A microscopia intravital da vasculatura Tumor-associado usando avançada Dorsal câmaras de janela dobras cutâneas em ratos transgênicos fluorescentes

O objetivo geral deste protocolo é utilizar uma câmara avançada de pregas dérmicas dorsais para examinar em detalhes o desenvolvimento da vasculatura associada ao tumor em um modelo murino. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de oncologia, como a melhoria da terapia e a compreensão da progressão tumoral. A principal vantagem desta técnica é que os processos são estudados no contexto apropriado, em condições fisiológicas reais, e que esses processos podem ser analisados ao longo do tempo.

Este procedimento será demonstrado pela Doutora Ann Seynhaeve, pesquisadora sênior do meu laboratório. A partir de um camundongo doador não transgênico, colete um fragmento tumoral com diâmetro de 10 mm, não necrótico, para implante na câmara de janela dorsal do camundongo receptor. Utilize um camundongo doador normal para tumor sincrônico ou um camundongo doador imunodeficiente para xenotransplante.

O camundongo receptor deve ter pelo menos 12 semanas de idade e pesar vinte gramas ou mais. Realize todos os procedimentos cirúrgicos em condições assépticas. Por exemplo, autoclave os instrumentos cirúrgicos e os materiais da câmara.

Após sedar o camundongo receptor, remova os pelos de toda a região dorsal usando uma tesoura elétrica, depois aplique gel removedor de pelos. Enxágue a pele para limpar e seque-a. Por fim, esfregue a pele despelada com etanol para deixá-la limpa.

Agora, marque uma linha horizontal central ao longo da coluna vertebral. Em seguida, posicione a janela de visualização a pelo menos 2 mm abaixo da linha e marque o perímetro da janela na pele. Depois, utilizando um bisturi e tesoura, remova cuidadosamente a pele dentro da linha do perímetro sem danificar a fáscia subjacente.

Em seguida, levante a dobra de pele e use um furador de orelha para fazer furos de 1 mm em ambos os lados da área da janela, para os parafusos que fixarão a janela no lugar. Posicione o suporte traseiro sobre o camundongo e fixe o suporte colocando as porcas nos parafusos. Em seguida, puxe a pele dois a três milímetros sobre o suporte para garantir que esteja bem ajustada.

Se for o caso, introduza agulhas de calibre 23 através dos dois orifícios para sutura na parte superior da estrutura. Fixe a estrutura apertando as porcas e segure-as com porta-agulhas de fixação; não aperte em excesso as porcas e evite que a pele gire ao redor dos parafusos. Em seguida, substitua as agulhas por suturas para fixar a estrutura à pele.

Agora vire o mouse para o lado. Por este ângulo, introduza um pedaço grosso de vidro de preenchimento e um vidro de cobertura padrão de 12 milímetros. Fixe ambos com um anel de retenção para que a fascia fique firme contra o vidro.

O próximo passo é hidratar a janela utilizando cloreto de sódio a 0,9%. Deixe cair algumas gotas na área de visualização e absorva o excesso. Agora, logo abaixo da janela, utilize uma agulha de 25 gauge com uma curvatura de 90 graus para fazer um bolso profundo na fáscia, capaz de conter um milímetro cúbico de tecido tumoral.

Em seguida, insira o tecido tumoral no bolsão. Por fim, feche a área de visualização com um cubre-objetos padrão de 12 milímetros e um anel de retenção. Todas as bolhas de ar desaparecerão dentro de uma hora.

Antes de sedar o camundongo, aqueça uma plataforma personalizada com controle de temperatura a 37 graus Celsius. Após sedar o camundongo, posicione-o sobre a plataforma aquecida. Afixe uma cone nasal para administrar isoflurano e, se a avaliação durar mais de cinco minutos, aplique uma pomada oftálmica.

Agora, fixe a câmara utilizando os parafusos da janela em um suporte feito sob medida e prenda o suporte à plataforma. Em seguida, limpe a janela de vidro com água e algodão. Agora, no microscópio, verifique o desenvolvimento dos vasos no tumor utilizando a objetiva de 10 vezes, sob luz de campo claro e luz fluorescente.

Após o exame macroscópico, ligue os lasers do microscópio confocal. Configure o painel de controle do microscópio para um ganho inteligente de 100 volts por volta. Um deslocamento inteligente de 10% por volta, zoom médio e posicionamento X e Y médio, e 100 micrômetros de posição Z por volta.

Defina o modo de aquisição como XYZ ou XYZT. Selecione uma resolução. Escolha uma velocidade de aquisição de dois ou 400 hertz.

Defina a abertura do diafragma em uma unidade airy. E selecione a opção X bidirecional. Ao avaliar múltiplos fluoróforos com possíveis faixas espectrais sobrepostas, selecione a varredura sequencial entre quadros para evitar vazamento de sinal e defina os caminhos de feixe corretos.

Defina a média de linhas como quatro e, por fim, selecione um novo conjunto de dados para o experimento. Agora, foque no tecido de interesse; para isso, o ideal é usar lentes secas com maiores aberturas numéricas. Em seguida, utilize a varredura rápida em modo ao vivo para obter a melhor relação sinal-ruído possível, ajustando o ganho e o offset para que não haja superexposição.

Agora, selecione a pilha Z na guia de aquisição. Realize uma varredura Z rápida. A partir da varredura rápida, defina as posições inicial e final da varredura completa.

Em seguida, defina o tamanho do passo Z de acordo com o tamanho do pinhole e prossiga com a varredura completa. Camundongos hospedeiros que expressam marcadores fluorescentes foram submetidos à imagem após a implantação do tumor utilizando o protocolo descrito. O marcador eNOStag-GFP é expresso no complexo de Golgi e na membrana celular de células endoteliais.

O marcador ROSAmT/mG expressa fluorescência vermelha de forma ubíqua e fluorescência verde em células que expressam a Recombinase Cre. Uma aplicação dessa tecnologia é o estudo do desenvolvimento de vasos, pois todas as fases são observadas em tumores. Por exemplo, frentes endoteliais podem ser vistas brotando em áreas não vascularizadas.

Os tumores também possuem vasos danificados e leitos vasculares estabelecidos com vasos maduros ramificados. Outra aplicação é estudar a formação de lúmen, o fluxo sanguíneo e a extravasação aplicando marcadores ao sangue, como nanopartículas que fluorescem. Assim, o fluxo sanguíneo pode ser observado no lúmen dos tubos vasculares e próximo às células endoteliais em forma de ponta.

Nas células da ponta, é observável a formação de uma luz no estoque. A microscopia intra-vital também pode ser utilizada para investigar o efeito de agentes quimioterápicos. Por exemplo, 24 horas após a injeção de nanopartículas em um animal eNOStag-GFP, as nanopartículas permaneceram na vasculatura com extravasamento mínimo para o interstício tumoral.

No entanto, quando as nanopartículas foram administradas em combinação com TNF, observou-se extravasamento para o interstício tumoral. Isso é evidência de um aumento na entrega intratumoral de fármacos. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender bem como instalar uma câmara de janela de dobra cutânea dorsal e como estudar processos relacionados ao tumor utilizando microscopia confocal.