Name: Ativando Autophagy pelo exercício aeróbio em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprenda a ativar autofagia por exercício aeróbio em camundongos C57BL/6 usando GFP-LC3. Este método permite medir níveis de autofagia em tecidos específicos e investigar os benefícios fisiológicos do exercício para a saúde celular.

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Agradecemos ao Laboratório de Histologia e Fenotipagem de Camundongos da Northwestern University pelo suporte e assistência técnica e a Noboru Mizushima (Universidade de Tóquio) por fornecer camundongos transgênicos GFP-LC3. A. R. e C. H. foram apoiados pelos fundos iniciais da Northwestern University e pela doação do National Institutes of Health (DK094980).

Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Northwestern (IACUC). 1. mouse Models <ol><li> Use ratos 8-12 semanas de idade no treinamento físico. Para detectar autofagia induzida exercida in vivo, os ratinhos transgénicos usar GFP-LC3 (C57BL / 6, fundo) para estudos de imagiologia e murganhos C57BL / 6 para as análises bioquímicas. </li></ol> 2. Autophagy induzida pelo exercício <ol><li> Configuração de esteira - exercício forçado <ol><li> Aclimatar e treinar os ratos em um 10 ° esteira aberta para cima por 2 dias. No dia 1, exercer a ratos durante 5 min a 8 m / min, e no dia 2, exercer os ratos durante 5 min a 8 m / min, seguido por mais 5 min a 10 m / min 10. Incentivar os ratos para ser executado por cotovelada mão suave. </li><li> No 3º dia, deixou os ratos submetidos a uma única sessão de correr por 90 min no 10 ° subida esteira, starting a uma velocidade de 10 m / min. Após 40 minutos, aumente a velocidade da esteira a uma velocidade de 1 m / min a cada 10 min durante um total de 30 min, e em seguida aumentar a velocidade com a velocidade de 1 m / min a cada 5 minutos até atingir 17 m / min, para um total de 90 min de tempo de exercício e 1.070 metros de a distância de funcionamento. </li><li> Defina o estímulo elétrico na faixa de baixa intensidade (1,2 Hz), e incentivar os ratos que correr para evitar choques repetidos pé. </li><li> Para a coleta de tecidos, eutanásia os ratos por inalação de isoflurano, seguido por deslocamento cervical imediatamente após o exercício. Outros métodos de eutanásia aprovados também podem ser utilizados, tais como CO2 ou injecção IP de outros anestésicos. O nível de autofagia não parece ser afectado por métodos de eutanásia. </li></ol></li><li> Executar a instalação roda - exercício voluntário <ol><li> Coloque uma roda de execução do rato (11,4 cm de diâmetro) dentro de uma gaiola com um rato alojados individualmente. </li><li> Verificar a capacidade corrente e com uma conta-quilómetros de bicicleta.Configure o parâmetro de roda [distância (em mm) por rotação completa da roda] em 358 (11,4 * π). Medir a distância percorrida após 24 horas. </li><li> Deixe o mouse correr voluntariamente para 2 semanas com a roda de corrida. Para a coleta de tecidos, sacrificar o mouse na parte da manhã após o período de execução. </li></ol></li></ol> 3. Autophagy Avaliação Flux <ol><li> Para medir o fluxo autofágica sob repouso e exercício condições, tratar ratos com a cloroquina inibidor autofagia por três dias e compará-los com os ratinhos tratados com PBS. <ol><li> Dissolve-se cloroquina em PBS (5 mg / ml), e injectar cloroquina em ratinhos por via intraperitoneal na dose de 50 mg / kg / dia durante três dias consecutivos. Sacrificar os ratinhos e recolhem tecidos de 3 horas após a última injecção. </li><li> Para ratinhos exercidas, o pré-tratamento com cloroquina-los durante dois dias consecutivos, a uma dose de 50 mg / kg / dia. No terceiro dia, injectar os ratinhos