Ativando Autophagy pelo exercício aeróbio em ratos
3 de fevereiro de 2017
Autophagy activação é benéfico na prevenção de uma série de doenças. Uma das abordagens fisiológicas para induzir autofagia in vivo é o exercício físico. Aqui nós mostramos como ativar a autofagia pelo exercício aeróbico e medir os níveis de autofagia em camundongos.
O objetivo geral deste experimento é ativar fisiologicamente a autofagia em camundongos por meio de corrida forçada ou voluntária e, em seguida, medir os níveis de autofagia em tecidos específicos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a autofagia, particularmente como a autofagia e sua ativação contribuem para os efeitos benéficos mediados pelo exercício aeróbico. A principal vantagem desta técnica é que o exercício físico representa uma forma rápida de induzir oscilações aeróbicas na autofagia in vivo utilizando camundongos.
Para este experimento, inicie com camundongos C57 black six com oito a doze semanas de idade, portadores de um gene transgênico para detectar autofagia induzida por exercício in vivo, conhecido como GFP-LC3. Para obter detalhes sobre o uso de esteiras para camundongos, consulte a seguinte publicação do JoVE. Ajuste o estímulo elétrico da esteira para baixa intensidade.
Nas duas primeiras sessões, acostume os camundongos a uma esteira aberta inclinada em dez graus. No primeiro dia, exercite os camundongos por cinco minutos com a esteira funcionando a oito metros por minuto. No segundo dia, corra os camundongos por dez minutos, inicialmente a oito metros por minuto, e após cinco minutos, aumente a velocidade para dez metros por minuto.
No terceiro dia, faça os camundongos correrem por 90 minutos completos. Inicie a esteira a dez metros por minuto e incentive os camundongos a correr com empurrões suaves para evitar choques repetidos nos pés. É fundamental observar e manipular os camundongos para que não recebam choques elétricos em excesso durante a corrida de 90 minutos.
Durante toda a corrida, use os dedos para incentivar os camundongos a permanecerem na esteira. Após 40 minutos, aumente a velocidade em um metro por minuto. Após 50 minutos, aumente a velocidade em um metro por minuto novamente.
Após 60 minutos, aumente a velocidade em mais um metro por minuto. Após 70 minutos, comece a aumentar a velocidade a cada cinco minutos, de modo que os últimos cinco minutos da corrida de 90 minutos sejam a 17 metros por minuto. Após o término do experimento, eutanazie imediatamente os camundongos para coleta de tecidos, se desejado.
Para este teste, aloje os camundongos individualmente. Utilize a mesma linhagem descrita anteriormente. Prepare uma roda para camundongos com diâmetro de 11,4 centímetros equipada com um odômetro de bicicleta acoplado.
Cada rotação deve medir 358 milímetros de deslocamento. Coloque o camundongo na gaiola contendo a roda e permita que ele a utilize livremente durante duas semanas. A cada 24 horas, registre a distância percorrida pelo camundongo a partir do odômetro.
Após as duas semanas, colete os tecidos para análise conforme necessário. Para medir o fluxo autofágico, trate os camundongos com o inibidor de autofagia, cloroquina, durante três dias. Dissolva a cloroquina em PBS a cinco miligramas por mililitro e injete nos camundongos por via intraperitoneal na dose de 50 microgramas por grama.
Administre uma injeção diária aos camundongos por três dias consecutivos e colete os tecidos três horas após a última injeção. Para os camundongos submetidos ao exercício na esteira, inicie a corrida de 90 minutos 90 minutos após a injeção no terceiro dia, de modo que a corrida termine três horas após a injeção. Em seguida, eutanazie os camundongos e colete imediatamente seus tecidos.
Prepare-se para perfundir um animal dentro de 90 minutos após o exercício, preparando o fixador. Carregue uma seringa de 30 mililitros com 15 a 20 mililitros de paraformaldeído a quatro por cento recém-preparado e conecte a seringa a uma agulha cateter de 20 gauge. Fixe a seringa ao bomba de infusão e ajuste-a para um fluxo contínuo de 90 mililitros por hora.
Com o animal sobre uma superfície de trabalho limpa e em posição supina, abra a cavidade torácica através do diafragma para expor o coração. Em seguida, insira a agulha do cateter no ventrículo direito. A seguir, faça uma pequena incisão no fígado para drenar o sangue e acione a bomba.
Injecte o fixador até que o pulmão e o fígado fiquem completamente pálidos. Geralmente, 15 mililitros de fixador serão suficientes. Após a perfusão, remova a agulha e colete os tecidos de interesse.
