Name: guiado por imagem, fabricação à base de laser de Redes microfluídicos Vascular derivadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprenda a fabricar redes microfluídicas biomiméticas tridimensionais em hidrogéis de PEGDA usando degradação guiada por laser. Este método avança a engenharia de tecidos e modelagem de doenças in vitro.

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Os autores agradecem ao Dr. Jeff Caplan e ao Sr. Michael Moore, do Centro de Bioimagem do Instituto de Biotecnologia de Delaware, por seu apoio à microscopia confocal. O acesso ao equipamento de microscopia foi apoiado pelos subsídios de instrumentação compartilhada do National Institutes of Health (NIH) (S10 RR0272773 e S10 OD016361) e pelo Programa Federal de Subsídios para Pesquisa e Desenvolvimento do Estado de Delaware (16A00471). Esta pesquisa foi apoiada por doações do Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA) do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais do NIH (P20GM103446), da American Cancer Society (14-251-07-IRG), da Fundação de Pesquisa da Universidade de Delaware (14A00778), do Instituto de Pesquisa e Prevenção do Câncer do Texas (CPRIT) (RR140013) e da Biblioteca Nacional de Medicina do NIH (4 R00 LM011390-02).

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Os autores não têm nada a divulgar.

Crítica em substituir as funções padrão do software microscópio para permitir o uso de máscaras virtuais para a degradação guiada por imagem, baseada em laser, a macro microscópio deve ser configurado e manipulada com cuidado. Como as interfaces de software microscópio com a macro microscópio pode às vezes ser contra-intuitivo, e muito esforço foi investido em determinar os melhores ajustes em ambos os programas para desenvolver este método. A compreensão geral de laser de digitalização básica uso de microscópio confocal é recomendado, especialmente com o &quot;Stage&quot; e janelas &quot;Focus&quot; para encontrar e corretamente posicionando o hidrogel nos x, y, e z dimensões, antes de tentar a degradação à base de laser. Além disso, a fabricação de um canal de entrada é crítica para o protocolo; espécies fluorescentes suspenso deve ser capaz de entrar nos sistemas de microfluido para a imagiologia bem sucedida e caracterização de rede. É importante notar que este protocolo se aplica a uma específica Laser-digitalização microscópio confocal configurado com um laser pulsado femtosecond específico, executando versões específicas do software microscópio e a macro microscópio (ver detalhes na Lista de materiais específicos / Equipamentos). Nós descobrimos que as versões mais recentes do macro microscópio falta de controle e funcionalidade necessária necessária para controle do laser guiada por imagem. Enquanto outras plataformas de microscópio e fontes de laser pulsado pode ser usado, este protocolo aplica-se especificamente a este sistema e terá a modificação de acordo com a plataforma, fonte de laser e software implementado. Os princípios subjacentes a todo este protocolo ainda se aplicam, no entanto. Uma modificação potencial para este protocolo envolve a alteração da composição de hidrogel. Aqui, utilizou-se 5% em peso, 3,4 hidrogéis PEGDA kDa, mas a degradação à base de laser (para fins de geração de lado da rede de microfluidos) foi implementada para degradar ambos os hidrogeles sintéticos e naturais, incluindo fibrina PEGuiladoogï¿½io 21,22, proteína de seda hidrogéis 23, e colágeno 24. Ajuste da potência do laser, velocidade de digitalização, espaçamento entre Z-fatias, eo número de repetições ajudarão a determinar os parâmetros ótimos para fabricar redes microfluídicos em outras formulações de hidrogel. Uma limitação de corrente da técnica é o volume total do hidrogel que pode ser degradado em uma quantidade de tempo possível. Para criar vazios abertos ou recursos microfluídicos dentro do hidrogel, o laser tempo de permanência deve ser igual ou superior a 8,96 uS / pixel (ou uma velocidade de digitalização de laser de 0,021 mm / ms) ao usar uma fluência do laser de 37,7 nJ / mm 2. Com estas definições, leva-se 1,4 h a degradar vasos dentro de um volume de 0,014 milímetros 3 (como visto na Figura 1). Usando um tempo de permanência de laser de 4,48 mS / pixel ou abaixo, a energia entregue não é suficiente para a completa degradação da formulação de hidrogel aqui utilizado. A implementação de um hidrogel diferentecomposição poderia superar essa limitação. O uso de géis fotolabilidade