Name: Análise de proteínas Cap-ligação em células humanas expostas a condições de oxigênio fisiológicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprenda a analisar proteínas de ligação ao cap em células humanas sob oxigênio fisiológico usando análogo m7GTP ligado a agarose. Este método identifica fatores regulados por oxigênio na tradução cap-dependente.

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Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá e pelo Ministério de Pesquisa e Inovação de Ontário.

1. Preparativos para Cultura de Células <ol><li> Comprar ações disponíveis no mercado de células humanas. NOTA: Este protocolo utiliza carcinoma colorectal HCT116 e células primárias humanas renais proximais tubulares epiteliais (HRPTEC). </li><li> Adicione 500 ml de meio de cultura de HCT116: de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), meio de glucose / alta suplementado com 7,5% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S). </li><li> Adicione 500 ml de meio de cultura de HRPTEC: meio de células epiteliais suplementado com FBS a 5%, suplemento de crescimento de células epiteliais de 1%, e 1% de P / S. </li><li> Preparar 500 ml de 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS): NaCl 140 mM, KCl a 3 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 15 mM de KH 2 PO 4. Ajustar o pH para 7,4 e esterilizar em autoclave durante 40 min a 121 ° C. </li></ol> 2. Início de cultura de células <ol><li> Aspirar cuidadosamente o meio de um prato confluentes 80-90% sem perturbar tele células. </li><li> Alíquotas 3-5 ml de 1x PBS por placa de cultura, agite levemente cada frasco para revestir a área da superfície do prato, e cuidadosamente aspirar o PBS 1x. Repita o procedimento para uma segunda lavagem 1x PBS. </li><li> Aliquota de 3 ml de ácido etilenodiaminotetra-tripsina a 0,05% (EDTA) em cada placa de cultura e agitar suavemente para revestir uniformemente as células com tripsina-EDTA. Incubar a 37 ° C durante 2-3 min. </li><li> Transferir as células destacadas para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar a 4000 xg durante 90 seg. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 1 ml de DMEM completo. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Calcula quantos não pirogénica e 100 milímetros de poliestireno celular de cultura de pratos são necessárias para alcançar uma densidade de sementeira inicial de cerca de 2.500-5.000 células por cm2. </li><li> meio completo pré-quente de cultura celular feito em etapas 1.2 ou 1.3 em um 37 ° C banho de água por 30-45 min. </li><li> Descontaminar a garrafa médio e frasco de células com etanol 70%. Deste ponto em diante tudooperações devem ser realizadas de forma asséptica. </li><li> Aliquota 6 ml de DMEM completo em tantas placas de cultura de células de 100 mm é necessária para utilizar todo o volume de células congeladas dentro da densidade de sementeira mencionada no passo 2.6. </li><li> Transferir o volume de suspensão de células no passo 2.6 calculada para cada um dos pratos de cultura de 100 mm. Rocha cada placa manualmente para distribuir uniformemente as células sobre a superfície da placa. </li><li> Colocar a placa de cultura de célula de 100 milímetros semeado na incubadora a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2. Permitir que as células a incubar, pelo menos, 24 h antes de os passos seguintes. </li></ol> 3. Subcultura <ol><li> Ver cada prato de cultura de células sob um microscópio para determinar a percentagem de confluência celular (% de células que cobrem a área do prato). Retorno células para a incubadora e meio completo pré-quente e 1x PBS. Vá para a próxima etapa se as células são 80-100% confluentes. </li><li> Aspirar cuidadosamente o meio passou sem perturbar oAs células em cada placa de cultura. </li><li> Alíquotas 3-5 ml de 1x PBS por placa de cultura, agite levemente cada frasco para revestir a área da superfície do prato, e cuidadosamente aspirar o PBS 1x. Repita o procedimento para uma segunda lavagem 1x PBS. </li><li> Alíquota de 3 ml de 0,05% de tripsina-EDTA em cada placa de cultura e agite levemente para uniformemente revestir as células com tripsina-EDTA. Incubar a 37 ° C durante 2-3 min. </li><li> Durante esta incubação, uma alíquota de 10 ml de meio completo em tantas placas de cultura são necessários para obter a densidade celular de 2.500-5.000 células por cm2. </li><li> Quando as células terem separado da placa, adicionar rapidamente 3 ml de inibidor de tripsina 1x definido e agitar suavemente o prato durante 1 minuto para assegurar que toda a tripsina-EDTA foi neutralizado. </li><li> Transferência das células isoladas em um 15 ml tubo de centrífuga estéril e reserve. Adicionar 3 ml de 1x PBS para o prato para recolher quaisquer células restantes, e transferir o mesmo que para 15 ml tubo de centrífuga. </li><li> Agregar as células por centrifugação a 150 xgdurante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 3 ml de meio completo. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro e semear placas de cultura de 150 mm contendo 15 ml de meio completo para se obter uma densidade celular de 2.500-5.000 células por cm2. Use duas 150 mm para cada ensaio de ligação cap. NOTA: Oxygen difusão de células através de meios líquidos é dependente do volume 36. Recomenda-se para manter o volume do meio consistente entre as experiências se as células aderentes ou células em suspensão são utilizados. Os meios podem ser pré-condicionado (incubados na estação de trabalho, durante 24 h, como discutido em Discussão) para evitar estas variabilidades em difusão. </li><li> Colocar os pratos de cultura semeado na incubadora a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2. Permitir que as células a incubar pelo menos 24 horas antes de prosseguir para as próximas etapas. </li></ol> 4. A exposição Physioxic <ol><li> Ver as células ao microscópio. para besresultados t, assegurar que as células são 70-80% confluentes para uma exposição de 24 horas, 50-60% confluentes para uma exposição de 48 horas, e 40-50% confluentes para uma exposição de 72 horas. </li><li> Colocar as células em hipoxia uma estação de trabalho durante o tempo desejado (24, 48, ou 72 horas, dependendo da experiência). </li><li> Defina a estação de trabalho para o physioxia apropriado. NOTA: Por exemplo, uma configuração de 3% de O2 seria acompanhado por 5% de CO 2 e 92% de N2. NOTA: Se as flutuações de oxigênio dentro de um intervalo dinâmico são desejados ao longo de um cronograma específico, o programa da agenda para o instrumento ou ajustar manualmente as configurações de oxigênio nos intervalos desejados. </li><li> Ajuste a umidade para 60%. A atmosfera da estação de trabalho é muito seco, no entanto, e meios de comunicação visivelmente evaporar durante experimentos longos (&gt; 48 h). Manter uma reserva de mídia em uma garrafa de cultura de célula dentro da estação de trabalho (de modo que a mídia está equilibrada com a atmosfera estação de trabalho) para repor os meios de comunicação no dis cultura de célulashes. NOTA: Qualquer solução que vai interagir com as células antes da lise (tal como PBS e tripsina-EDTA) deve ser pré-condicionadas durante 24 horas antes da utilização dentro da estação de trabalho de hipoxia de modo que o oxigénio dissolvido se equilibra com o oxigénio atmosférico 36. </li><li> Manter as células no interior da estação de trabalho até a lise. </li></ol> 5. Amortecedores preparando para Ensaio Cap-obrigatório <ol><li> Prepare 1x Tris salina (TBS). <ol><li> Em 800 mL de dH2O, dissolve-se 8,76 g de NaCl e 6,05 g de Tris Base. </li><li> Levar a solução a um pH final de 7,4 utilizando HCl 1 M. </li><li> Levar o volume final de 1 L utilizando dH2O </li></ol></li><li> Preparar tampão de lise não desnaturante. Preparar tampão de lise no dia do ensaio de ligação a tampa. Adicione tampão de lise adicional para lavar as pérolas de agarose em branco e o γ-aminofenil-m 7 GTP agarose C10-ligados (passos 7.9 e 7.13). <ol><li> Em 7 ml de dH 2 O, adicionar 160 ul de 5 M NaCl, 160 ul de 1 M de Tris-HCl pH 7,4, 40 ul de 200 mM de NaF, 40 ul de 1 M de MgCl2, e ortovanadato de sódio 1 mM 40 ul. </li><li> Adicionar 40 ul de Igepal-se à solução 7 ml. Cortar a ponta da pipeta para ajudar a recuperar o Igepal, uma vez que é extremamente viscoso. </li><li> Misturar por pipetagem para cima e para baixo, ou de vórtice, a solução 7 ml até todo o Igepal foi dissolvido. </li><li> Aumentar o volume final da solução de 8 ml e manter em gelo. </li></ol></li><li> Prepare tampão de 4x Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) -Page Sample. <ol><li> Numa proveta, combinar 16 ml de 1 M de Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml de glicerol, e 8 ml de ditiotreitol (DTT). </li><li> Adicionar 3,2 g de SDS e 0,16 g de azul de bromofenol. Permitir que o pó se dissolver completamente, misturando com uma barra de agitação magnética. </li><li> Alíquota em 1,5 ml tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 6. Lise Celular <ol><li> Preparar tampão de lise não desnaturante e manter em gelo do dia do the ensaio de ligação cap-. </li><li> Pré-aquecido PBS 1x tripsina e num banho de água a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Alíquotas de 980 ul de tampão de lise para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para cada teste de ligação de tampa a ser realizada. </li><li> Adicionar 10 ul de 4- (2-aminoetil) benzenossulfonilo cloridrato de fluoreto e 10 ul de mistura de inibidores de protease 100X aos 980 ul de tampão de lise. Manter em gelo. </li><li> Descarte a mídia a partir de cada prato 150 mm de um recipiente de resíduos dentro da estação de trabalho hipóxia. </li><li> Lavar as células com 3-4 ml de PBS morno 1x e descartar todo o líquido. </li><li> Adicionar 1 ml de 0,05% de tripsina quente-EDTA a cada placa e deixar repousar durante 2 minutos ou até que as células não estão aderidas à chapa. </li><li> Usando uma pipeta, transferir as células de uma placa para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita conforme necessário de modo a que cada placa de células é transferida para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml separado. </li><li> Centrifugar os tubos de 1,5 ml de microcentrífuga a 6.000 xg durante 90 seg tO sedimentar as células. </li><li> Aspirar a tripsina usando uma pipeta, sem perturbar o sedimento. Se o sedimento é perturbado, re-centrifugar o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a 6000 xg durante 90 seg. </li><li> Lavam-se as células com PBS morno 1x pipetando suavemente 200 ul de PBS para dentro do tubo imediatamente acima do sedimento. Re-se o