guiado por imagem, fabricação à base de laser de Redes microfluídicos Vascular derivadas

O objetivo geral deste protocolo é descrever como usar um microscópio confocal equipado com um laser de pulso de femtossegundo para gerar redes microfluídicas biomiméticas derivadas de vasculares tridimensionais incorporadas em hidrogéis de diacrilato de polietilenoglicol usando degradação baseada em laser guiada por imagem. Uma vantagem significativa dessa técnica é a capacidade de gerar redes microfluídicas biomiméticas tridimensionais que recapitulam com precisão a densidade, tortuosidade, faixa de tamanho e arquitetura geral da vasculatura in vivo em construções sintéticas. Essa abordagem de fabricação microfluídica aumentará nossa capacidade de gerar mais in vivo, como construções de engenharia de tecidos, modelos de doenças biomiméticas e dispositivos de ultra alta densidade em um chip.

A demonstração visual desse método é crítica porque a configuração e a implementação adequadas do software do microscópio não são intuitivas, mas são cruciais na formação das redes microfluídicas desejadas. Muitas das etapas preparatórias são abordadas no protocolo de texto, incluindo a geração das máscaras virtuais, a configuração do microscópio e o upload das máscaras virtuais para o software do microscópio. Para fotopolimerizar o hidrogel PEGDA, primeiro prenda um anel de adesivo dupla face a uma placa de Petri de 60 milímetros com um orifício de 20 milímetros cortado na parte inferior.

Em seguida, em uma capela de exaustão, adicione um mililitro de HBS com TEOA a um tubo de centrífuga âmbar de dois mililitros coberto com folha. Em seguida, adicione 10 microlitros de sal dissódico de Eosina Y milimolar ao tubo. Agora, pipete um pequeno volume de NVP em um copo de vidro usando uma pipeta de vidro.

Desse volume, pegue 3,5 microlitros de NVP e transfira para a mistura. Em seguida, adicione 10 miligramas de PEGDA de 3,4 kilodalton a um segundo tubo coberto com papel alumínio. Em seguida, adicione 0,2 mililitros da mistura para fazer uma solução de pré-polímero PEGDA de 5% de peso por volume.

Agora, vortex a solução de pré-polímero até que o PEGDA esteja totalmente dissolvido. Em seguida, pipete 60 microlitros em um molde PDMS sem introduzir bolhas. Agora, centralize uma lamínula de vidro número 1,5 de 40 milímetros acrilada sobre a solução nos espaçadores PDMS.

Em seguida, coloque o conjunto sob uma fonte de luz branca calibrada para fornecer 95 miliwatts. Cure o polímero por três minutos. Em seguida, flua água destilada entre o molde e a lamínula para separar o hidrogel do PDMS e enxágue o hidrogel.

Em seguida, seque cuidadosamente as bordas da lamínula sem absorver a água do hidrogel. Agora, cole a lamínula na placa de Petri preparada. Um pouco de pressão ajuda.

Em seguida, mergulhe o hidrogel em água destilada. Configure o microscópio confocal de varredura a laser conforme descrito no protocolo de texto e comece na configuração de visualização de hidrogel. Em seguida, encaixe o hidrogel e a placa de Petri no inserto do palco e coloque-o no palco.

Em seguida, encha a placa de Petri com pelo menos cinco mililitros de água destilada e abaixe a objetiva de imersão em água logo acima do hidrogel sem entrar em contato com ele. Agora, clique ao vivo para ativar a linha de laser de argônio. Em seguida, concentre-se no hidrogel até que o sinal de Eosina Y possa ser visto na parte superior do hidrogel.

Para ajudar a encontrar o hidrogel, tente aumentar temporariamente a porcentagem de potência ou o tamanho do orifício. Marque as localizações da parte superior e inferior do hidrogel e do fundo do poço. Em seguida, use o joystick para se mover transversalmente e encontrar as bordas do poço.

Na janela de foco, solte o plano de foco 150 mícrons dentro do hidrogel usando a seta para baixo ao lado da caixa de posição Z. O próximo passo é crítico. Zere os locais X e Y na janela do palco, exclua todos os outros locais marcados e marque apenas o local zerado.