com a mesma concentração de cloroquina, e depois90 min deixá-los correr na esteira por mais 90 min. </li><li> Eutanásia os ratos por inalação de isoflurano, seguido por deslocação cervical. Recolhe tecidos imediatamente após a execução, de modo que o tempo total de incubação de cloroquina é o mesmo que o controlo (de repouso) ratinhos (3 h). NOTA: Como alternativa, usar uma única injecção de cloroquina para determinar o fluxo autofagia em tecidos de ratinho. </li></ol></li></ol> 4. Tissue Colheita e Fixação <ol><li> Antes da colheita de tecido preparar a solução salina tamponada com fosfato (PBS) e fresco a 4% de paraformaldeído (PFA, cuidado: equipamentos de protecção pessoal necessário) em PBS a um pH final de 7,4. Armazenar ambas as soluções a 4 ° C. </li><li> Encher 30 ml de seringa com 15 - 20 ml de 4% de PFA (para ratinhos GFP-LC3). Ligar a seringa com uma agulha G 20 cateter. </li><li> Depois do exercício, sacrificar os ratos por inalação de isoflurano, seguido por deslocação cervical. </li><li> Colocar o animal em uma superfície de trabalho limpa em seu back. Cortar e abrir a cavidade torácica, cortando o diafragma para expor o coração. </li><li> Fazer uma pequena incisão no fígado para permitir que o sangue sair, e injectar um total de 15 ml de 4% de PFA lentamente dentro do ventrículo direito do coração, através do cateter, até que o pulmão e fígado transformar completamente pálido. Perfundir o rato imediatamente após a sessão de exercício, usando uma bomba de seringa com um caudal constante de 90 ml / hr. </li><li> Após a perfusão, retire a agulha e recolher tecidos de interesse (por exemplo cerebrais 11 e no músculo esquelético). Para o músculo esquelético, dissecar vasto lateral. Resumidamente, puxar a pele da perna para trás para expor a musculatura, localizar os quadríceps 12, e dissecar vasto lateral, que é o músculo externo ligado à porção superior do osso femoral. </li><li> Para mais a fixação e a desidratação, colocar os tecidos de murganhos GFP-LC3 em PFA a 4% durante 24 h a 4 ° C, e, em seguida, transferi-los para 15%sacarose-PBS a 4 ° C durante a noite ou até que os tecidos tenham resolvido, e, em seguida, a 30% de sacarose-PBS a 4 ° C durante a noite ou durante mais tempo de armazenamento. Manter as amostras no escuro, tanto quanto possível uma vez que podem ser sensíveis a uma luz forte. </li><li> Para a análise Western Blot encaixe congelar os tecidos a partir de ratinhos C57BL / 6 directamente em azoto líquido, e armazená-las a -80 ° C. </li></ol> 5. Análise de Imagem de GFP-LC3 puncta <ol><li> processo de tecido <ol><li> Pré-tratamento dos tecidos (previamente fixas em PFA e armazenados em 30% de sacarose) em forma de incorporação tais como &quot;composto de temperatura óptima de corte&quot; (OCT) durante alguns minutos numa pequena placa de petri rotulados. </li><li> Transferir o tecido em um cryomold marcado contendo o suficiente fresco OCT para cobrir o tecido. Orient a superfície de corte para a parte inferior do cryomold (seção transversal para o músculo vasto lateral e corte sagital para o hemi-cérebro). Evitar a formação de bolhas. </li><li> freeze as amostras colocando a cryomold para poucos minutos em um aplicador coberto de espuma cheio de gelo seco, até que a OCT torna-se branca. Enrole amostras individuais em chapas marcadas, selá-los em um saco plástico, e armazená-los a -80 ° C durante a noite ou mais. </li><li> Use um criostato para cortar seções de amostra com uma espessura de 10 um, e montar as seções sobre os slides. Armazenar as lâminas a -20 ° C, e manter sempre as lâminas ao abrigo da luz, sempre que possível. </li></ol></li><li> preparação da lâmina <ol><li> Retirar as lâminas do