que contêm componentes sensíveis à luz 34-36 ou hidrogéis que têm grande multifotônica secções transversais 21-24 são boas opções que permitam a utilização de menos energia e resultaria em degradação mais rápida. No que diz respeito às limitações dimensionais, características têm sido fabricados até 1,5 mm de profundidade no hidrogel 7. O realizáveis profundidade é uma função da distância de trabalho do objectivo e pode ser aumentada usando objetivos distância de trabalho ultra-longos otimizados para imagiologia in vivo. O canal de medida menor 7 criado usando um 20X (NA1.0) objectiva de imersão em água tinha uma largura de 3,3 mm e profundidade de 8,9 mm, o que está a par com o tamanho das menores canais gerados na Figura 1. Enquanto outros laboratórios têm usado objetivos NA inferiores 21,23,24, prevemos que as redes microfluídicos com pequenos recursos podem ser gerados usando altaobjetivos er NA à custa de uma distância de trabalho reduzida. Em última análise, no entanto, a resolução da técnica é uma função da função de dispersão do feixe de laser focado, as propriedades de rastreio por laser, a quantidade de energia fornecida pelo laser, e as propriedades de absorção de laser do material a ser degradada. Além disso, as propriedades de laser (velocidade, fluência, espaçamento entre máscaras virtuais e número de repetições) deve ser otimizado com base nas propriedades de hidrogel (densidade de ligações cruzadas, macrómero / peso molecular de monómeros, por cento em peso e tipo de hidrogel: à base de proteína sintética vs. ), uma vez que estes serão inerentemente alterar as interacções com o laser e, assim, a resolução final do processo. À medida que a energia fornecida é também influenciada pelo objectivo utilizado, a optimização adicional é necessário quando se alterna entre objectivos. No que diz respeito aos custos envolvidos, o acesso a um microscópio com um laser pulsado é necessário, e enquanto muitos objec diferentetivos podem ser utilizados, aqueles com uma elevada NA e longa distância de trabalho (por imagiologia in vivo) pode ser caro. Para além do protocolo detalhado aqui, redes de microfluidos geradas utilizando esta técnica também pode ser funcionalizada com péptidos de células-adesivo pós-fabricação de canal para induzir a adesão de células endoteliais e formação de lúmen 7. Além disso, a incorporação de sequências de péptidos de células-degradável no material a granel 9 antes para canalizar degradação poderia permitir o estudo de migração celular para dentro e através do hidrogel. Para fluidização contínua da rede de microfluidos dentro do hidrogel, os hidrogéis são polimerizáveis em dispositivos fluídicos ou caixas maiores, como demonstrado nas Figuras 2 e 3 7. A geração de redes vasculares via vasculogenic ou angiogênico auto-montagem 8-12 fornece uma abordagem simples para induzir vascularization ao longo de um volume relativamente grande de hidrogel. Embora esta abordagem resulta em redes fluídicos perfusable, é difícil de controlar diretamente o tamanho, tortuosidade, densidade e arquitetura de rede geral. Devido a esta limitação, o perfil de escoamento e as taxas de cisalhamento na vasculatura pode ser diferente entre as experiências. Alternativamente, técnicas de microfabricação 13-16 permitir controle direto sobre arquitetura de rede, mas são muitas vezes limitadas pela sua incapacidade para gerar canais pequenos, do tamanho de capilares ou a fabricação de redes densas que imitam na arquitetura vivo vascular. Embora a técnica degradação hidrogel à base de laser descrito aqui foi recentemente reaproveitado para a geração de microfluidos, simultaneamente supera tanto o controle arquitetônico e limitações à base de tamanho dos métodos de microfabricação existentes, permitindo a criação de 3D redes microfluídicos biomiméticos que recapitulam a densidade, tortuosidade, faixa de tamanho, e architectur gerale da vascularização in vivo. Além disso, várias redes de fluidos pode ser gerado num hidrogel, permitindo o estudo do transporte inter-rede 7. Para aplicações de engenharia de tecidos que se esforçam para replicar de forma mais estreita em processos de transporte in vivo, in vitro, as redes microfluídicos incorporado-hidrogel altamente resolvidas aqui descritos são adequados. Prevemos que este protocolo será útil no desenvolvimento de construções de tecido que o transporte de forma mais precisa imitar in vivo para uso como dispositivos de detecção de drogas e em modelos de doenças in vitro.

