidades experimentais específicas.
- Estudos futuros podem explorar as implicações da MEC na saúde pulmonar.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a criação de hidrogéis de matriz extracelular pulmonar ajustáveis que replicam a complexidade do tecido pulmonar para estudos in vitro. Ele auxilia na redução mecanicista de riscos na validação de alvos ao fornecer um sistema relevante para a doença, no qual se podem estudar as interações célula-MEC em condições saudáveis e patológicas. A rigidez ajustável e o formato personalizável aumentam a confiabilidade preditiva na seleção de modelos pré-clínicos e no desenvolvimento de ensaios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da modelagem das interações entre células pulmonares e a MEC nativa.
- Valor Operacional: Oferece um sistema biológico reprodutível para esclarecimento de vias e validação funcional de alvos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios por meio de cultivo tridimensional relevante para a doença, que melhora o alinhamento de biomarcadores translacionais.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera hidrogéis padronizados com resultados quantificáveis para triagem confiável de compostos.
- Valor Operacional: Permite padronização e escalabilidade do ensaio por meio de temperatura e rigidez de gelificação ajustáveis.
- Potencial de Reutilização: Forma revestimentos ou esqueletos tridimensionais compatíveis com placas de alto rendimento e análises posteriores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a continuidade translacional do descobrimento à validação pré-clínica utilizando matriz extracelular pulmonar fisiologicamente relevante.
- Mitigação de Riscos: Aumenta a confiança preditiva ao correlacionar a rigidez do hidrogel (por meio da reticulação com genipina) com os resultados de proliferação celular.
- Apoio à Decisão: Subsidia decisões de avanço ajustadas ao risco por meio de alterações mensuráveis na adesão e migração celulares.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a biologia inicial até a identificação de compostos líderes, ao fornecer uma plataforma de cultivo 3D ajustável que modela o microambiente específico do pulmão.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir o cultivo celular em matriz extracelular derivada de pulmão sob condições controladas.
- Triagem: Fornece hidrogéis prontos para ensaios com gelificação reprodutível e espessura quantificável para avaliação consistente de compostos.
- Análises: Gera resultados mensuráveis, como cinética de formação do gel, rigidez e proliferação celular, para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta científica ao trabalho pré-clínico por meio de modelagem de sistemas relevantes à doença e leituras compatíveis com biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de hidrogel reutilizável e adaptável a modelos de roedores e suínos para padronização entre projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista em estudos de células pulmonares e matriz extracelular (ECM).
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de etapas definidas de descelularização, digestão e gelificação.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/interromper ao permitir a avaliação precoce dos efeitos de compostos em uma matriz fisiologicamente relevante.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco por meio de hidrogéis ajustáveis que modelam a rigidez da matriz extracelular modificada pela doença.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em descelularização de tecidos e preparação de hidrogéis para garantir viabilidade e consistência.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo liofilizador, criomoinho e reômetro, para controle do processo e caracterização.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de formulação e armazenamento de hidrogéis para resultados reprodutíveis.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método em pulmões de diferentes espécies ou modelos de doenças.
- Inclui limitações práticas, como tempo de processamento de vários dias e sensibilidade a alterações no procedimento que afetam a resistência do gel.