sedimento de centrifugação é perturbado. </li><li> Aspirar o PBS sem perturbar o sedimento. </li><li> Pipetar 500 ul de 1 ml dos preparados solução tampão de lise sobre o primeiro sedimento celular. Ressuspender o sedimento inteiramente por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Combine as células ressuspensas com o segundo agregado de células e ressuspender o pellet segunda pipetando cima e para baixo. Repetir este processo até que todos os peletes foram combinadas e ressuspensas para cada amostra. </li><li> Combinar o lisado com os restantes 500 ul de tampão de lise em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Retirar amostras a partir da estação de trabalho hipóxia. NOTA: Depois de adicionar tampão de lise, all passos subsequentes devem ser realizadas no ar ambiente como a estação de trabalho hipoxia é definido como 37 ° C e os passos seguintes são para ser realizada a frio (4 ° C ou sobre gelo). </li><li> Lisar as células, utilizando agitação suave através da rotação das amostras a 4 ° C durante 1,5-2 h. </li><li> Centrifugar as células lisadas a 12000 xg durante 15 min a 4 ° C para remover os restos celulares. </li><li> Transferir o lisado para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 mL e rejeitar o sedimento. </li><li> Reservar uma parte (5-10%) do sobrenadante a ser usado como um controle de entrada de lisado de células inteiras para futura análise Western Blot. </li></ol> 7. Ensaio de ligação Cap <ol><li> Para cada amostra, transferir 50 ul da suspensão de esferas de agarose de controlo em branco e 50 ul da suspensão do grânulo γ-aminofenil-m 7 GTP de agarose-C10 ligado para separar 1,5 ml de tubos de microcentrífuga. Utilize uma tesoura para remover a ponta da pipeta para facilitar a recolha da pasta de grânulo. </li><li> Sedimentar as contas bY centrifugação da suspensão a 500 xg durante 30 seg. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente as pérolas em 500 ul de TBS. </li><li> Repita os passos 7.2 e 7.3. Sedimentar as pérolas a 500 xg durante 30 seg e remover o sobrenadante. </li><li> Transferir o sobrenadante contendo o lisado proveniente de passo de 6,19 para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo as contas de agarose em branco. NOTA: As esferas de agarose em branco actuar como um passo de pré-limpeza para remover as proteínas a partir do lisado que não interagem especificamente com o grânulo. </li><li> Incubar durante 10 min a 4 ° C com agitação suave. </li><li> Sedimentar as pérolas de agarose em branco por centrifugação a 500 xg durante 30 seg. </li><li> Transferir o lisado para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo os γ-aminofenil-m 7 GTP agarose contas ligadas a C10. </li><li> Lavam-se as pérolas de agarose em branco por ressuspensão das pérolas em 500 ul de tampão de lise, sedimentando os grânulos por centrifugação a 500 xg durante 30 seg, e descartando o Supernatant. Repetir este quatro vezes para um total de cinco lavagens. </li><li> Ressuspender as esferas de agarose em tampão de amostra em branco 1x SDS-PAGE, e os grânulos ferver durante 90 segundos a 95 ° C. Armazenar a -20 ° C para futura análise de Western blot para observar se a proteína de interesse se liga não especificamente à esfera. </li><li> Incubar o lisado com os grânulos γ-aminofenil-m 7 GTP de agarose-C10 com ligações com agitação suave durante 1 hora a 4 ° C para capturar as proteínas de ligação ao tampão. </li><li> Agregar as γ-aminofenil-m 7 GTP agarose contas ligadas a C10 por centrifugação a 500 xg durante 30 seg. Descartar o sobrenadante. </li><li> Lavar as γ-aminofenil-m 7 GTP esferas de agarose ligadas-C10, repetindo o passo 7.9. </li><li> Ressuspender as pérolas em 600 ul de tampão de lise. </li><li> Adicionar GTP a uma concentração final de 1 mM. </li><li> Incubar as γ-aminofenil-m 7 GTP esferas de agarose ligadas-C10 + GTP 1 mM, com agitação suave durante 1 hora a 4 ° C. Nota: Esteirá dissociar as proteínas que não interactuam especificamente com M 7 GTP (isto é, também interagir com GTP não-metilada). </li><li> Agregar as γ-aminofenil-m 7 GTP agarose contas ligadas a C10 por centrifugação a 500 xg durante 30 seg. </li><li> Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar 200 ul de tampão de amostra 4x de SDS-PAGE (Tris 50 mM-HCl, DTT 100 mM, SDS a 2%, 0,1% de azul de bromofenol e glicerol a 10%). Armazenar a amostra de controlo de GTP a -20 ° C para futura análise de Western blot 37. Lave as contas repetindo o passo 7.9. </li><li> Ressuspender as esferas em 1x tampão de amostra de SDS-PAGE (Tris 50 mM-HCl, DTT 100 mM, SDS a 2%, 0,1% de azul de bromofenol e glicerol a 10%), e ferver a 95 ° C durante 90 seg. Armazenar a fracção m-7 GTP ligado a -20 ° C para futura análise de Western blot 37. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A análise de proteínas de ligação de PAC em células humanas expostas a condições fisiológicas de oxigénio pode permitir a identificação de novos factores de iniciação de tradução regulada de oxigénio. A afinidade destes factores para a tampa 5 &#39;do mRNA ou de outras proteínas associadas a tampa pode ser medida pela força da sua associação a 7 m-GTP ligados esferas de agarose. Uma limitação desta técnica é que ele mede o potencial de ligação a tampa de proteínas pós-lise, mas é realizada sob condições não d...