O sistema vascular, que consiste em ambos linfático e cardiovasculature, formas redes altamente densos que são essenciais para o transporte de nutrientes e de oxigénio e para a remoção de resíduos metabólicos. Por conseguinte, as células residentes nos tecidos vascularizados são nunca mais do que 50-100 uM de distância a partir de um recipiente 1. A capacidade de reproduzir in vivo arquitetura vascular in vitro é crítica para modelar com precisão in vivo de processos de transporte que utilizam construções de engenharia. Com uma movimentação recente para desenvolver dispositivos de órgãos-on-a-chip 2 para medicamentos de alto rendimento de triagem 3,4 e modelagem de doença 5,6, métodos para criar redes microfluídicos que recapitulam o transporte in vivo -como em hidrogéis sintéticos ou naturais são desenho interesse significativo. Para melhorar a biomimética de microtissues utilizados nestes dispositivos, desenvolvemos, um método de degradação do hidrogel à base de laser guiada por imagem que utiliza tridimensional ocapilhas l de imagem (3D) da vasculatura nativa como modelos para gerar redes microfluídicos derivados do vasculares embutidos em PEGDA hidrogéis 7. Este protocolo descreve o uso de um microscópio confocal de varrimento laser disponível comercialmente equipada com um laser pulsado femtosegundo para fabricar, redes de microfluidos biomiméticos derivada-vasculares em hidrogeles através da degradação da PEGDA guiada por imagem, à base de laser. As abordagens atuais para fluidificar hidrogéis incluem a indução de vasculogenic 8-10 ou técnicas de automontagem 10-12 células endoteliais e microfabricação angiogénicos para criar canais pré-definidos para endotelização 13-16. Embora as redes de auto-montados recapitular a densidade e arquitetura complexa de microvasculatura, eles são muitas vezes mais permeável do que in vivo redes 11,17,18, o que pode ser problemático em transporte de modelagem para aplicações de rastreio de drogas. redes auto-organizadas consistem em physiologcamente relevante, vasos capilares porte-, mas eles podem ser difíceis de integrar com o fluxo de fluido em massa devido às limitações na geração de navios de porte arteríolas maiores. Como não há controle direto sobre o conjunto dessas redes, a arquitetura final pode variar de amostra para amostra, o que torna difícil para produzir repetidamente redes com as mesmas propriedades de fluxo e transporte de fluidos. Para gerar 3D, redes microfluídicos embebidos em hidrogel com geometria repetível e arquitetura bem definida, uma série de técnicas de microfabricação foram desenvolvidas, incluindo a montagem modular 13, a impressão 3D de materiais sacrificiais 16, montagem e gravação direta 14 e impressão omnidirecional 15. Aplicando estes métodos, arquitetura microfluídico, e propriedades de fluxo e de transporte, portanto, fluidos, podem ser repetidamente fabricados através de muitas construções. Uma das principais limitações destas abordagens, no entanto, é a incapacidade de criar MICROFluidic redes capilares com características de tamanho, 4-a 10 uM 19. A maioria das técnicas de microfabricação são muitas vezes limitados a funcionalidades variando de 150 a 650 mícrons de diâmetro 13,16. Algumas técnicas existentes são capazes de gerar redes hierárquicos com canais em toda uma gama de diâmetros de largura e 10 a 300 um para a montagem e escrita directa 14, e 18 a 600 um para a impressão omnidireccional 15, mas eles são limitados na sua capacidade para gerar redes densas ou para produzir várias redes microfluídicos nas proximidades dentro de uma única construção 7. Para superar algumas destas limitações, desenvolvemos, uma técnica de degradação hidrogel à base de laser guiada por imagem que permite a fabricação repetitiva de biomimética, redes microfluídicos hierárquicas que recapitulam a arquitetura da microcirculação in vivo. Para isso, a 790 nm, 140 femtossegundos (fs) laser pulsado operando a 80 MHz é digitalizada-raster in desejado locais 3D dentro de um hidrogel, tal como definido por imagens da vasculatura in vivo. Especula-se que o processo de degradação opera através do colapso induzido por laser óptico de água, a formação de plasma resultante, o subsequente expansão termoelástica rápida de água, e a degradação do local do hidrogel como a água se expande 20. Este mecanismo varia ligeiramente de degradação à base de laser de hidrogeles à base de proteína de 21-24. Ao contrário PEGDA, que tem uma secção transversal multifotônica baixo, proteínas, muitas vezes têm uma grande secção transversal multifotônica e, portanto, são degradados através de uma multifotônica induzida por absorção química ruptura 23. Para gerar redes de microfluidos guiada por imagem, o obturador de laser é controlado por máscaras virtuais derivado de imagem, que consistem de um mosaico de regiões de interesse 9 que definem a arquitectura de microfluidos. Usando essa abordagem, nós demonstramos a capacidade de fabricar MICROFLUID biomimético derivada-vascular 3Dredes ic, que recapitulam a arquitectura densa e tortuoso da vasculatura, in vivo, a fim de controlar localmente a porosidade de hidrogéis, alterando a quantidade de energia fornecida durante a degradação. Nós também foram capazes de gerar duas redes microfluídicos independentes que se entrelaçam na proximidade (15 mm), mas nunca se conectam diretamente 7. Nós também demonstraram a capacidade de endothelialize microcanais laser de pós degradada através de degradação funcionalização com a sequência do péptido de ligação de integrina, Arginina-Glicina-Ácido aspártico-serina (RGDS), para promover a adesão de células endoteliais e formação de lúmen 7. Com este protocolo, a geração de redes complexas microfluídicos em hidrogéis PEGDA é possível através da degradação guiada por imagem, baseada em laser usando um microscópio disponível comercialmente acessível em muitos campi universitários. À medida que o processo de degradação é guiado por virtuais, máscaras digitais, esta Fabricação técnica é favorável para a criação de redes de microfluidos criativo, permitindo o seu uso numa grande variedade de aplicações. Prevemos que o método descrito aqui será mais vantajosa em projetar dispositivos zações e humanos-on-a-chip biomiméticos capazes de replicar processos de transporte biológicas importantes na modelagem de transporte da droga 2. Esta técnica de fabricação podem também ser de interesse para a geração de modelos de doenças in vitro, incluindo metástases do cancro 5,6 e modelos barreira hemato-encefálica 25. Como a degradação hidrogel à base de laser tenha sido previamente utilizado para criar faixas para a orientação de crescimento neuronal 21-23, a extensão guiada por imagem desta técnica poderia ser útil em estratégias avançadas de engenharia de tecidos para posicionar células em arranjos espaciais em 3D definidos pelo usuário.