congelador e descongelar-los à temperatura ambiente. Cobrir a secção de tecido com uma gota de meio de montagem com DAPI. Coloque uma lamela de tamanho adequado no topo e evitar a formação de bolhas. </li><li> Use unha polonês para selar as bordas da lamela, permitir que unha polonês para secar no escuro à temperatura ambiente, e, em seguida, armazenar as lâminas em um recipiente à prova de luz, a 4 ° C, ou prosseguir com captura de imagem de puncta GFP-LC3. </li></ol></li><li> &lt;strong&gt; Quantificação da GFP - LC3 puncta por microscopia de fluorescência <ol><li> Execute microscopia de epifluorescência, capturando imagens na mesma condição (de exposição e ajustes) para todas as amostras. Para GFP, usar um comprimento de onda de emissão de 525 nm; para DAPI, utilizar 490 nm. Adquirir, pelo menos, dez imagens por exemplo utilizando uma objectiva de 60X para vasto lateral e a região do córtex frontal do cérebro. </li><li> Quantificar o número de pontos lacrimais GFP-LC3 em uma área de tecido de 2,500 uM 2 em cada imagem para análise estatística, cego para os grupos experimentais. Calcule o número médio de 10 imagens de cada amostra, utilizando a função de medição automática de &quot;Contagem de Objetos&quot;. Definições para o músculo vasto lateral são: Limiar L = 10, H = 200; 2X suavizar; 1X limpo, e configurações para o córtex frontal do cérebro são: Limiar L = 11, H = 200; 2X suavizar; 1X limpo. </li></ol></li></ol> 6. Ocidental Análise Blot em Autophagy Markers <ol><li> &lt;strong&gt; processo Tissue <ol><li> Preparar o tampão de lise: Tris-HCl 50; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM; 1% de Triton X-100; inibidor da protease e inibidores de fosfatase (recém-adicionado). </li><li> Remover o tecido de murganhos C57BL / 6 a partir de -80 ° C de armazenamento. Cortar o tecido muscular em pequenos pedaços com uma lâmina de barbear antes com o seguinte processo. Adicionar 800 uL (por hemi-cérebro), ou 500 ul (para vasto lateral) de tampão de lise frio para a amostra. Homogeneizar a amostra a 4 ° C com um homogeneizador a uma velocidade média. </li><li> Totalmente lisar a mistura homogeneizada durante mais 30 minutos a 1 hora a 4 ° C com rotação. </li><li> Girar o homogenato a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C, descartar o sedimento, e recolher o sobrenadante num novo tubo. </li></ol></li><li> análise de autofagia <ol><li> Determinar a concentração de proteína de lisados ​​de tecido, utilizando o kit de ensaio de BCA proteína de acordo com as especificações do fabricante. Normalizar cada amostraà mesma concentração. </li><li> Combinar a amostra com o tampão de amostra 2x Laemmli numa proporção de 1: 1, ferver a 95 ° C durante 5 - 10 min, e prosseguir com a análise de Western blot em autofagia marcadores 13, 14, tal como um anticorpo anti-p62 a p62 (, diluição de 1: 500) e anticorpo anti-LC3 LC3 (, diluição 1: 500). Ferver as amostras imediatamente após a adição do tampão de amostra, como mais tempo de incubação no gelo pode gerar múltiplas bandas degradadas de LC3. </li><li> Quantificar p62 e LC3 bandas por análise de densitometria usando ImageJ, e normalizar o valor para a banda de actina correspondente. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A autofagia é um processo catabólico que fornece energia e reduz a citotoxicidade pela degradação lisossomal de componentes citoplasma ou organelas danificadas. Estudar a autofagia é importante compreender a regulação da homeostase celular e os mecanismos de resposta ao estresse. Novos modelos e metodologias estão a surgir no domínio da investigação 15, para estudar como autofagia deficiente contribui para inúmeros processos patológicos 16, 17....

