Ativando Autophagy pelo exercício aeróbio em ratos

Autophagy activação é benéfico na prevenção de uma série de doenças. Uma das abordagens fisiológicas para induzir autofagia in vivo é o exercício físico. Aqui nós mostramos como ativar a autofagia pelo exercício aeróbico e medir os níveis de autofagia em camundongos.

O objetivo geral deste experimento é ativar fisiologicamente a autofagia em camundongos por corrida forçada ou voluntária e, em seguida, medir os níveis de autofagia em tecidos específicos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a autofagia, em particular, como a autofagia e a ação contribuem para os efeitos benéficos mediados pelo exercício aeróbico. A principal vantagem desta técnica é que o exercício físico é uma rápida oscilação aeróbica entre a autofagia in vivo usando camundongos.

Para este experimento, comece com camundongos C57 pretos de seis com oito a doze semanas de idade, abrigando um gene trans para detectar autofagia induzida por exercício in vivo, conhecido como GFP-LC3. Para obter detalhes sobre o uso de esteiras de ratos, consulte a seguinte publicação do JoVE. Defina o estímulo elétrico da esteira para baixa intensidade.

Em suas duas primeiras sessões, aclimate os ratos a uma esteira aberta de dez graus em subida. No primeiro dia, exercite os ratos por cinco minutos com a esteira correndo a oito metros por minuto. No segundo dia, execute os ratos por dez minutos, inicialmente a oito metros por minuto, e depois de cinco minutos, aumente a velocidade para dez metros por minuto.

No terceiro dia, execute os ratos por 90 minutos completos. Inicie a esteira a dez metros por minuto e incentive os ratos a correr usando toques suaves para evitar choques repetidos nos pés. É fundamental observar e manipular os ratos para que eles não recebam muitos choques elétricos durante os 90 minutos de corrida.

Durante a corrida, use os dedos para encorajar os ratos a permanecerem na esteira. Após 40 minutos, 6aumente a velocidade em um metro por minuto. Após 50 minutos, aumente a velocidade em um metro por minuto novamente.

Após 60 minutos, aumente a velocidade em mais um metro por minuto. Após 70 minutos, comece a aumentar a velocidade a cada cinco minutos para que os últimos cinco minutos da corrida de 90 minutos sejam de 17 metros por minuto. Após o término do teste, eutanasiar imediatamente os camundongos para coleta de tecido, se desejar.

Para este teste, abrigue os ratos individualmente. Use a mesma cepa descrita anteriormente. Prepare uma roda de corrida de mouse de 11,4 centímetros de diâmetro com um hodômetro de bicicleta acoplado.

Cada rotação deve medir 358 milímetros de curso. Mova o mouse para a gaiola que contém a roda e deixe o mouse usá-lo livremente por duas semanas. A cada 24 horas, registre a distância percorrida pelo mouse a partir do hodômetro.

Após as duas semanas, colha tecidos para análise conforme necessário. Para medir o fluxo autofágico, trate os camundongos com o inibidor da autofagia, cloroquina, por três dias. Dissolva a cloroquina em PBS a cinco miligramas por mililitro e injete-a em camundongos por via intraperitoneal na dose de 50 microgramas por grama.

Dê aos camundongos uma injeção diária por três dias consecutivos e colha tecidos três horas após a última injeção. Para os camundongos exercitados em esteira, inicie a corrida de 90 minutos 90 minutos após a injeção no terceiro dia para que a corrida termine três horas após a injeção. Em seguida, eutanasiar os ratos e colher imediatamente seus tecidos.

Prepare-se para profusar um animal dentro de 90 minutos após o exercício, preparando o fixador. Carregue uma seringa de 30 mililitros com 15 a 20 mililitros de paraformaldeído a quatro por cento recém-fabricado e conecte a seringa com uma agulha de cateter de calibre 20. Conecte a bomba de seringa carregada e ajuste-a para 90 mililitros por hora de fluxo contínuo.

Com o animal em uma superfície de trabalho limpa, em decúbito dorsal, abra a cavidade torácica através do diafragma para expor o coração. Agora, insira a agulha do cateter no ventrículo direito. Em seguida, faça uma pequena incisão no fígado para drenar o sangue e iniciar a bomba.

Injete o fixador até que o pulmão e o fígado fiquem completamente pálidos. Normalmente, 15 mililitros de fixador são suficientes. Após a profusão, retire a agulha e recolha os tecidos de interesse.

Para coletar o músculo esquelético, disseque o vasto lateral. Puxe brevemente a pele da perna para trás para expor os músculos e localizar o quadríceps femoral. Em seguida, disseque o vasto lateral, que é o músculo externo ligado à porção superior do osso femoral.

Para posterior fixação e desidratação, coloque os tecidos colhidos em paraformaldeído a quatro por cento por 24 horas a quatro graus Celsius. No dia seguinte, transfira os tecidos para PBS de sacarose a 15% e deixe-os de molho a quatro graus Celsius durante a noite ou até que se assentem na solução. Em seguida, transfira os tecidos para 30% de sacarose PBS a quatro graus Celsius durante a noite ou mais.

Mantenha os lenços no escuro o máximo possível durante esses banhos. Em seguida, coloque os lenços em um meio de incorporação, como OCT, e corte-os em pedaços menores, se necessário. Em seguida, deixe-os se aclimatar por alguns minutos em uma pequena placa de Petri.

Em seguida, transfira-os para criomoldes com OCT suficiente para cobrir. Nos moldes, oriente as superfícies de corte para o fundo e evite formar bolhas. Em seguida, congele as amostras em um refrigerador de espuma coberto cheio de gelo seco até que a OCT fique branca.

Agora, embrulhe amostras individuais em folhas rotuladas, feche-as em um saco plástico e armazene-as a 80 graus Celsius negativos até que possam ser processadas. Usando GFP marcado LC3 como um sistema repórter, a indução de autofagia foi observada em camundongos exercitados conforme descrito. Após a estimulação da autofagia, a LC3 translocou do citosol para o autofagossomo em estruturas pontuadas.

Os camundongos exercitados tinham muito mais pontos GFP-LC3 no músculo esquelético e no córtex cerebral em comparação com os camundongos em repouso. A análise de Western blot usando um anticorpo LC3 mostrou que o exercício induziu significativamente a geração de LC3-II conjugativa lipídica, sugerindo que houve aumento da conversão de LC3-I citosólica em LC3-II. Em seguida, foi medida a degradação do receptor de carga autofágica, p62.

90 minutos de atividade em esteira causaram uma maior degradação do p62 no músculo esquelético do que a condição de repouso. Esse efeito foi resgatado por uma injeção de cloroquina antes do exercício. Como a cloroquina é um inibidor da degradação lisossômica, esses dados indicam que o fenômeno observado se deve a um fluxo autofógico elevado e não a um bloqueio na degradação autofagossômica.

Após seu desenvolvimento, essa técnica teve precursores no campo da autofagia para explorar os efeitos sobre o mecanismo do exercício na degradação do metabolismo e dos comportamentos animais. Ao tentar este procedimento, é importante monitorar os mouses enquanto eles estão correndo. Seguindo este procedimento, estão os métodos como a microscopia elétrica.

A microscopia animal pode ser realizada para responder a perguntas adicionais, como exercícios em vias selecionadas de autofagia, como mitofagia e lipofagia.