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2015a</td><td>denominado "software de programação" no protocolo; consulte a fonte 9 para obter detalhes sobre o algoritmo</td></tr><tr><td>FIJI (Fiji é Just Image J)</td><td>NIH</td><td>versão 1.51a</td><td>denominado "software de processamento de imagem" no protocolo</td></tr><tr><td>LSM 780 Microscópio Confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>denominado "microscópio confocal de varredura a laser" no protocolo; para hidrogel à base de laser degradação</td></tr><tr><td>Zen 2010B SP1</td><td>Zeiss</td><td>versão 6.0</td><td>denominada "software de microscópio" no protocolo; para uso na Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Multitime, 2010</td><td>Zeiss</td><td>v16.0</td><td>denominada "macro de microscópio" no protocolo; para uso na Zeiss LSM-780 (em conjunto com Zen)</td></tr><tr><td>Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm</td><td>Zeiss</td><td>421452-9880-000</td><td>para uso na Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Chameleon Vision II Modelocked Ti:S</td><td>Laser Coerente</td><td></td><td>denominado "laser pulsado de alta potência" no protocolo</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamina (TEOA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td>inflamável; irritante para a pele e os olhos; trabalhe com em um exaustor</td></tr><tr><td>Sódio Copos de</td> Filtração a Vácuo de Hidróxido <td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>150 mL com 0.2 &micro; m Membrana PES</td><td>VWR</td><td>10040-460</td><td></td></tr><tr><td>PEGDA</td><td>sintetizada internamente</td><td></td><td>consulte a fonte 33 para métodos de síntese; armazenar sob argônio</td></tr><tr><td>Eosina Y sal dissódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6003-25G</td><td></td></tr><tr><td>1-vinil-2-pirrolidinona (NVP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V3409-5G</td><td>armazenar sob argônio; cancerígeno; trabalhar com em um exaustor</td></tr><tr><td>Fita Dupla Face 3M, 9500PC, 6.0 mil</td><td>Thomas Goldkamp</td><td>37728</td><td></td></tr><tr><td>Flexmark 90 PFW Liner</td><td>FLEXcon</td><td>FLX000620</td><td>suporte para manuseio de fita dupla face</td></tr><tr><td>Modelo SC Plotter (cortador de adesivo)</td><td>USCutter</td><td>SC631E</td><td>usado para cortar adesivo em formas de anel para conectar lamínulas a placas</td></tr> de <tr><td>Petri 60 mm com furo de 20 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P60-20-F-NON</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador de Alta Intensidade (fonte de luz branca)</td> <td>Medidor de energia Fiber-Lite</td><td>4715MS-12WB10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Newport</td><td>1916-R</td><td>detecta potência a 524 nm ao usar fonte de luz branca</td></tr><tr><td>Detector de varinha de perfil fino</td><td>Newport</td><td>918D-ST</td><td>para uso com medidor de energia</td></tr><tr><td>Kit de elastômero de silicone Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>usado para fazer moldes PDMS; consulte a fonte 7 para métodos</td></tr><tr><td>TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round</td><td>sintetizado internamente</td><td></td><td>consulte a fonte 7 para métodos</td></tr><tr><td>Dextran, Fluoresceína, 2.000.000 MW, Aniônico, Lisina Fixável</td><td>Life Technologies</td><td>D7137</td><td>pode usar dextrans marcado alternativo; 2.000 kDa não se difunde facilmente em uma seringa de 5% de 3,4 kDa PEGDA hidrogel</td></tr><tr><td>de 1 mL, Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Anel Acrodisc, 0.2 &micro; m Supor Membrana, Nuvem de Baixa Ligação a Proteínas</td><td></td><td>PN 4602</td><td></td></tr><tr><td>sticky-Slide VI0.4&nbsp; </td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td>dispositivos microfluídicos que podem ser usados para abrigar hidrogéis</td></tr></tbody></table>

guiado por imagem, fabricação à base de laser de redes microfluídicos vascular derivadas