Autophagy é uma via de degradação evolutivamente conservada, a qual é induzida em resposta a diversas condições de stress tais como hipoxia fome e 1, 2. Durante a autofagia, vesículas de dupla membrana, chamada autofagossomas, incorporar componentes subcelulares desnecessários ou danificados e transportá-los para lisossomos para degradação 3. Autofagia basal é essencial para a função celular e desenvolvimento organismo, e autofagia basal prejudicada está implicada em muitas doenças, incluindo a neurodegeneração, tumorigénese e diabetes 4, 5, 6 do tipo 2. O indutor autofagia fisiológico mais conhecido é fome. No entanto, tem duas limitações principais. Em primeiro lugar, a fome leva um longo período para induzir eficazmente a autofagia em animais, por exemplo, 48 horas de restrição alimentar em ratosna maioria dos órgãos. Em segundo lugar, apenas induz inanição autofagia cérebro, devido a um fornecimento de nutrientes relativamente estável no cérebro. Na verdade, também é difícil de detectar indução autofagia por indutores de pequenas moléculas, como muitas drogas não pode passar a barreira hemato-encefálica. Assim, para analisar melhor a função de activação autofagia na patogênese da doença, descobrimos recentemente que o exercício é um método fisiológico mais potente para induzir autofagia num curto período de tempo de 7, 8, 9. Em comparação com a fome, a autofagia é efetivamente induzido pela esteira correndo tão rápido quanto 30 min. Assim, o exercício é uma abordagem conveniente e potente fisiológico para estudar o mecanismo de autofagia na mediação de benefícios para a saúde e prevenção de doenças. Existem vários marcadores proteicos para a detecção de actividade autofagia, incluindo LC3 e p62. LC3 (associada a microtúbulos de proteína 1A / 1B-luz cHain 3) é uma proteína citosólica (LC3-I formam) que é conjugado com PE (fosfatidiletanolamina) após indução autofagia. LC3 PE-lipidada (forma LC3-II) é recrutado para membranas autophagosomal e pode ser usado para visualizar autofagossomas quando marcado com GFP. A sua translocação para o citosol a partir de estruturas puntiformes de autofagossomas sob microscopia é uma indicação da indução autofagia. p62 é um receptor de carga para substratos autophagy (tais como proteínas de ubiquitinação), e é incorporado autofagossomas bem. Uma vez que a proteína é degradada em lisossomas, juntamente com autofagossomas, os seus níveis podem ser usadas para medir o fluxo de autofagia. Aqui nós mostramos como utilizar esses marcadores para quantificar a autofagia em diferentes tecidos de camundongos induzida por exercício aeróbico, incluindo exercício forçado (esteira) e exercício voluntário (rodas de correr). Os mesmos procedimentos podem também ser aplicados para a medição in vivo de autofagia após o tratamento de outros indutores.

