Análise de proteínas Cap-ligação em células humanas expostas a condições de oxigênio fisiológicos

O objetivo geral deste experimento é capturar proteínas de ligação à tampa em condições de baixo oxigênio. Este método utiliza um análogo de sete cápsulas de metil-guanosina ligado à agarose para investigar os fatores de ligação à tampa e seus parceiros de interação. Este método ajudará a responder a questões-chave no campo da síntese de proteínas, como a identificação de novos fatores regulados pelo oxigênio envolvidos na tradução dependente da tampa.

A principal vantagem dessa técnica é que as células são mantidas em uma estação de trabalho de hipóxia até o ponto de lise. As implicações dessa técnica se estendem à terapia do câncer porque as células cancerígenas dentro de um tumor são expostas a níveis muito baixos de oxigênio e o controle translacional desempenha um papel fundamental na progressão do tumor. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando lemos uma publicação recente dos colegas de Corona relatando que a oxigenação do tecido está realmente mais próxima do que chamamos de hipóxia do que da normaxia em que as células são rotineiramente cultivadas.

Inicie este procedimento com cultura de células conforme descrito no protocolo de texto. Após a contagem das células usando um hemocitômetro, alimente placas cultivadas de 150 milímetros contendo 15 mililitros de meio completo para obter uma densidade celular de 2500 a 5000 células por centímetro quadrado. Use dois pratos de 150 milímetros para cada ensaio de ligação de tampa.

Coloque as placas de cultura semeadas na incubadora a 37 graus Celsius e uma atmosfera de dióxido de carbono a cinco por cento. Após a incubação das células por pelo menos 24 horas, coloque-as em uma estação de trabalho de hipóxia pelo tempo desejado. Em seguida, defina a estação de trabalho para a fisioxia apropriada.

Pré-aqueça uma solução salina tamponada com fosfato X, ou PBS, e tripsina em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 minutos. Alíquota de 980 microlitros de tampão de lise em um tubo de centrífuga de 1,5 microlitro para cada ensaio de ligação da tampa que está sendo realizado. 10 microlitros de coquetel inibidor de protease 100X e 10 microlitros de hidrocloreto de fluoreto de 4-benzenossulfonil para os 980 microlitros de tampão de lise no gelo.

Descarte a mídia de cada prato de 150 milímetros em um recipiente de lixo dentro da estação de trabalho de hipóxia. Em seguida, lave as células com três a quatro mililitros de um X PBS quente e descarte o líquido. Adicione um mililitro de EDTA quente a 05% de tripsina a cada prato e deixe os pratos descansar por dois minutos ou até que as células não estejam mais aderidas ao prato.

Usando uma pipeta, transfira as células de uma placa para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Repita conforme necessário para que cada placa de células seja transferida para um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitro. Centrifugue os tubos de microcentrífuga a 6000 vezes g por 90 segundos para granular as células.

Após a centrifugação, aspirar a tripsina com uma pipeta sem perturbar o sedimento. Lave as células com um X PBS quente pipetando suavemente 200 microlitros de PBS no tubo logo acima do pellet. Em seguida, aspire o PBS sem perturbar o pellet.

Em seguida, pipete 500 microlitros da solução tampão de lise preparada de um mililitro para o primeiro pellet celular. Ressuspenda totalmente o pellet pipetando para cima e para baixo. Combine as células ressuspensas com o segundo pellet celular e ressuspenda o segundo pellet pipetando para cima e para baixo.

Repita este processo até que todos os pellets tenham sido combinados e ressuspensos para cada amostra. Em seguida, combine o lisado com os 500 microlitros restantes de tampão de lise em um tubo de microcentrífuga de 1,5 litro. Remova as amostras da estação de trabalho de hipóxia.

Lisar as células usando agitação suave, girando as amostras a quatro graus Celsius por 1,5 a duas horas. Após a incubação, centrifugue as células lisadas a 1200 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius para remover os detritos celulares. Transferir o lisado para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros e rejeitar o sedimento.

