Analisando Efeitos benéficos de suplementos nutricionais sobre as funções intestinais epitelial de barreira Durante Experimental Colite

O objetivo geral deste protocolo é avaliar os efeitos de nutrientes suplementares em um modelo murino de colite induzida por sulfato de dextrano sódico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia intestinal sobre o desenvolvimento da ciência clínica ao longo da direção do experimento do modelo de colite. As principais vantagens dessa técnica são que ela é de baixo custo, não requer equipamentos sofisticados e fornece uma análise clara da morfologia de todo o cólon.

Este método pode ser usado para avaliar o estresse oxidativo no cólon como consequência do recrutamento excessivo de neutrófilos. Para administração de suplementos nutricionais por gavagem, primeiro prenda manualmente o mouse pela nuca, colocando a cauda entre o terceiro dedo e a base do polegar. Em seguida, segurando o mouse na posição vertical, insira a agulha de gavagem no lado esquerdo da boca do animal e siga cuidadosamente o céu da boca para localizar o esôfago.

Se nenhuma resistência for encontrada, avance a agulha em direção ao estômago. Entregue lentamente todo o volume do suplemento, seguido da remoção cuidadosa da seringa e meça o peso corporal do animal. Atribua uma pontuação de zero a quatro de acordo com a porcentagem de perda de peso, em seguida, colete uma amostra de fezes frescas e use os aplicadores fornecidos para aplicar um esfregaço fino de amostra em uma lâmina de um kit de teste de sangue oculto nas fezes guaiaco.

Feche a tampa na frente do kit e abra a janela traseira para aplicar duas gotas da solução do revelador na parte de trás do local da amostra. Leia os resultados após 30 segundos, atribuindo uma pontuação de zero a quatro, dependendo da intensidade do sinal. Em seguida, observe uma segunda amostra de fezes frescas para avaliar a consistência das fezes, atribuindo uma pontuação de zero a quatro, conforme apropriado.

Para determinar a permeabilidade epitelial intestinal in vivo, coloque um animal anestesiado em decúbito dorsal e faça uma incisão na linha média para expor os intestinos. Localize o ceco e faça uma pequena incisão no segmento proximal dos ascendentes do cólon. Em seguida, insira uma agulha de alimentação de calibre 22 e prenda a agulha com uma ligadura de fio de seda comum.

Lave cuidadosamente um volume abundante de PBS através da agulha para enxaguar todas as fezes do cólon, seguido pela instalação da solução de azul de Evans até que o corante atinja o ânus. Após 15 minutos, lave o tubo com um volume excessivo de PBS até que a lavagem perianal esteja limpa. Em seguida, excise o cólon e enxágue o tecido com mais PBS, seguido por um mililitro de seis N-acetilcisteína milimolar para eliminar qualquer corante grudado no muco colônico.

Agora corte o cólon longitudinalmente e enxágue o tecido mais uma vez com PBS e N-acetilcisteína, depois registre o peso e o comprimento do cólon e coloque o tecido em dois mililitros de N, N-dimetilformamida à temperatura ambiente com agitação suave para extrair o corante restante, medindo as concentrações do corante espectrofotometricamente a 610 nanômetros na manhã seguinte. Após sete dias de sulfato de dextrano sódico, ou colite induzida por DSS, disseque todo o cólon e registre seu comprimento. Para rolos suíços, abra o cólon longitudinalmente, remova cuidadosamente qualquer matéria fecal e use uma vara de madeira fina e redonda ou uma pinça de ponta fina para enrolar o tecido com a mucosa voltada para dentro.

Em seguida, coloque cuidadosamente o tecido dentro de um de incorporação, seguido de fixação com cinco mililitros de formaldeído a 10% em temperatura ambiente. É fundamental enrolar o cólon firmemente sem dobrar para evitar problemas durante a secção do tecido, o que pode resultar em um dano tecidual clínico e uma falsa interpretação como dano associado à colite. Após 48 horas, lavar a amostra com água da torneira durante 18 horas, seguida de desidratação por série de etanol.

Após a última imersão absoluta em etanol, tratar o tecido com quatro incubações de uma hora em xileno. Após a última imersão em xileno, colocar a amostra em 50 mililitros de parafina líquida durante uma incubação de 17 horas e outra de três horas. Ao final das três horas de incubação, mergulhe a amostra em um molde de plástico quadrado de 22 milímetros cúbicos em oito a 10 mililitros de parafina líquida fresca por 24 horas.

Quando a parafina estiver solidificada, use um micrótomo para adquirir seções de tecido de cinco mícrons de espessura, depois mergulhe brevemente as seções transversais em um banho-maria de um litro contendo 0,3% de gelatina e monte imediatamente as amostras em lâminas de vidro tratadas com polilisina para coloração H & E. Para análise de estresse oxidativo, primeiro crie uma barreira ao redor do tecido usando uma caneta hidrofóbica. Em seguida, incube seções transversais criogênicas de tecido de oito mícrons em cinco DHE micromolar dissolvido em água por 30 minutos a 37 graus Celsius no escuro.

A incubação é seguida por três lavagens de 15 minutos em PBS com agitação suave à temperatura ambiente. Seque as amostras ao ar e adicione uma gota de meio de montagem para proteger a fluorescência. Em seguida, observe a fluorescência de etídio oxidado em um microscópio confocal de varredura a laser com uma ampliação de 40x.

O tratamento com DSS leva a um aumento contínuo do índice de atividade da doença, conforme esperado, atingindo uma pontuação máxima no sétimo dia após a indução. A suplementação de dieta anti-inflamatória retarda o início precoce da colite, enquanto os efeitos protetores são apenas marginais em momentos posteriores. A intervenção dietética também pode prevenir aumentos induzidos por DSS na permeabilidade epitelial intestinal, bem como encurtamento do comprimento do cólon.

A coloração de hematoxilina e eosina de tecidos do cólon distal embebidos em parafina revela que as amostras de controle demonstram uma morfologia normal, enquanto os animais tratados com DSS exibem os sinais típicos de colite. É importante notar que o tratamento paralelo com suplementação dietética alivia claramente as alterações morfológicas induzidas pela colite com uma morfologia geral semelhante à do grupo controle. A coloração por imunofluorescência do tecido distal do cólon também indica que as moléculas da junção inaderente apertada são internalizadas durante a colite induzida por DSS e que a co-localização dessas proteínas é parcialmente perdida nos contatos das células epiteliais da cripta.

É importante ressaltar que essa internalização é reduzida quando camundongos tratados com DSS recebem o suplemento dietético anti-inflamatório e antioxidante. Além disso, o recrutamento robusto de neutrófilos para o cólon em resposta à colite induzida por DSS é neutralizado pela suplementação da dieta, resultando na melhora concomitante do estresse oxidativo induzido por neutrófilos e uma ligeira redução na produção de citocinas inflamatórias. Após este procedimento, outros métodos, como medições da câmara de secreção, podem ser realizados para analisar a resistência elétrica da barreira epitelial no cólon.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da pesquisa da colite e para explorar o mecanismo molecular da patogênese da colite ulcerativa em um modelo de camundongo reprodutível. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar o desenvolvimento da colite e os efeitos benéficos dos suplementos nutricionais nas funções da barreira epitelial intestinal. Não se esqueça de que trabalhar com animais vivos requer a adesão a altos padrões éticos para evitar sofrimento desnecessário.