<table><tbody><tr><td>Esteira</td><td>Columbus Instruments</td><td>150-RM Exer 3/6</td><td></td></tr><tr><td>Mouse roda de corrida</td><td>Super Pet</td><td>100079365</td><td>diâmetro 11,4 cm</td></tr><tr><td>Odômetro</td><td>Bell</td><td>DASHBOARD 100</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Nikon</td><td>Modelo: microscópio invertido ECLIPSE</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 1850UV</td><td></td></tr><tr><td></td><td>IKA</td><td>003737001 / Modelo: T10 Basic S1</td><td></td></tr><tr><td>Cloroquina</td><td>CAYMAN CHEMICAL COMPANY</td><td>14194</td><td></td></tr><tr><td>Parafolmaldehye</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P6148</td><td>Equipamento de proteção individual necessário. Este produto pode liberar gás formaldeído, um produto químico conhecido por causar câncer.</td></tr><tr><td>Vector</td><td>Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>p62 anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>610833</td><td></td></tr><tr><td>LC3 anticorpo</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>Laboratories 161-0737</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ativando autophagy pelo exercício aeróbio em ratos

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

A autofagia é uma via de degradação lisossômica essencial para a homeostase, função e diferenciação celular. Sob condições de estresse, a autofagia é induzida e tem como alvo várias cargas, como citosol a granel, organelas danificadas e proteínas mal dobradas, para degradação em lisossomos. As moléculas de nutrientes resultantes são recicladas de volta ao citosol para nova síntese de proteínas e produção de ATP. A regulação positiva da autofagia tem efeitos benéficos contra a patogênese de muitas doenças, e estratégias farmacológicas e fisiológicas para ativar a autofagia têm sido relatadas. O exercício aeróbico é recentemente identificado como um indutor de autofagia eficiente em vários órgãos em camundongos, incluindo músculos, fígado, coração e cérebro. Aqui mostramos procedimentos para induzir autofagia in vivo por meio de exercícios forçados em esteira ou corrida voluntária de rodas. Também demonstramos métodos microscópicos e bioquímicos para analisar quantitativamente os níveis de autofagia em tecidos de camundongos, usando as proteínas marcadoras LC3 e p62 que são transportadas e degradadas em lisossomos junto com autofagossomos.

Este protocolo descreve dois métodos diferentes para induzir a autofagia em tecidos de camundongos por exercício aeróbico: um total de 90 min de exercício forçado em uma esteira multi-lane passou por dois dias de aclimatação; ou duas semanas de exercício voluntário em uma roda de corrida usados ​​por camundongos alojados individualmente. Em cada protocolo de exercício, podemos medir o fluxo autofagia por microscopia de fluorescência e análise western blot em vários órgãos. <p class="...

Autophagy activação é benéfico na prevenção de uma série de doenças. Uma das abordagens fisiológicas para induzir autofagia in vivo é o exercício físico. Aqui nós mostramos como ativar a autofagia pelo exercício aeróbico e medir os níveis de autofagia em camundongos.

Ativando Autophagy pelo exercício aeróbio em ratos

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

O objetivo geral deste experimento é ativar fisiologicamente a autofagia em camundongos por meio de corrida forçada ou voluntária e, em seguida, medir os níveis de autofagia em tecidos específicos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a autofagia, particularmente como a autofagia e sua ativação contribuem para os efeitos benéficos mediados pelo exercício aeróbico. A principal vantagem desta técnica é que o exercício físico representa uma forma rápida de induzir oscilações aeróbicas na autofagia in vivo utilizando camundongos.Para este experimento, inicie com camundongos C57 black six com oito a doze semanas de idade, portadores de um gene transgênico para detectar autofagia induzida por exercício in vivo, conhecido como GFP-LC3. Para obter detalhes sobre o uso de esteiras para camundongos, consulte a seguinte publicação do JoVE. Ajuste o estímulo elétrico da esteira para baixa intensidade.Nas duas primeiras sessões, acostume os camundongos a uma esteira aberta inclinada em dez graus. No primeiro dia, exercite os camundongos por cinco minutos com a esteira funcionando a oito metros por minuto. No segundo dia, corra os camundongos por dez minutos, inicialm

activating-autophagy-by-aerobic-exercise-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método para avaliar a resistência ao exercício em camundongos de laboratório sem o uso de uma grade de choque é demonstrado. Este método é um refinamento humano que pode diminuir os efeitos de confusão do estresse nos parâmetros experimentais.

Avaliação da Murino exercício de resistência sem o uso de um choque grade: uma alternativa para o exercício forçado

A autofagia ativa está associada à regeneração muscular produtiva, que é essencial para a ativação da célula tronco (MuSC). Aqui, fornecemos um protocolo para a detecção in situ de LC3, um marcador de autofagia em MuSCs MyoD-positivos de seções de tecido muscular de ratos controlados e feridos.