Para coletar o músculo esquelético, dissecar o vasto lateral. Puxar brevemente a pele da perna para trás a fim de expor os músculos e localizar o quadríceps femoral. Em seguida, dissecar o vasto lateral, que é o músculo externo ligado à porção superior do osso femoral.
Para fixação e desidratação adicionais, coloque os tecidos coletados em paraformaldeído a quatro por cento por 24 horas a quatro graus Celsius. No dia seguinte, transfira os tecidos para PBS com sacarose a 15 por cento e deixe embebendo a quatro graus Celsius durante a noite ou até que tenham sedimentado na solução. Em seguida, transfira os tecidos para PBS com sacarose a 30 por cento a quatro graus Celsius por período noturno ou mais longo.
Mantenha os tecidos no escuro o máximo possível durante esses banhos. Em seguida, coloque os tecidos em um meio de inclusão, como OCT, e corte-os em pedaços menores, se necessário. Depois, deixe-os aclimatar por alguns minutos em uma pequena placa de Petri.
Em seguida, transfira-os para moldes criogênicos com quantidade suficiente de OCT para cobrir. Nos moldes, oriente as superfícies de corte em direção ao fundo e evite a formação de bolhas. Depois, congele as amostras em um refrigerador de isopor coberto, preenchido com gelo seco, até que o OCT fique branco.
Agora, enrole amostras individuais em folhas de alumínio identificadas, feche-as em um saco plástico e armazene-as a menos 80 graus Celsius até que possam ser processadas. Utilizando LC3 marcado com GFP como sistema repórter, a indução da autofagia foi observada em camundongos submetidos ao exercício conforme descrito. Após a estimulação da autofagia, LC3 translocou do citosol para o autofagossomo em estruturas pontuadas.
Os camundongos exercitados apresentaram muitos mais pontos GFP-LC3 tanto no músculo esquelético quanto no córtex cerebral em comparação com os camundongos em condição de repouso. A análise por Western blot utilizando um anticorpo contra LC3 mostrou que o exercício induziu significativamente a geração da LC3-II conjugada com lipídeos, sugerindo um aumento na conversão da LC3-I citosólica em LC3-II. Em seguida, foi medida a degradação do receptor de carga autofágica p62.
Ninety minutos de atividade na esteira causaram uma degradação maior de p62 no músculo esquelético do que na condição de repouso. Esse efeito foi revertido por uma injeção com cloroquina antes do exercício. Como a cloroquina é um inibidor da degradação lisossômica, esses dados indicam que o fenômeno observado se deve a um aumento no fluxo autofágico e não a um bloqueio na degradação do autofagossomo.
Após seu desenvolvimento, esta técnica teve precedentes no campo da autofagia para explorar os efeitos do exercício sobre o mecanismo de degradação do metabolismo e dos comportamentos animais. Ao realizar este procedimento, é importante monitorar os camundongos enquanto estão correndo. Após este procedimento, seguem-se métodos como a microscopia eletrônica.
A microscopia em animais pode ser realizada para responder perguntas adicionais, como o exercício em vias seletivas de autofagia, tais como mitofagia e lipofagia.
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Visão Geral
Este estudo investiga a ativação da autofagia por meio do exercício aeróbico em camundongos. Ao medir os níveis de autofagia em tecidos específicos, a pesquisa tem como objetivo elucidar os benefícios fisiológicos do exercício.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Fisiologia
- Biologia Celular
Contexto
- A autofagia é um processo celular que auxilia na degradação e reciclagem de componentes celulares.
- Sabe-se que o exercício físico induz a autofagia in vivo.
- Compreender a relação entre exercício e autofagia pode fornecer insights sobre a prevenção de doenças.
- Este estudo utiliza camundongos C57 black six com um transgene para detectar autofagia induzida por exercício.
Objetivo do Estudo
- Ativar a autofagia em camundongos por meio de corrida forçada ou voluntária.
- Medir os níveis de autofagia em tecidos específicos após o exercício.
- Investigar como a autofagia contribui para os benefícios do exercício aeróbico.
Métodos Utilizados
- Uso de camundongos C57 black six com oito a doze semanas de idade.
- Implementação de uma esteira para exercício com estímulo elétrico de baixa intensidade.
- Medição dos níveis de autofagia utilizando o transgene GFP-LC3.
- Comparação dos níveis de autofagia antes e após o exercício.
Resultados Principais
- A ativação da autofagia foi induzida com sucesso pelo exercício aeróbico.
- Tecidos específicos apresentaram níveis variados de autofagia após o exercício.
- Os resultados apoiam a hipótese de que o exercício melhora a autofagia.