Reserve uma parte do sobrenadante para ser usada como controle de entrada de lisado de célula inteira para análise de western blot. Para se preparar para o ensaio de ligação da tampa, use uma tesoura para remover a ponta da pipeta para facilitar a coleta da pasta do grânulo. Para cada amostra, transfira 50 microlitros da pasta de controle de grânulos de agarose em branco e 50 microlitros da pasta de grânulos ligados a agarose C10 m7GTP para separar tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Em seguida, peletize as esferas centrifugando a pasta a 500 vezes g por 30 segundos. Remova o sobrenadante com cuidado e ressuspenda os grânulos em 500 microlitros de TBS. Depois de repetir essas etapas, jogue as contas a 500 vezes g por 30 segundos e remova o sobrenadante.

Em seguida, transferir o sobrenadante que contém o lisado para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contém as esferas de agarose em branco. Incube por 10 minutos a quatro graus Celsius com agitação suave. Após 10 minutos, esfolar as esferas de agarose em branco centrifugando a 500 vezes g durante 30 segundos.

Após a centrifugação, transfira o lisado que não se liga aos grânulos para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo os grânulos ligados à agarose C10 m7GTP. Lave as esferas de agarose em branco ressuspendendo as esferas em 500 microlitros de tampão de lise, peletizando as esferas centrifugando a 500 vezes g por 30 segundos e descartando o sobrenadante. Repita isso quatro vezes para um total de cinco lavagens.

Ressuspenda as contas de agarose em branco em um buffer de amostra X SDS-PAGE. E ferva as contas por 90 segundos a 95 graus Celsius. Armazene a amostra a 20 graus Celsius para futura análise de western blot para observar se a proteína de interesse se liga de forma não específica ao grânulo.

Incube o lisado com os grânulos ligados à agarose C10 m7GTP com agitação suave por uma hora a quatro graus Celsuis para capturar proteínas de ligação à tampa. Após agitação, peletize os grânulos ligados à agarose C10 m7GTP centrifugando a 500 vezes g por 30 segundos. Depois de descartar o sobrenadante, lave os grânulos ligados à agarose C10 m7GTP como antes.

Ressuspenda os grânulos em 600 microlitros de tampão de lise e adicione GTP a uma concentração final de um milimolar. Incube os grânulos ligados à agarose C10 m7GTP mais um GTP milimolar com agitação suave por uma hora a quatro graus Celsius. Isso dissociará proteínas que interagem de forma não específica com m7GTP.

Agitar os grânulos ligados à agarose C10 m7GTP centrifugando a 500 g de tempo durante 30 segundos. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e adicione 200 microlitros de quatro X SDS-PAGE tampão de amostra. Depois de lavar as contas como antes, suspenda-as novamente em um tampão de amostra X SDS-PAGE e ferva a 95 graus Celsius por 90 segundos.

Aqui são mostrados western blots representativos de uma purificação típica de afinidade m7GTP de duas proteínas principais de ligação à tampa em resposta a flutuações de oxigênio nas células epiteliais primárias do túbulo proximal renal humano. Os lisados celulares foram expostos a oito por cento, cinco por cento, três por cento ou um por cento de oxigênio por 24 horas. As pistas incluem 10% de todo o lisado celular como entrada, um GTP lavado para medir a especificidade do m7GTP e as proteínas ligadas aos grânulos m7GTP após a lavagem do GTP.

Os dados de pelo menos três experimentos independentes foram quantificados pela Imagem J e expressos como unidades de densidade relativa em relação a 10% de entrada de todo o lisado celular. Os resultados indicam que as células humanas cultivadas sob oxigênio fisiológico utilizam duas proteínas de ligação à tampa para recrutar mRNAs distintos para tradução. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como capturar proteínas de ligação à tampa em condições de baixo oxigênio.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as células na estação de trabalho de hipóxia até o ponto de lise, pois o oxigênio pode alterar rapidamente as propriedades bioquímicas desses fatores de iniciação da tradução. Seguindo este procedimento, outros métodos, como o fracionamento de polissomos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais proteínas de ligação à tampa se associam à tradução ativa em condições de baixo oxigênio.