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Este protocolo detalhado descreve a aplicação de guiada por imagem, a degradação do hidrogel à base de laser para a fabricação de redes de microfluidos derivada-vasculares incorporados em hidrogéis PEGDA. Aqui, descrevemos a criação de máscaras virtuais que permitem o controle do laser guiada por imagem; a fotopolimerização de um hidrogel PEGDA micromolded, adequadas ao fabrico de rede microfluídicos e fluxo orientado a cabeça de pressão; a instalação e utilização de um laser scanning microscópio confocal comercialmente disponível emparelhado com um pulsada Ti femtosecond: Laser S para induzir a degradação de hidrogel; ea imagem das redes microfluídicos fabricados com espécies fluorescentes e microscopia confocal. Grande parte do protocolo está focado na configuração adequada e implementação do software microscópio e microscópio macro, já que esses são passos fundamentais para usando um microscópio comercial para fins de fabricação microfluídicos que contêm uma série de complexidades. O componente guiada por imagem desta technique permite a implementação de pilhas de imagens 3D ou modelos 3D gerados pelo usuário, permitindo assim para o projeto microfluídico criativo e para a fabricação de sistemas microfluídicos complexos de praticamente qualquer configuração. Com um impacto esperado na engenharia de tecidos, os métodos descritos neste protocolo pode ajudar na fabricação de construções microtissue biomiméticos avançados para dispositivos zações e humanos-on-a-chip. Imitando a arquitectura complexa, tortuosidade, o tamanho e densidade dos vasos in vivo, os processos biológicos essenciais de transporte pode ser replicado nestas construções, levando a modelação mais precisa farmacocinética in vitro de droga e doença.

Para demonstrar a implementação do guiada por imagem, a degradação do hidrogel à base de laser para gerar uma rede de microfluidos 3D, vascular derivada, utilizamos uma pilha de 3D da vasculatura cerebral do rato, que foi adquirida através de microscopia de varredura de lâmina de faca (KESM) 26, 27 . Uma região 3D seleccionado do conjunto de dados maior microvascular foi convertida em uma série de máscaras virtuais para a formação da rede de microfluidos guiada por imagem, como descrito acima. Após a fabricação, a rede resultante de microfluidos foi perfundido com uma solução de FITC, 2000 kDa dextrano e fotografada através de microscopia confocal. A pilha de imagens da vasculatura in vivo que definida a arquitectura da rede (Figura 1A e C) e a rede de microfluidos fabricada (Figura 1B e D) foram usadas para gerar Z-saliências (Figura 1A e B) e de desenhos em 3D (Figura 1C e D </strong&gt;). A comparação das imagens demonstra que, a degradação do hidrogel à base de laser guiada por imagem permite a fabricação de 3D redes microfluídicos biomiméticos que recapitulam o tamanho, tortuosidade e arquitetura complexa da vasculatura in vivo. A técnica pode ser objecto de fabricação de redes que contêm uma vasta gama de diâmetros; dentro Figura 1, os canais que vão 3,3-28,8 um de diâmetro foram gerados. Note-se que a estrutura rectangular maior na parte superior esquerda da Figura 1B e no canto esquerdo da Figura 1D é o canal de entrada para introduzir o fluxo para a rede. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig1.jpg" /> Figura 1: Vascular-Derived Microfluidic rede. Uma série de máscaras virtuais, derivada a partir de uma pilha de imagens da vasculatura cerebral do rato (A e C), foram usadas para fabricate uma rede microfluídico biomimético 3D incorporado em um hidrogel PEGDA (B e D) via degradação guiada por imagem, baseada em laser. A rede de microfluidos foi perfundido com dextrano 2000 kDa marcado com FITC e visualizados por meio de microscopia confocal. Z-projeções (A e B) e desenhos em 3D (C e D) das duas redes de demonstrar a capacidade de gerar redes microfluídicos que recapitulam a densidade, organização e estrutura global da vasculatura in vivo. A seta (D) marca a entrada rectangular criado para introduzir o dextrano. A barra de escala representa 50 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Nós implementamos dois métodos, cabeças de pressão e bombas de seringa, para iniciar fluido fbaixo nestas redes microfluídicos embutidos. Por exemplo, um canal rectangular 30 por 30 mm foi fabricado a conectar dois poços num hidrogel PEGDA micromolded (Figura 2A), com o fluxo de fluido conduzido através de uma cabeça de