Controle de translação está a emergir como um passo igualmente importante para a regulação da transcrição na expressão do gene, especialmente durante períodos de estresse celular 1. Um ponto focal de controlo de tradução é para o passo limitante da velocidade de início em que os primeiros passos da síntese de proteínas envolve a ligação do factor eucariótico de iniciação 4E (eIF4E) para o 7-metilguanosina (m 7 GTP) 5 &#39;tampão de mRNAs 2 . eIF4E é parte de um complexo trimérico chamado eIF4F que inclui elF4A, uma helicase de ARN, e eIF4G, uma proteína andaime necessário para o recrutamento de outros factores de tradução e os ribossomas 40S 3. Sob condições fisiológicas normais, a grande maioria dos mRNAs são traduzidas por um mecanismo dependente da tampa, mas sob períodos de stress celular, aproximadamente 10% de mRNAs humanos contêm 5 &#39;UTRs que podem permitir a tradução independente de cap iniciação 1,4. tradução dependente de Cap tem sido historicamente sinônimoous com eIF4F, no entanto, variações específicas de estresse dos eIF4F tornaram-se um trending topic 5-8. Várias tensões celulares causar actividade eIF4E a ser reprimido através do alvo de mamífero do complexo rapamicina 1 (mTORC1). Esta quinase torna-se prejudicada sob estresse, o que resulta no aumento da atividade de um dos seus alvos, proteína do 4E de ligação (4E-BP). Não fosforilada 4E-BP liga-se a eIF4E e bloqueia a sua capacidade de interagir com eIF4G fazendo com que a repressão da tradução dependente de tampão 9,10. Curiosamente, um homólogo de eIF4E chamado eIF4E2 (ou 4EHP) tem uma afinidade muito menor para 4E-BP 11, permitindo que ele talvez para evadir a repressão mediada por stress. Com efeito, caracterizada inicialmente como um repressor da tradução devido à sua falta de interacção com eIF4G 12, eIF4E2 inicia a tradução de centenas de ARNm que contêm elementos de resposta a hipoxia de ARN na sua UTR 3 &#39;durante o stress hipóxico 6,13. Este i activaçãos alcançado através de interações com ligação eIF4G3, RNA motivo de proteína 4 e 2α o fator inducible hipoxia (HIF) para constituir um complexo eIF4F hipóxica ou eIF4F H 6,13. Como um repressor em condições normais, se liga com eIF4E2 GIGYF2 e ZNF598 14. Estes complexos foram, em parte, identificados através de m 7 resinas GTP de afinidade de agarose ligadas. Este método clássico 15 é padrão na área de tradução e é os ensaios de melhor e mais comumente utilizado técnica para isolar complexos de ligação de PAC em puxar para baixo e in vitro de ligação 16-19. À medida que a maquinaria de tradução dependente de tampão está a emergir como flexível e adaptável com partes inter- mudando 6-8,13, este método é uma ferramenta poderosa para identificar rapidamente novas proteínas de ligação ao tampão envolvidas na resposta ao stress. Além disso, as variações na eIF4F poderia ter implicações amplas como vários sistemas modelo eucarióticos parecem usar um homólogo eIF4E2 para as respostas ao estresse taiscomo A. thaliana 20, S. Pombe 21, 22 de D. melanogaster e C. elegans 23. As evidências sugerem que variações no eIF4F pode não ser estritamente limitado a condições de estresse, mas estar envolvidos na fisiologia normal 24. O fornecimento de oxigénio para os tecidos (em extremidades capilares) ou dentro dos tecidos (medida através de microeléctrodos) varia de 2-6% no cérebro 25, 3-12% nos pulmões 26, 3,5-6% no intestino 27, 4% em o fígado 28, 7-12% no rim 29, 4% no músculo 30, e 6-7% na medula óssea 31. Células e mitocôndrias contêm menos de 1,3% de oxigênio 32. Estes valores são muito mais próximos à hipoxia do que a do ar ambiente, quando as células são cultivadas por rotina. Isto sugere que o que foram previamente pensado como processos celulares específicas de hipóxia pode ser relevante em um ambiente fisiológico. Curiosamente, eIF4F e H eIF4F </sup&gt; participar activamente na iniciação da tradução de piscinas distintas ou classes de mRNAs em várias linhas de células humanas diferentes expostas ao oxigénio fisiológica ou &quot;physioxia&quot; 24. Baixo oxigênio também impulsiona o desenvolvimento fetal adequado 33 e células geralmente têm taxas mais elevadas de proliferação, a expectativa de vida mais longos, menos danos ao DNA e menos respostas de estresse geral em physioxia 34. Portanto, é provável H eIF4F um factor-chave na expressão de genes selecionados em condições fisiológicas. Aqui, nós fornecemos um protocolo para células de cultura em condições de oxigénio fisiológicas fixos ou em um intervalo de flutuação dinâmica que é provável mais representativo do microambiente do tecido. Uma vantagem deste método é que as células são lisadas dentro da estação de trabalho hipóxia. Não é claro como muitas vezes a transição a partir da cultura de células hipóxicas à lise das células é realizada em outros protocolos. As células são muitas vezes removidos em primeiro lugar a partir de uma pequena incubadora ser hipoxiatona lise, mas esta exposição ao oxigénio poderia afectar vias bioquímicas como a resposta celular ao oxigénio é rápido (uma ou duas min) 35. Certas proteínas de ligação PAC necessitem de interações com uma segunda base ou pode hidrolisar o GTP m 7, portanto, alguns interagentes cap podem ser desperdiçada no processo de purificação. Agarose ligada aos análogos cap resistentes enzimaticamente pode ser substituído neste protocolo. Explorando a atividade e composição do eIF4F H e outras variações de eIF4F através do método descrito aqui vai lançar luz sobre os mecanismos de expressão genética intrincados que as células utilizam durante as condições fisiológicas ou respostas ao estresse.