Coloração imunofluorescente in situ de autofagia em células estaminais musculares

Treinamento de alta intensidade em hipóxia é um protocolo que tem sido comprovado para induzir as adaptações vasculares potencialmente benéficas em alguns pacientes e melhorar dos atletas repetiram a capacidade de sprint. Aqui, nós testamos a viabilidade de ratos de formação usando protocolo e identificar essas adaptações vasculares usando ex vivo avaliação de função vascular.

Supramaximal intensidade exercício hipóxica e avaliação da função Vascular em ratos

Sessão curta (≤ 10 min) alta treinamento intervalado de intensidade (HIIT) surge como uma alternativa para as modalidades de exercício mais longos, no entanto, as variantes mais curtas raramente são modeladas em estudos com animais. Aqui, descrevemos um 10 min, 3 dias por semana, protocolo HIIT subir escada rolante que melhora o desempenho físico em macho e fêmea com idade de ratos.

Avaliação de esteira em ratos envelhecidos e curta sessão de alta intensidade de treinamento intervalado

Este procedimento descreve um modelo de treinamento de resistência de roda de corrida carregado progressivo traduzível em camundongos. A principal vantagem desse modelo de treinamento resistido é que ele é totalmente voluntário, reduzindo assim o estresse para os animais e a carga sobre o pesquisador.

Um modelo de roda de corrida simples e barato para treinamento de resistência progressiva em camundongos

O presente protocolo descreve a indução de autofagia no corpo adiposo de larvas de Drosophila melanogaster via depleção de nutrientes e analisa as alterações na autofagia utilizando linhagens de moscas transgênicas.

Análise da Autofagia Induzida pela Inanição no Corpo Gorduroso de Larvas de Drosophila melanogaster

Este trabalho apresenta as respostas morfométricas e os resultados do desempenho no treinamento de um protocolo de treinamento intervalado de alta intensidade (HIIT) em um modelo de obesidade induzida por dieta em ratos Sprague-Dawley. O objetivo deste protocolo foi maximizar a intensidade do exercício e determinar as respostas fisiológicas ao HIIT em ratos magros e obesos.

Um modelo crônico de treinamento intervalado de alta intensidade e obesidade induzida por dieta para maximizar o esforço de exercício e induzir mudanças fisiológicas em ratos

Este protocolo fornece um método simples de fazer equipamentos de treinamento estático para camundongos. O dispositivo mantém a contração isométrica muscular dos membros de camundongos para verificar o efeito da intervenção do exercício tradicional no diabetes tipo 2 (DM2) e fornece nova terapia de exercícios para o tratamento clínico do DM2.

Método de treinamento de força estática para camundongos diabéticos tipo 2

Este vídeo demonstra uma abordagem ambiente controlado para estudo de degradação dos tecidos vegetais lignocelulósicas por fungos aeróbicos. A capacidade de controlar fontes de nutrientes e umidade é uma das principais vantagens da ágar-bloco microcosmos, mas a abordagem geralmente produz sucesso misturado. Nós endereço armadilhas fundamental para o rendimento reprodutível, a variabilidade de baixa resultados.

Agar-Microcosmos Bloco de decomposição controlada de Tecidos Vegetais por fungos aeróbicos

Este protocolo permite que pesquisadores se concentraram em exercício e ciências do esporte para determinar a contribuição relativa de três diferentes sistemas de energia com o gasto energético total durante uma grande variedade de exercícios.

Determinar a contribuição dos Sistemas de energia durante o exercício

Aprenda a ativar autofagia por exercício aeróbio em camundongos C57BL/6 usando GFP-LC3. Este método permite medir níveis de autofagia em tecidos específicos e investigar os benefícios fisiológicos do exercício para a saúde celular.

Ativando Autophagy pelo exercício aeróbio em ratos

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