pressão 7. Gerado no bem da esquerda, a cabeça de pressão induzida fluxo através do microcanal e para o bem do lado direito. Na Figura 2A, uma frente inicial de tetramethylrhodamine (TRITC) marcado com, 70 kDa dextrano foi observado movimento através do canal usando microscopia de lapso de tempo. Mais tarde, na Figura 2B, uma esfera de poliestireno fluorescentes de 10 mícrons de diâmetro fluiu do poço à esquerda, através do canal, para o bem do lado direito. Com a duração de fluxo controlado pelo volume do fluido presente no poço micromolded na entrada, e a taxa de fluxo controlada pelo gradiente hidrostática gerada entre a entrada e a saída assim, o fluxo orientado a cabeça de pressão em hidrogéis micromolded fornece um método simples para o fluxo emdução, sem a necessidade de uma caixa externa ou uma bomba de seringa. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig2.jpg" /> Figura 2: Pressão do fluxo orientado a cabeça em um Micromolded PEGDA hidrogel. PEGDA foi micromolded para formar um hidrogel contendo duas cavidades conectadas por um microcanal incorporado. Uma cabeça de pressão foi gerado no poço para a esquerda para iniciar o fluxo de TRITC-rotulado, 70 kDa dextrano (A1-A3) e uma esfera de poliestireno de 10 uM (B1-B3) através de um 30 por 30 um canal rectangular a partir de um poço para o de outros. A barra de escala representa 50 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Alternativamente, para gerar fluxo de fluido constante dentro de redes microfluídicos, accionadas por bomba de seringa fbaixo pode ser iniciada por photopolymerizing do hidrogel dentro de um dispositivo de microfluidos secundário com orifícios de entrada e de saída para a interface bomba de seringa. Na Figura 3A, um dispositivo de microfluidos de pré-fabricada comercialmente disponível é mostrado com uma banda de 1 mm de hidrogel fotopolimerizado em toda a largura do dispositivo 7. degradação à base de laser foi aplicado para fabricar canais de microfluidos e redes em hidrogéis alojados utilizando o mesmo protocolo que se descreveu aqui para autoportante hidrogéis. Fluxo gerado por uma bomba de seringa pode ser visto na Figura 3B, em que um canal de diâmetro cilíndrico 20 mícrons foi fabricado num hidrogel alojado num dispositivo de microfluidos. Neste canal de 20 um de diâmetro, 2 mícrons esferas de poliestireno fluorescentes individuais são facilmente resolvida sem fluxo de fluido (Figura 3B1), ao passo que quando a / s Caudal de 5 uL é aplicada, as esferas se movem através do campo de visão, como evidenciado por estrias (Figura 3B2 &lt;/ Strong&gt;). Esta mesma abordagem foi utilizada para induzir o fluxo através de uma rede 2D, derivada-vascular para monitorar o fluxo de TRITC-rotulado, dextrano 65 kDa através da rede e a difusão para dentro do hidrogel circundante (Figura 3C). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig3.jpg" /> Figura 3: Fluxo de Seringa accionadas por bomba em PEGDA hidrogéis Polymerized em caixas microfluídicos. Um dispositivo disponível comercialmente pré-fabricada de microfluidos (A) com um microcanal 17 x 3,8 x 0,53 milímetros (x, y, z) aloja um fotopolimerizável 1 x 3,8 x 0,53 milímetros (x, y, z) PEGDA hidrogel, indicado pela flecha Negra. Um canal cilíndrico de diâmetro de 20 um foi degradada através do hidrogel, e esferas de poliestireno de 2 ^ m foram bombeados através do dispositivo (B). As esferas são claramente resolvidos sem fluxo de fluido (B1), mas eles aparecem como estrias a um caudal de 5 ul / s(B2). Noutra hidrogel alojado, uma rede vascular 2D-derivado foi fabricado e TRITC-rotulado, dextrano 65 kDa foi bombeado através da rede (C). microscopia de lapso de tempo foi utilizado para monitorizar o dextrano fluorescente, uma vez que os canais cheios e se difunde para o hidrogel circundantes. Setas brancas em (B) e (C) indicam a direcção do fluxo de fluido. A barra de calibração em (C) indica a intensidade do dextrano fluorescente. As barras de escala representam 20 jiM em (B1) e (B2) e 50 uM de (C). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve a implementação da degradação de hidrogel baseada em laser guiada por imagem para fabricar redes microfluídicas biomiméticas derivadas de vasculares incorporadas em hidrogéis de poli(etilenoglicol) diacrilato (PEGDA). Esses sistemas microfluídicos biomiméticos podem ser úteis para aplicações de engenharia de tecidos, geração de modelos de doenças in vitro e fabricação de dispositivos avançados "on-a-chip".