<table><tbody><tr><td>&gamma;-aminofenil-m7GTP agarose C10 Placa de</td> cultura ligada a <td></td><td>agarose m7GTP</td><td></td></tr><tr><td>100 mm</td> Placa de cultura <td>Corning</td><td>877222</td><td>10 cm Placa de</td></tr><tr><td>cultura de 150 mm</td> Placa de cultura <td>Thermofisher</td><td>130183</td><td>15 cm</td></tr><tr><td>Hidrocloro</td><td>ACROS Organics</td><td>A0356829</td><td>AEBSF</td></tr><tr><td>Contas de Agarose</td><td>Jena Bioscience&nbsp;</td><td>AC-0015</td><td>Controle de contas de agarose</td></tr><tr><td>Bromofenol Azul</td><td>Fisher</td><td>BP112-25</td><td>Componente do buffer de carregamento SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1,5 ml Tubos de centrífuga</td><td>FroggaBio</td><td>1210-00S</td><td>Usado para centrifugar pequenos volumes</td></tr><tr><td>15 ml Tubos de centrífuga cônicos</td><td>Fisher</td><td>1495970C</td><td>Usado na cultura de células primárias</td></tr><tr><td>Inibidor de tripsina definido</td><td>Fisher</td><td>R007100</td><td>DTI</td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172-25</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Meio de células epiteliais (kit completo)</td> <td>ScienCell</td><td>4101</td><td>Inclui suplementos de soro e fator de crescimento)</td></tr> <tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>Componente do tampão de carregamento SDS-PAGE</td></tr><tr><td>100 mM Guanosina 5'-trifosfato, 1 ml</td><td>Jena Bioscience</td><td>272076-0251M</td><td>GTP</td></tr><tr><td>HCT116 carcinoma colorretal</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td>Linha celular de câncer humano</td></tr><tr><td>Células epiteliais tubulares proximais renais humanas</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-010</td><td>HRPTEC</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/High Glucose</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>Meio padrão para cultura de células humanas</td></tr><tr><td>Solução de Hyclone Penicilina-Estreptomicina</td><td>GE Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>Componente antibiótico do DMEM</td></tr><tr><td>H35 HypOxystation</td><td>Hypoxygen</td><td>N/A</td><td>Estação de trabalho de hipóxia</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>MP Biomedicals</td><td>2198596</td><td>Componente detergente do tampão de lise</td></tr><tr><td>Fosfato monopotássico</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Fluoreto de sódio</td><td>Fisher</td><td>5299-100</td><td>NaF (componente inibidor da fosfatase do tampão de lise)</td></tr><tr><td>Fosfato dissódico</td><td>Fisher</td><td>5369-500</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Grau Premium Fetal Bovino</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Coquetel de Inibidor de Protease (100x)</td> <td>Sinalização Celular</td><td>58715</td><td>Componente do tampão de lise</td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio</td><td>Fisher</td><td>BP166-100</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Ortovanadato de Sódio</td><td>Sigma</td><td>56508</td><td>Na3VO4</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Componente de tampões</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>2500-067</td><td>Tripsina usada para separar células aderentes</td></tr></tbody></table>