Agora, para iniciar o processo de formação de um canal de entrada, primeiro tire uma foto e, em seguida, usando o botão retangular na janela de regiões, delineie a região que será a entrada para a rede vascular. Em seguida, vá para a configuração de formação de canal. Os detalhes são fornecidos no protocolo de texto.

Uma vez lá, em uma janela de pilha Z, clique nos botões centrais na parte superior e acima do deslocamento para centralizar a pilha Z na posição atual. Em seguida, dependendo do tamanho da entrada, defina o número de fatias com um intervalo de um. Agora, verifique se a velocidade está definida como três e se a porcentagem de potência está definida como 100.

Em seguida, salve a configuração e clique no botão iniciar experimento. Para visualizar o hidrogel durante a degradação do canal, aumente o ganho mestre na janela de canais se a região no campo de visão for preta ou diminua o ganho mestre se a região for branca. Após a degradação, certifique-se de que a entrada foi formada voltando à configuração de visualização do hidrogel e clicando em ao vivo.

Primeiro, na janela de regiões, carregue qualquer arquivo ovl da pilha Z de máscaras virtuais e clique no botão de seta para ver os ROIs no campo de visão. Em seguida, clique ao vivo para escanear a configuração de visualização do hidrogel e use o joystick ou a janela do palco para posicionar o hidrogel de forma que a entrada se conecte ao local correto dentro da rede vascular. Em seguida, solte o plano de foco para a primeira posição na macro do microscópio, que está abaixo de 50 mícrons do local Z centralizado anterior, usando o tamanho do passo na janela de foco e clicando na seta para baixo.

Novamente, é fundamental zerar novamente os locais X e Y, excluir todos os outros locais marcados e marcar apenas esse local como o novo ponto zero. Certifique-se de salvar essa nova configuração. Agora, na configuração de formação de canal, selecione apenas as séries temporais e as janelas de branqueamento.

Em seguida, abra a macro e selecione a guia de salvamento. Selecione a receita feita anteriormente e clique em aplicar. Certifique-se de não clicar em armazenar, ou a receita será substituída.

Depois de verificar as configurações, salve a configuração de formação de canal novamente e clique em atualizar na macro do microscópio. Clique em não para substituir a lista de locais atual e, em seguida, clique em iniciar na macro do microscópio para iniciar a receita. Após a conclusão do processo de degradação, use a configuração de visualização de hidrogel em uma potência de laser mais baixa para permitir a visualização de dextrana marcada com FITC, que tem um sinal mais brilhante do que o sinal nativo de Eosina Y do hidrogel.

Antes de introduzir o dextrano marcado com fluorescência, absorva um pouco de água do poço no hidrogel. Em seguida, pipete em 10 microlitros de dextrana marcada com FITC filtrada. O procedimento descrito foi usado para converter um grande volume de imagens microvasculares em uma série de máscaras virtuais para formação de rede microfluídica guiada por imagem.

A rede microfluídica resultante foi comparada com a vasculatura in vivo da qual foi derivada. A degradação do hidrogel baseada em laser guiada por imagem permitiu a fabricação de redes microfluídicas biomiméticas 3D que recapitulam o tamanho, a tortuosidade e a arquitetura complexa da vasculatura in vivo. Cabeças de pressão e bombas de seringa foram usadas para iniciar o fluxo de fluido nessas redes microfluídicas incorporadas.

Grânulos de dextrano de 70 kilodalton marcados com fluorescência e poliestireno de 10 mícrons foram observados movendo-se da esquerda para a direita por um fluxo induzido por carga de pressão. Alternativamente, o fluxo acionado pela bomba de seringa foi iniciado pela fotopolimerização de um hidrogel dentro de um dispositivo microfluídico secundário. Usando o mesmo protocolo descrito aqui, a degradação baseada em laser foi então implementada para fabricar uma rede derivada vascular 2D em um hidrogel alojado para fluxo acionado por bomba de seringa e profusão de 65 kilodalton dextrana.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar um microscópio confocal de varredura a laser equipado com um laser de pulso de femtossegundo para gerar redes microfluídicas biomiméticas usando degradação de hidrogel baseada em laser guiada por imagem. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas a três horas, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os parâmetros do laser, incluindo potência, comprimento de onda e velocidade de varredura, precisam ser ajustados e otimizados com base na formulação do hidrogel que está sendo degradada.

Obrigado e boa sorte com seus experimentos.