guiado por imagem, fabricação à base de laser de Redes microfluídicos Vascular derivadas

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

O objetivo geral deste protocolo é descrever como utilizar um microscópio confocal equipado com um laser de pulso femtosegundo para gerar redes microfluídicas biomiméticas tridimensionais derivadas de vasculatura, embutidas em hidrogéis de diacrilato de polietileno, por meio de degradação guiada por imagem baseada em laser. Uma vantagem significativa desta técnica é a capacidade de gerar redes microfluídicas biomiméticas tridimensionais que recapitulam com precisão a densidade, tortuosidade, faixa de tamanho e arquitetura geral da vasculatura in vivo em estruturas sintéticas. Esta abordagem de fabricação microfluídica irá aprimorar nossa capacidade de gerar construtos bioengenheirados mais semelhantes ao in vivo, modelos biomiméticos de doenças e dispositivos em chip com densidade ultraelevada.A demonstração visual deste método é essencial porque a configuração e implementação corretas do software do microscópio não são intuitivas, mas são cruciais para formar as redes microfluídicas desejadas. Muitas das etapas preparatórias estão descritas no protocolo textual, incluindo a geração das máscaras virtuais, a configuração do microscópio e o carregamento das máscaras virtuais no software do microscópio. Para fotopolimerizar o hidrogel PEGDA, primeiro fixe um anel de adesivo dupla face em uma placa de Petri de 60 milímetros que tenha um orifício de 20 milímetros recortado na base.Em seguida, em uma cabine de exaustão, adicione um mililitro de HBS com TEOA a um tubo centrífugo âmbar de dois mililitros coberto com papel alumínio. Então, adicione 10 microlitros de sal de eosina Y dissódica (1 mM) ao tubo. Agora, pipete um pequeno volume de NVP em um béquer de vidro utilizando uma pipeta de vidro.Desse volume, retire 3,5 microlitros de NVP e transfira para a mistura. Em seguida, adicione 10 miligramas de PEGDA de 3,4 kilodaltons a um segundo tubo revestido com folha de alumínio. Depois, adicione 0,2 mililitros da mistura para obter uma solução pré-polimérica de PEGDA a 5% peso por volume.Agora, agite a solução de prepolymer por vortex até que o PEGDA esteja completamente dissolvido. Em seguida, pipete 60 microlitros sobre um molde de PDMS sem introduzir bolhas. Agora, posicione no centro uma lamínula de vidro acrilada nº 1,5 de 40 milímetros sobre a solução nos espaçadores de PDMS.Em seguida, posicione a montagem sob uma fonte de luz branca calibrada para fornecer 95 miliwatts. Polimerize o polímero por três minutos. A seguir, faça fluir água destilada entre o molde e a lamínula para separar o hidrogel do PDMS e remover o hidrogel por lavagem.Em seguida, seque cuidadosamente as bordas da lamínula sem absorver água do hidrogel. Agora, adicione a lamínula ao disco de petri preparado. Uma leve pressão ajuda.Em seguida, mergulhe o hidrogel em água destilada. Configure o microscópio confocal a laser conforme descrito no protocolo textual e inicie na configuração de visualização do hidrogel. Em seguida, adapte o hidrogel e a placa de Petri ao suporte do estágio e coloque-o sobre o estágio.Em seguida, preencha a placa de Petri com pelo menos cinco mililitros de água destilada e posicione o objetivo de imersão em água logo acima do hidrogel, sem tocá-lo. Agora, clique em "live" para ativar o laser de argônio. Em seguida, foque no hidrogel até que o sinal de Eosina Y possa ser visto no lado superior do hidrogel.Para ajudar a localizar o hidrogel, tente aumentar temporariamente a porcentagem de potência ou o tamanho do pinhole. Marque as posições do topo e da base do hidrogel, bem como da base do poço. Em seguida, use o joystick para mover transversalmente e localizar as bordas do poço.No campo de foco, abaixe o plano de foco em 150 mícrons dentro do hidrogel usando a seta para baixo ao lado da caixa de posição Z. O próximo passo é crítico. Zere a localização em X e Y na janela da platina, depois exclua todas as outras localizações marcadas e marque apenas a localização zerada.Agora, para iniciar o processo de formação de um canal de entrada, primeiro capture uma imagem e, em seguida, utilizando o botão de retângulo na janela de regiões, delimite a região que será a entrada da rede vascular. Depois, passe para a configuração da formação do canal. Os detalhes são fornecidos no protocolo textual.Uma vez lá, em uma janela de pilha Z, clique nos botões centrais na parte superior e acima do deslocamento para centralizar a pilha Z na posição atual. Em seguida, dependendo do tamanho necessário para a entrada, defina o número de cortes com um intervalo de um. Agora, verifique se a velocidade está definida em três e se a porcentagem de potência está ajustada em 100.Em seguida, prossiga com a gravação da configuração e clique no botão iniciar experimento. Para visualizar o hidrogel durante a degradação do canal, aumente o ganho mestre na janela de canais se a região no campo de visão estiver preta, ou diminua o ganho mestre se a região estiver branca. Após a degradação, certifique-se de que a entrada foi formada retornando à configuração de visualização do hidrogel e clicando em ao vivo.Primeiro, na janela de regiões, carregue qualquer arquivo ovl da pilha Z de máscaras virtuais e clique no botão de seta para visualizar as ROI no campo de visão. Em seguida, clique em "live" para escanear a configuração de visualização do hidrogel e use o joystick ou a janela do estágio para posicionar o hidrogel de modo que a entrada se conecte ao local correto dentro da rede vascular. A seguir, abaixe o plano de foco para a primeira posição no macroscópio, que está 50 micrômetros abaixo da localização Z centralizada anterior, utilizando o tamanho de passo na janela de foco e clicando na seta para baixo.Novamente, é fundamental rezerar as posições X e Y, excluir todas as demais posições marcadas e marcar apenas esta posição como o novo ponto zero. Certifique-se de salvar esta nova configuração. Agora, na configuração de formação de canais, selecione apenas as janelas de série temporal e de branqueamento.Em seguida, abra a macro e selecione a guia de salvamento. Selecione a receita previamente criada e clique em aplicar. Certifique-se de não clicar em armazenar, caso contrário a receita será sobrescrita.Após verificar as configurações, salve novamente a configuração de formação de canais e, em seguida, clique em atualizar na macroscopia do microscópio. Clique em não para não sobrescrever a lista de localizações atual e, em seguida, clique em iniciar na macroscopia do microscópio para começar a receita. Após a conclusão do processo de degradação, utilize a configuração de visualização do hidrogel com uma potência de laser mais baixa para permitir a visualização do dextrano marcado com FITC, que possui um sinal mais intenso do que o sinal nativo de Eosina Y do hidrogel.Antes de introduzir a dextrana marcada com fluoróforo, remova por capilaridade alguma água do poço no hidrogel. Em seguida, pipete 10 microlitros de dextrana marcada com FITC filtrada. O procedimento descrito foi utilizado para converter um grande volume de imagens microvasculares em uma série de máscaras virtuais para a formação de redes microfluídicas guiadas por imagem.A rede microfluídica resultante foi comparada com a vasculatura in vivo da qual foi derivada. A degradação do hidrogel guiada por imagem com laser permitiu a fabricação de redes microfluídicas biomiméticas tridimensionais que recapitulam o tamanho, a tortuosidade e a arquitetura complexa da vasculatura in vivo. Cabeças de pressão e bombas de seringa foram ambos utilizados para iniciar o fluxo de fluido nessas redes microfluídicas embutidas.Dextrano fluorescente de 70 quilodaltons e microesferas de poliestireno de 10 mícrons foram observados se movendo da esquerda para a direita por meio de um fluxo induzido por pressão hidrostática. Alternativamente, um fluxo impulsionado por bomba de seringa foi iniciado pela fotopolimerização de um hidrogel dentro de um segundo dispositivo microfluídico. Utilizando o mesmo protocolo descrito aqui, a degradação a laser foi então implementada para fabricar uma rede derivada vascular em 2D em um hidrogel acondicionado, para o fluxo impulsionado por bomba de seringa e perfusão de dextrano de 65 quilodaltons.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar um microscópio confocal de varredura a laser equipado com um laser de pulso de femtosegundo para gerar redes microfluídicas biomiméticas utilizando a degradação de hidrogel guiada por imagem a laser. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas a três horas, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os parâmetros do laser, incluindo potência, comprimento de onda e velocidade de varredura, precisam ser ajustados e otimizados com base na formulação do hidrogel que está sendo degradada.Obrigado e boa sorte com seus experimentos.