análise de proteínas cap-ligação em células humanas expostas a condições de oxigênio fisiológicos

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

O controle translacional é um ponto focal da regulação gênica, especialmente durante períodos de estresse celular. A tradução dependente de cap através do complexo eIF4F é de longe a via mais comum para iniciar a síntese de proteínas em células eucarióticas, mas variações específicas de estresse desse complexo estão surgindo agora. A purificação de proteínas de ligação à tampa com uma resina de afinidade composta de m7GTP ligado à agarose (um análogo da tampa de mRNA 5') é uma ferramenta útil para identificar fatores envolvidos na regulação do início da tradução. A hipóxia (baixo oxigênio) é um estresse celular encontrado durante o desenvolvimento fetal e a progressão do tumor e é altamente dependente da regulação da tradução. Além disso, foi relatado recentemente que os órgãos humanos adultos têm um teor de oxigênio mais baixo (fisioxia 1-9% de oxigênio) que está mais próximo da hipóxia do que o ar ambiente, onde as células são cultivadas rotineiramente. Com a caracterização contínua de um complexo eIF4F hipóxico (eIF4FH), há um interesse crescente em entender o início da tradução dependente de oxigênio através da tampa de mRNA 5'. Recentemente, desenvolvemos um método de cultura de células humanas para analisar proteínas de ligação a tampas que são reguladas pela disponibilidade de oxigênio. Este protocolo enfatiza que a cultura celular e a lise sejam realizadas em uma estação de trabalho de hipóxia para eliminar a exposição ao oxigênio. As células devem ser incubadas por pelo menos 24 horas para que o meio líquido se equilibre com a atmosfera dentro da estação de trabalho. Para evitar essa limitação, meios pré-condicionados (desoxigenados) podem ser adicionados às células se forem necessários pontos de tempo mais curtos. Certas proteínas de ligação à tampa requerem interações com uma segunda base ou podem hidrolisar o m7GTP, portanto, alguns agentes de tampa podem ser perdidos no processo de purificação. Análogos de capa ligados à agarose enzimaticamente resistentes podem ser substituídos neste protocolo. Este método permite que o usuário identifique novos fatores de tradução regulados por oxigênio envolvidos na tradução dependente de cap.

Análise da Capacidade Cap-obrigatório em resposta a Oxygen de eIF4E e eIF4E2 em uma m 7 GTP de afinidade de coluna As Figuras 1 e 2 representam Western blot de m 7 GTP purificação por afinidade típica de duas importantes proteínas de ligação do tampão em resposta a flutuações de oxigênio em duas linhas de células humanas: células primárias humanas renais proximais tubulares ...

Aqui, apresentamos protocolos de cultura de células humanas para analisar os fatores de iniciação da tradução que se ligam à tampa 5' do mRNA durante condições fisiológicas de oxigênio. Este método utiliza um análogo de tampa m7GTP ligado à agarose e é adequado para investigar fatores de ligação de tampas e seus parceiros de interação.

Análise de proteínas Cap-ligação em células humanas expostas a condições de oxigênio fisiológicos

