Monitoramento de Astrocyte de reatividade e proliferação in Vitro sob condições isquêmicas

O protocolo a seguir destina-se a mostrar o isolamento de astrócitos primários de cérebros de ratos filhotes para realizar a privação de glicose de oxigênio ou OGD. A exposição de astrócitos purificados, a ambiente privado de glicose de oxigênio é um módulo que nos permite testar a reação a algumas das condições encontradas em acidentes vasculares cerebrais isquêmicos. Alterações metódicas, após a exposição à privação de glicose de oxigênio, podem ser observadas e medidas usando marcadores seletivos de astrócitos, como GFAP.

Em resumo, essas células isoladas expostas a condições isquêmicas podem ser usadas para testar novas vias parciais ativadas em condições hipóxicas e outras drogas que protegem contra o AVC isquêmico. Nesta parte do protocolo os astrócitos serão isolados de córtices de ratos filhotes. O objetivo deste procedimento é obter uma cultura de células astrocíticas primárias para realizar experimentos de privação de glicose de oxigênio.

Os materiais para este procedimento são os seguintes, Autoclave todos os materiais antes de usá-los neste procedimento. E exponha o capô a pelo menos 20 minutos de luzes UV antes de iniciar o protocolo. Para iniciar este procedimento, pipete de três a cinco mililitros de meio DME completo em cada placa.

Ele será dividido da seguinte forma, um para cada cérebro de camundongo, dois para todos os córtices e três para todos os córtices sem as meninges. Decapite um filhote após desinfetar com etanol a 70%. Faça uma incisão começando da parte de trás da cabeça em direção ao nariz.

Remova o crânio com uma pinça curva e raspe suavemente o cerebelo, expondo os córtices. Remova os cérebros expostos com uma pinça e coloque o cérebro na primeira placa de Petri com mídia. Repita essas etapas para todos os outros filhotes.

Separe os hemisférios cerebrais dividindo-se suavemente ao longo da fissura da linha média com a extremidade afiada da pinça de microdissecação. Descasque os córtices removendo a substância branca e o hipocampo usando a pinça com um movimento de pinça, deixando-os para trás. Transfira os córtices da casca para a placa de Petri rotulada como número dois.

Repita o procedimento para todos os cérebros combinando todos os córtices dissecados na placa de Petri. Agite suavemente o prato para distribuir igualmente a mídia entre todos os córtices. Use o microscópio de dissecção para identificar as meninges que revestem os córtices descascados.

As meninges são uma camada transparente muito fina que pode ser identificada procurando os pequenos capilares vermelhos que circundam o tecido. Inspecione e remova cuidadosamente as meninges que revestem os córtices e retire-as suavemente dos lobos corticais individuais usando uma pinça fina em ambos os lados de cada córtex. Coloque os córtices limpos em uma nova placa de Petri rotulada como número três.

Para dissociação de tecidos usando o método do estômago ou liquidificador, despeje os córtices limpos e descascados e a mídia da placa de Petri em um saco liquidificador estéril. E adicione mídia suficiente para elevar o volume total da bolsa para cinco mililitros. Coloque o saco no stomacher 80 deixando aproximadamente dois centímetros do saco visível acima da porta fechada.

A dissociação celular neste instrumento é feita após 2,5 minutos em alta velocidade. Alternativamente, a dissociação do tecido pode ser feita fechando a bolsa estéril e batendo suavemente no tecido com um copo no capuz até que as partículas de tecido se tornem uma suspensão fina. Certifique-se de usar um pano entre o saco e o copo para evitar atrito e quebrar o saco.

Despeje a suspensão celular no centro da luva com um número de malha 60. Despeje as células filtradas no meio de uma malha número 100, permitindo filtrar por gravidade. Despeje a suspensão de células filtradas em um tubo cônico de 15 mililitros.

Flutuação central da suspensão da célula a 200 vezes G em uma fuga central, de preferência com um roteador de caçamba oscilante por cinco minutos. Retire o sobrenadante e descarte em um copo. Adicione mídia nova completa à paleta de células.

Com uma pipeta serológica, ressuspender e dissociar a paleta de células num máximo de cinco mililitros de meio. Adicione a quantidade desejada de suspensão celular em um frasco e complete com meio. Adicione a paleta ressuspensa ao frasco com medium.

Distribua as células uniformemente por todo o frasco e coloque-as em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Lembre-se de mudar a mídia a cada três dias. A metodologia a seguir destina-se a privar as células de oxigênio e glicose em um ambiente controlado.

O objetivo deste modelo é estudar a resposta dos astrócitos em uma condição de AVC semelhante ao isquêmico. Os materiais utilizados para este procedimento são: Purgue o meio livre de glicose inserindo uma pipeta sorológica conectada ao sistema de gás. Borbulhar a solução com a mistura de gases durante 10 minutos a um caudal de 10 a 15 litros por minuto.

Após os 10 minutos, ajuste o pH do meio OGD para 7,4. Filtrar o meio livre de glicose purgado utilizando o sistema de filtro de tubo de 50 mililitros. É importante sempre fazer um novo meio OGD para cada experimento.

Isso garantirá que o meio seja purgado de oxigênio. Remova o meio astrócitos e lave com PBS celular duas vezes para remover a glicose das células. Adicione o meio OGD aos poços.

Coloque o prato de vários poços com a tampa aberta dentro da câmara de hipóxia. Conecte a mistura de gases à válvula de entrada e deixe a válvula de saída aberta. Lave a câmara com a mistura de gases a 10 a 15 litros por minuto, durante cinco a sete minutos.

Pare o fluxo de gás e primeiro feche a braçadeira na válvula de saída. Em seguida, feche a braçadeira na tubulação da válvula de entrada de gás. Coloque a câmara hipóxica na incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius pelo tempo desejado em OGD.

Após o término do tempo de incubação, aspire o meio OGD e adicione cuidadosamente DMEM completo às células para a condição normóxica. Retorne as células à incubadora de cultura para zero 24 e 48 horas de condições normóxicas. Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos de córtices de ratos neonatais.

Após a validação da pureza das culturas primárias, foram realizados experimentos com OGD. Neste modelo isquêmico, a privação de glicose e oxigênio induziu uma mudança mais fológica que foi monitorada pela imunofluorescência usando marcadores astrocíticos, como GFAP, ou marcadores de proliferação, como PCNA. Uma das vantagens deste modelo é que ele nos permite estudar uma resposta de tipo de célula específica.

Embora a limitação nesta técnica seja a falta de interação célula a célula devido ao isolamento dos astrócitos. Uma das maneiras possíveis de superar essa limitação é expor os astrócitos a meios de condição de outros tipos de células ou a uma co-cultura. Em resumo, o método de privação de glicose de oxigênio em um sistema celular isolado nos permite testar diretamente os efeitos de diferentes moléculas neuroprotetoras ou neurotóxicas.

Além disso, é uma ferramenta válida para estudar a biologia dos astrócitos. Finalmente, este modelo estabelece uma base sólida para estudar drogas de desenvolvimento em condições experimentais usando modelos in vivo.