A microscopia intravital da vasculatura Tumor-associado usando avançada Dorsal câmaras de janela dobras cutâneas em ratos transgênicos fluorescentes

O objetivo geral deste protocolo é usar uma câmara de dobras cutâneas dorsal avançada para examinar o desenvolvimento da vasculatura associada ao tumor em detalhes em um modelo de camundongo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer, como melhoria da terapia e compreensão da progressão do tumor. A principal vantagem dessa técnica é que os processos são estudados no contexto certo, na vida real e que esses processos podem ser estudados ao longo do tempo.

Este procedimento será demonstrado pela Dra. Ann Seynhaeve, pesquisadora sênior do meu laboratório. De um camundongo doador não transgênico, colha um fragmento tumoral não necrótico de 10 mm de diâmetro para implantação na câmara da janela dorsal do camundongo receptor. Use um doador de camundongo normal para um tumor singênico ou um doador de camundongo imunodeficiente para um xenoenxerto.

O camundongo receptor deve ter pelo menos 12 semanas de idade e pesar vinte ou mais gramas. Realize todos os procedimentos cirúrgicos em condições assépticas. Por exemplo, autoclave os instrumentos cirúrgicos e os materiais da câmara.

Depois de sedar o camundongo receptor, remova os pelos de todo o lado dorsal usando um aparador elétrico e, em seguida, use gel depilatório. Enxágue a pele e seque-a. Por fim, esfregue a pele depilada com etanol.

Agora, marque uma linha central horizontal ao longo da coluna. Em seguida, posicione a janela de visualização pelo menos 2 mm abaixo da linha e marque o perímetro da janela na pele. Em seguida, usando um bisturi e uma tesoura, remova cuidadosamente a pele dentro da linha do perímetro sem danificar a fáscia subjacente.

Em seguida, puxe a dobra cutânea para cima e use um perfurador de orelha para introduzir orifícios de 1 mm em cada lado da área da janela para os parafusos que prendem a janela no lugar. Posicione a moldura traseira no mouse e prenda a moldura colocando as porcas nos parafusos. Em seguida, puxe a pele de dois a três milímetros sobre a moldura para garantir que ela se encaixe.

Nesse caso, enfie agulhas de calibre 23 nos dois orifícios de sutura na parte superior da estrutura. Prenda a estrutura apertando as porcas e segure-as com clampporta-agulhas não aperte demais as porcas e evite que a pele gire em torno dos parafusos. Em seguida, substitua as agulhas por suturas para prender a armação à pele.

Agora vire o mouse para o lado. A partir deste ângulo, introduza um pedaço grosso de vidro de enchimento e um vidro de cobertura padrão de 12 milímetros. Prenda ambos com um anel de retenção para que o painel fique firme contra o vidro.

O próximo passo é hidratar a janela usando cloreto de sódio a 0,9%. Deixe cair algumas gotas na área de visualização e absorva o excesso. Agora, logo abaixo da janela, use uma agulha de calibre 25 com uma curva de 90 graus para fazer uma bolsa profunda na fáscia que possa conter um milímetro cúbico de tecido tumoral.

Em seguida, insira o tecido tumoral na bolsa. Por fim, feche a janela view área usando uma lamínula padrão de 12 milímetros e um anel de retenção. Quaisquer bolhas de ar se dissiparão em uma hora.

Antes de sedar o mouse, aqueça uma plataforma personalizada com temperatura controlada a 37 graus Celsius. Depois de sedar o mouse, posicione-o na plataforma aquecida. Anexe um nariz para administrar isoflurano e, se a avaliação demorar mais de cinco minutos, faça uma consulta oftalmológica.

Agora, aparafuse a câmara usando os parafusos da janela no suporte feito sob medida e prenda o suporte na plataforma. Em seguida, limpe a janela de vidro com água e algodão. Agora, no microscópio, verifique o desenvolvimento do vaso no tumor usando a objetiva de 10 vezes, sob campo claro e luz fluorescente.

Após o exame macroscópico, ligue os lasers confocais. Defina o painel de controle do microscópio para um ganho inteligente de 100 volts por volta. Um deslocamento inteligente de 10% por volta, zoom médio posicionamento X e Y médio e 100 mícrons de posição Z por volta.

Defina o modo de aquisição como XYZ ou XYZT. Selecione uma resolução. Escolha uma velocidade de aquisição de dois ou 400 Hertz.

Defina o orifício para uma unidade arejada. E selecione a opção X bidirecional. Ao avaliar vários fluoróforos com uma possível faixa espectral sobreposta, selecione a varredura sequencial entre os quadros para evitar sangramento e defina os caminhos corretos do feixe.

Defina a média da linha como quatro e, por último, selecione um novo conjunto de dados para o experimento. Agora, concentre-se no tecido de interesse ao fazê-lo, é melhor usar lentes secas com aberturas numéricas mais altas. Em seguida, use a varredura rápida ao vivo para obter a melhor relação sinal-ruído possível, ajustando o ganho e o deslocamento para onde não haja superexposição.

Agora, selecione a pilha Z na guia Adquirir. Faça uma verificação Z rápida. A partir da verificação rápida, decida as posições inicial e final da verificação completa.

Em seguida, defina o tamanho do passo Z de acordo com o tamanho do orifício e prossiga com a varredura completa. Camundongos hospedeiros que expressam marcadores fluorescentes foram fotografados após o implante do tumor usando o protocolo descrito. O rótulo eNOStag-GFP se expressa no Golgi e na membrana celular das células endoteliais.

O rótulo ROSAmT / mG expressa a florescência vermelha de forma ubíqua e a florescência verde nas células que expressam Cre Recombinase. Uma aplicação dessa tecnologia é para o estudo do desenvolvimento de vasos, pois todos os estágios são vistos em tumores. Por exemplo, frentes endoteliais podem ser vistas brotando em áreas não vascularizadas.

Os tumores também têm vasos danificados e leitos vasculares estabelecidos com vasos ramificados maduros. Outra aplicação é estudar a formação de lúmens, o fluxo sanguíneo e o extravasamento aplicando marcadores no sangue, como nanopartículas fluorescentes. Assim, o fluxo sanguíneo pode ser observado no lúmen dos tubos vasculares e próximo às células da ponta endotelial.

Nas células da ponta, a formação de um lúmen o estoque é observável. A microscopia intravital também pode ser usada para investigar o efeito de agentes quimioterápicos. Por exemplo, 24 horas após a injeção de nanopartículas em um animal eNOStag-GFP, as nanopartículas permaneceram na vasculatura com extravasamento mínimo para o interstício tumoral.

No entanto, quando as nanopartículas foram administradas em combinação com TNF, foi observado extravasamento para o interstício tumoral. Esta é uma evidência de um aumento na administração intertumoral de medicamentos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como instalar uma câmara de janela de dobras cutâneas dorsais e como estudar processos relacionados ao tumor usando microscopia confocal.