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

O objetivo geral deste experimento é capturar proteínas de ligação à tampa em condições de baixo oxigênio. Este método utiliza um análogo de sete cápsulas de metil-guanosina ligado à agarose para investigar os fatores de ligação à tampa e seus parceiros de interação. Este método ajudará a responder a questões-chave no campo da síntese de proteínas, como a identificação de novos fatores regulados pelo oxigênio envolvidos na tradução dependente da tampa.A principal vantagem dessa técnica é que as células são mantidas em uma estação de trabalho de hipóxia até o ponto de lise. As implicações dessa técnica se estendem à terapia do câncer porque as células cancerígenas dentro de um tumor são expostas a níveis muito baixos de oxigênio e o controle translacional desempenha um papel fundamental na progressão do tumor. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando lemos uma publicação recente dos colegas de Corona relatando que a oxigenação do tecido está realmente mais próxima do que chamamos de hipóxia do que da normaxia em que as células são rotineiramente cultivadas.Inicie este procedimento com cultura de células conforme descrito no protocolo de texto. Após a contagem das células usando um hemocitômetro, alimente placas cultivadas de 150 milímetros contendo 15 mililitros de meio completo para obter uma densidade celular de 2500 a 5000 células por centímetro quadrado. Use dois pratos de 150 milímetros para cada ensaio de ligação de tampa.Coloque as placas de cultura semeadas na incubadora a 37 graus Celsius e uma atmosfera de dióxido de carbono a cinco por cento. Após a incubação das células por pelo menos 24 horas, coloque-as em uma estação de trabalho de hipóxia pelo tempo desejado. Em seguida, defina a estação de trabalho para a fisioxia apropriada.Pré-aqueça uma solução salina tamponada com fosfato X, ou PBS, e tripsina em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 minutos. Alíquota de 980 microlitros de tampão de lise em um tubo de centrífuga de 1,5 microlitro para cada ensaio de ligação da tampa que está sendo realizado. 10 microlitros de coquetel inibidor de protease 100X e 10 microlitros de hidrocloreto de fluoreto de 4-benzenossulfonil para os 980 microlitros de tampão de lise no gelo.Descarte a mídia de cada prato de 150 milímetros em um recipiente de lixo dentro da estação de trabalho de hipóxia. Em seguida, lave as células com três a quatro mililitros de um X PBS quente e descarte o líquido. Adicione um mililitro de EDTA quente a 05% de tripsina a cada prato e deixe os pratos descansar por dois minutos ou até que as células não estejam mais aderidas ao prato.Usando uma pipeta, transfira as células de uma placa para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Repita conforme necessário para que cada placa de células seja transferida para um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitro. Centrifugue os tubos de microcentrífuga a 6000 vezes g por 90 segundos para granular as células.Após a centrifugação, aspirar a tripsina com uma pipeta sem perturbar o sedimento. Lave as células com um X PBS quente pipetando suavemente 200 microlitros de PBS no tubo logo acima do pellet. Em seguida, aspire o PBS sem perturbar o pellet.Em seguida, pipete 500 microlitros da solução tampão de lise preparada de um mililitro para o primeiro pellet celular. Ressuspenda totalmente o pellet pipetando para cima e para baixo. Combine as células ressuspensas com o segundo pellet celular e ressuspenda o segundo pellet pipetando para cima e para baixo.Repita este processo até que todos os pellets tenham sido combinados e ressuspensos para cada amostra. Em seguida, combine o lisado com os 500 microlitros restantes de tampão de lise em um tubo de microcentrífuga de 1,5 litro. Remova as amostras da estação de trabalho de hipóxia.Lisar as células usando agitação suave, girando as amostras a quatro graus Celsius por 1,5 a duas horas. Após a incubação, centrifugue as células lisadas a 1200 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius para remover os detritos celulares. Transferir o lisado para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros e rejeitar o sedimento.Reserve uma parte do sobrenadante para ser usada como controle de entrada de lisado de célula inteira para análise de western blot. Para se preparar para o ensaio de ligação da tampa, use uma tesoura para remover a ponta da pipeta para facilitar a coleta da pasta do grânulo. Para cada amostra, transfira 50 microlitros da pasta de controle de grânulos de agarose em branco e 50 microlitros da pasta de grânulos ligados a agarose C10 m7GTP para separar tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Em seguida, peletize as esferas centrifugando a pasta a 500 vezes g por 30 segundos. Remova o sobrenadante com cuidado e ressuspenda os grânulos em 500 microlitros de TBS. Depois de repetir essas etapas, jogue as contas a 500 vezes g por 30 segundos e remova o sobrenadante.Em seguida, transferir o sobrenadante que contém o lisado para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contém as esferas de agarose em branco. Incube por 10 minutos a quatro graus Celsius com agitação suave. Após 10 minutos, esfolar as esferas de agarose em branco centrifugando a 500 vezes g durante 30 segundos.Após a centrifugação, transfira o lisado que não se liga aos grânulos para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo os grânulos ligados à agarose C10 m7GTP. Lave as esferas de agarose em branco ressuspendendo as esferas em 500 microlitros de tampão de lise, peletizando as esferas centrifugando a 500 vezes g por 30 segundos e descartando o sobrenadante. Repita isso quatro vezes para um total de cinco lavagens.Ressuspenda as contas de agarose em branco em um buffer de amostra X SDS-PAGE. E ferva as contas por 90 segundos a 95 graus Celsius. Armazene a amostra a 20 graus Celsius para futura análise de western blot para observar se a proteína de interesse se liga de forma não específica ao grânulo.Incube o lisado com os grânulos ligados à agarose C10 m7GTP com agitação suave por uma hora a quatro graus Celsuis para capturar proteínas de ligação à tampa. Após agitação, peletize os grânulos ligados à agarose C10 m7GTP centrifugando a 500 vezes g por 30 segundos. Depois de descartar o sobrenadante, lave os grânulos ligados à agarose C10 m7GTP como antes.Ressuspenda os grânulos em 600 microlitros de tampão de lise e adicione GTP a uma concentração final de um milimolar. Incube os grânulos ligados à agarose C10 m7GTP mais um GTP milimolar com agitação suave por uma hora a quatro graus Celsius. Isso dissociará proteínas que interagem de forma não específica com m7GTP.Agitar os grânulos ligados à agarose C10 m7GTP centrifugando a 500 g de tempo durante 30 segundos. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e adicione 200 microlitros de quatro X SDS-PAGE tampão de amostra. Depois de lavar as contas como antes, suspenda-as novamente em um tampão de amostra X SDS-PAGE e ferva a 95 graus Celsius por 90 segundos.Aqui são mostrados western blots representativos de uma purificação típica de afinidade m7GTP de duas proteínas principais de ligação à tampa em resposta a flutuações de oxigênio nas células epiteliais primárias do túbulo proximal renal humano. Os lisados celulares foram expostos a oito por cento, cinco por cento, três por cento ou um por cento de oxigênio por 24 horas. As pistas incluem 10% de todo o lisado celular como entrada, um GTP lavado para medir a especificidade do m7GTP e as proteínas ligadas aos grânulos m7GTP após a lavagem do GTP.Os dados de pelo menos três experimentos independentes foram quantificados pela Imagem J e expressos como unidades de densidade relativa em relação a 10% de entrada de todo o lisado celular. Os resultados indicam que as células humanas cultivadas sob oxigênio fisiológico utilizam duas proteínas de ligação à tampa para recrutar mRNAs distintos para tradução. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como capturar proteínas de ligação à tampa em condições de baixo oxigênio.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as células na estação de trabalho de hipóxia até o ponto de lise, pois o oxigênio pode alterar rapidamente as propriedades bioquímicas desses fatores de iniciação da tradução. Seguindo este procedimento, outros métodos, como o fracionamento de polissomos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais proteínas de ligação à tampa se associam à tradução ativa em condições de baixo oxigênio.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Saponina permeabilizadas preparação de fibras em conjunto com a análise de fosforilação oxidativa fornece respirométrico de avaliação integrada da função mitocondrial. Respiração mitocondrial em estados fisiológicos e patológicos pode refletir várias influências regulamentares, incluindo as interações mitocondrial, morfologia e bioquímica.