- Os resultados contribuem para o entendimento dos benefícios fisiológicos do exercício.
Conclusões
- O exercício aeróbico é um método eficaz para ativar a autofagia in vivo.
- Compreender o papel da autofagia pode auxiliar em estratégias de prevenção de doenças.
- São necessárias mais pesquisas para explorar os mecanismos por trás desses efeitos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este estudo demonstra um método fisiológico para ativar a autofagia in vivo utilizando exercício aeróbico em camundongos, proporcionando uma abordagem não farmacológica para modular uma via essencial de degradação celular. A capacidade de quantificar o fluxo autofágico por meio dos marcadores LC3 e p62 permite a desmistificação mecanicista de intervenções relacionadas ao exercício em modelos pré-clínicos. Isso apoia a validação de alvos e o desenvolvimento de ensaios para doenças nas quais a modulação da autofagia é terapeuticamente relevante.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a autofagia como alvo terapêutico por meio de indução fisiológica, em vez de agentes farmacológicos.
- Valor Operacional: Utiliza o sistema repórter GFP-LC3 para visualizar a formação de autofagossomos em tecidos específicos, como músculo esquelético e córtex cerebral.
- Valor Preditivo: Mede a conversão da LC3-lipidada (LC3-II) e a degradação de p62 para avaliar o fluxo autofágico, reforçando a confiança no engajamento do alvo e na modulação da via.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Estabelece protocolos padronizados de exercício em esteira e corrida voluntária em roda para induzir autofagia em múltiplos órgãos.
- Resultado Quantitativo: Utiliza blotagem ocidental e microscopia para medir os níveis de LC3-II e a degradação de p62 como indicadores confiáveis da atividade autofágica.
- Reprodutibilidade: Inclui tratamento com cloroquina para distinguir o aumento do fluxo autofágico da degradação prejudicada, aumentando a especificidade do ensaio.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Relaciona o exercício aeróbico à upregulação da autofagia no fígado, coração, cérebro e músculo — tecidos relevantes para doenças metabólicas, neurodegenerativas e cardiovasculares.
- Continuidade Translacional: Apoia a avaliação pré-clínica de intervenções baseadas no estilo de vida ao fornecer uma leitura quantificável de biomarcador (LC3-II/p62) para a ativação da via.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece se os benefícios observados decorrem do aumento do fluxo autofágico ou do bloqueio da degradação, reduzindo interpretações falsamente positivas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a validação pré-clínica, especialmente para vias envolvendo homeostase celular e resposta ao estresse.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre o papel da autofagia nos benefícios mediados pelo exercício, permitindo a ativação controlada e induzível in vivo.
- Triagem: Prepara sistemas biológicos validados (por exemplo, tecidos de camundongos exercitados) para triagem subsequente de compostos ou fatores genéticos que visem reguladores da autofagia.
- Análises: Gera medidas quantitativas de variáveis dependentes (conversão de LC3-II, degradação de p62) que permitem comparação entre diferentes condições e pontos temporais.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais à continuidade pré-clínica ao alinhar a autofagia induzida pelo exercício com modelos de doenças específicas por tecido.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliar a modulação da autofagia em diversas áreas de doenças, utilizando protocolos padronizados de exercício e detecção.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece uma compreensão mecanicista da regulação da autofagia, reduzindo a ambiguidade em estudos de validação de alvos.
- Valor Operacional: Oferece procedimentos padronizados e reprodutíveis para induzir e medir a autofagia in vivo, utilizando equipamentos acessíveis (esteiras, rodas para corrida).
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir ou interromper projetos, permitindo a avaliação pré-clínica de estratégias moduladoras da autofagia com relevância fisiológica.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de programas direcionados à autofagia por meio de dados pré-clínicos preditivos e baseados em mecanismos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em manejo de animais, fisiologia do exercício e cronometragem da coleta de tecidos para evitar estresse ou lesão confundidores.
- Depende de instrumentação, incluindo esteiras calibradas, rodas de corrida com odômetros e sistemas de perfusão para fixação de tecidos.
- Necessita padronização entre laboratórios quanto à duração e intensidade do exercício e à dosagem de cloroquina, para assegurar medidas comparáveis de fluxo autofágico.
- Devem ser consideradas adaptações, como a variabilidade específica do tecido na resposta autofágica e a necessidade de coleta oportuna após o exercício ou tratamento com inibidor.
- As limitações práticas incluem a variabilidade entre animais na distância percorrida voluntariamente e o desafio técnico de manter intensidade consistente de exercício sem choques excessivos nos pés.