image-guided-laser-based-fabrication-vascular-derived-microfluidic

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Os tecidos projetados dependem fortemente de redes vasculares adequadas para fornecer nutrientes e gases vitais e remover resíduos metabólicos. Neste trabalho, um protocolo de semeadura passo a passo de células endoteliais e células de suporte cria redes vasculares altamente organizadas em uma plataforma de alta produtividade para estudar o desenvolvimento do comportamento da embarcação em um ambiente 3D controlado.

Semeadura de células stepwise em andaimes tesavendados para estudar vasos sanguíneos brotando

Neste protocolo, um ensaio biomimético de microfluido, que pode reproduzir um ambiente microvascular fisiologicamente relevante e reproduzir toda a cascata de adesão/migração leucócito, é empregado para estudar interações células leucócitos-endoteliais em doenças inflamatórias.

Um sistema microfisiológico para estudar a interação das células leucócitos-endoteliais durante a inflamação

Retalhos projetados requerem uma rede vascular funcional incorporada. Neste protocolo, apresentamos um método de fabricação de um retalho de tecido impresso em 3D contendo uma rede vascular hierárquica e suas anastomosas microcirúrgicas diretas para a artéria femoral de rato.

Fabricação de retalhos vasculares projetados usando tecnologias de impressão 3D

Este protocolo apresenta um modelo tumor-on-a-chip fisiologicamente relevante para realizar pesquisa básica e translacional de câncer humano de alto rendimento, rastreamento avançado de drogas, modelagem de doenças e abordagens de medicina personalizada com uma descrição de procedimentos de carregamento, manutenção e avaliação.

Estabelecendo um Modelo Fisiológico de Microtumor Vascularizado Humano para Pesquisa em Câncer

Aqui apresentamos um protocolo para a construção de um sistema organ-on-chip (OOC) projetado para mimetizar a pneumonectomia. Este sistema investiga a correlação potencial entre o comprometimento do glicocálice e as complicações após a pneumonectomia.

Modelando o glicocálice endotelial pós-pneumonectomia em um chip fluídico 3D - uma abordagem para fabricar um sistema organo-on-chip baseado em vascular

Aprenda a fabricar redes microfluídicas biomiméticas tridimensionais em hidrogéis de PEGDA usando degradação guiada por laser. Este método avança a engenharia de tecidos e modelagem de doenças in vitro.

guiado por imagem, fabricação à base de laser de Redes microfluídicos Vascular derivadas

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