Avaliação fosforilação oxidativa respirométrico em saponina-fibras cardíacas permeabilizadas

Aqui propomos métodos simples para induzir hipóxia em culturas de células e testes simples para avaliar o estado hipóxico das culturas.

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Fonte:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Instrumentos OroborosEste vídeo explica como o fluxo de oxigênio é usado para avaliar a respiração mitocondrial em células vivas e permeabilizadas de mamíferos. Demonstra o uso sequencial de digitonina, substratos metabólicos, ADP, um desacoplador e um inibidor para caracterizar diferentes estados respiratórios. O perfil de fluxo de oxigênio resultante revela a função mitocondrial e a eficiência do acoplamento de energia...

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Nós descrevemos uma técnica para a análise da síntese de RNA global em hipóxia utilizando imagens. Clique química rotulagem de RNA não tenha sido previamente realizada sob hipóxia e permite a visualização de mudanças globais de RNA no nível da célula única. Esta abordagem complementa as técnicas de RNA médios existentes, permitindo a visualização direta das mudanças célula-célula em síntese de RNA global.

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Apresentamos um protocolo para obter assinaturas de proteomic de macrófagos humanos e aplicar isso a determinação do impacto de um ambiente de baixo oxigênio na polarização do macrófago.

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Aqui nós introduzimos um método para usar um cateter ótico do intra-ventrículo em corações perfundidos para executar a espectroscopia da absorvência através da parede do coração. Os dados obtidos fornecem informações robustas sobre a tensão do oxigênio tecidual, bem como a utilização do substrato e o potencial de membrana simultaneamente com medidas de desempenho cardíaco nesta preparação onipresente.

Cateter de luz de queima lateral intra-cardíaco para monitoramento do metabolismo celular usando espectroscopia de absorvência transmural de corações de mamíferos perfused

Aqui, apresentamos uma compilação de ensaios para medir diretamente a função mitocondrial em células de mamíferos, independentemente de sua capacidade de consumir oxigênio molecular.

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

Este protocolo detalha a síntese, encapsulamento da hemoglobina e PEGilação superficial de nanopartículas hierarquicamente porosas de UiO-66, projetadas para entrega de oxigênio. O procedimento combina engenharia de defeitos com conjugação biortogonal promovida por tensão para gerar portadores altamente permeáveis e fisiologicamente estáveis, adequados para aplicações biomédicas.

Síntese, encapsulamento de hemoglobina e PEGilação biortogonal em nanopartículas hierárquicas porosas de UiO-66 para aplicações de entrega de oxigênio

Este protocolo descreve um método para eficazmente transfectar siARN em citotrofoblastos vilosidades humanos isolados de fresco utilizando formação de microporos e identificação de complexos de ADN-proteína nestas células. As células transfectadas pode ser monitorado por análises Western blot e EMSA durante o tempo de cultura de 4 dias.

As análises siRNA transfecção e EMSA sobre recentemente isolados das vilosidades citotrofoblastos Humanos

Aprenda a analisar proteínas de ligação ao cap em células humanas sob oxigênio fisiológico usando análogo m7GTP ligado a agarose. Este método identifica fatores regulados por oxigênio na tradução cap-dependente.

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