Carregando uma tintura de cálcio em terminação de nervo de sapo através do coto nervoso: Registro de transientes de cálcio na união neuromuscular de sapo

Olá, meu nome é Dimitry Samigullin, trabalho no laboratório de Biofísica de Processos Sinápticos do Instituto de Bioquímica e Biofísica de Kazan, da Academia Russa de Ciências. Em nosso laboratório, estudamos vastas formas de sinalização de cálcio na Junção Neuromuscular. Um dos métodos mais acessíveis para medir o nível sináptico de cálcio é uma gravação óptica.

Aqui descrevemos o método de carregamento de um corante sensível ao cálcio, através de um coto nervoso, nas terminações nervosas da rã. Além disso, apresentamos o protocolo para medir e analisar um vasto transiente de cálcio em terminais de rãs. Usando este método, é possível estudar a influência de drogas ativas no nível pré-sináptico do cálcio durante a atividade sináptica.

Preparação da solução de carregamento de corante. O corante de cálcio da fluoresceína Oregon Green BAPTA, vem em 500 microlitros por meio de uma pequena quantidade de 500 microgramas de pó. Adicione 14 microlitros de solução, contendo HEPES, ao pó.

Solução de carregamento de vórtice e gire para baixo para misturar completamente. Envolva o frasco para injetáveis com a solução de carregamento com papel alumínio, para evitar a exposição à luz. Armazene a solução de carregamento a menos 20 graus Celsius, em um freezer.

Procedimento de carregamento de corante. Disseque um músculo cutâneo do peitoral do animal. Monte o tecido dissecado em uma placa de Petri forrada de prata.

Estique o tecido com pinos finos de aço inoxidável. Adicione a solução de Ringer à placa de Petri. Usando uma lâmina de barbear, corte um pequeno pedaço, cerca de 2 milímetros do tubo de pipeta de dez microlitros da extremidade fina.

Prepare um pedaço de plasticina para segurar a pipeta de enchimento na placa de Petri. Conecte a pipeta de enchimento com uma seringa de plástico através de um tubo de silicone e adaptadores feitos de tubos de pipeta. Remova a solução de Ringer temporária da placa de Petri com uma pipeta de plástico.

Preparação seca com uma seringa. Isso evitará a sucção da solução na pipeta de enchimento. Retire o frasco para injetáveis com a solução de carregamento do congelador e deixe descongelar à temperatura ambiente em local escuro.

Com uma pinça fina e tesoura, sob controle visual, com microscópio estéril, corte o nervo próximo ao músculo. Deixe cerca de dois milímetros de coto nervoso. Fixe a pipeta de enchimento com um tubo e a seringa, na placa de Petri usando plasticina.

Mova-o para perto do ramo nervoso. Aspire suavemente o coto nervoso na pipeta de enchimento. Remova o tubo de sucção da extremidade romba da pipeta de enchimento.

Seque o coto nervoso na pipeta de enchimento com a seringa. Suba a pipeta de enchimento com o coto nervoso. Isole o coto nervoso do lado de fora com vaselina.

Mais uma vez, seque o coto nervoso na pipeta de enchimento pela seringa. Desenhe os cinco microlitros de ponto zero da solução de carga usando uma pipeta com uma ponta de pipeta longa. Insira cuidadosamente a ponta da pipeta com a solução de carregamento na pipeta de enchimento.

Ejete a mistura diretamente para o coto nervoso. Sele a extremidade aberta da pipeta de enchimento com vaselina. Adicione uma pequena quantidade de solução na placa de Petri.

Incube a preparação em temperatura ambiente em local escuro e úmido por cinco horas. Após o procedimento de incubação, pegue a preparação e remova a pipeta de enchimento com a solução de carregamento. Coloque a preparação em um banho e lave com a solução de Ringer.

Mantenha o banho com o preparo durante a noite na geladeira a oito graus Celsius de temperatura. Prepare o tecido para microscopia. Pegue a preparação do banho.

Monte a preparação em uma câmara forrada de prata e estique levemente o tecido. Enxágue o lenço com solução de Ringer fresca. Pegue o eletrodo de estimulação de sucção.

Coloque o eletrodo de sucção de estimulação na câmara com a ponta próxima à extremidade cortada do nervo. Puxe o nervo para o eletrodo. A construção do eletrodo é descrita no artigo de Khazokoff, um link para o artigo está nos materiais.

Fixe a câmara de preparação na platina do microscópio. Coloque a sonda de temperatura. Conecte os tubos de entrada em um cabo de alimentação para o elemento Peltier na câmara de preparação.

Coloque o tubo de saída na câmara de preparação. Ligue uma bomba de perfusão. Ligue o termo unidade controladora.

Defina a temperatura na unidade controladora para atingir 20 graus Celsius. Instale o escudo de proteção ultravioleta. Configure a duração do atraso e o período no estimulador.

Conecte um fio do eletrodo de sucção com o estimulador. Ligue-o. Sob uma objetiva de baixa ampliação, verifique a contração muscular ligando o estímulo.

Encha o sistema de perfusão com uma solução de Ringer com baixo teor de cálcio e alto teor de magnésio. Defina a taxa de perfusão de cerca de dois mililitros por minuto. Substitua a objetiva por uma ampliação de 40 vezes.

Ligue o Polychrome V.Selecione o comprimento de onda de emissão e a iluminação do modo contínuo. Abra o obturador. Objetiva de ampliação inferior a 40 vezes, no modo de fluorescência, as iluminações garantem que os terminais sejam carregados.

Encontre o terminal e concentre-se nele. O nervo carregado e os terminais nervosos motores bem carregados estão representados na figura. Captura de vídeo com câmera Red-Short Neuro CCD.

Execute o software Turbo-SM. Selecione, Alterar configurações. O número de quadros de entrada é 500.

Insira o nome do experimento. A configuração básica é de 1000 quadros por segundo. 80 por 80.

Escolha o gatilho externo. Insira o tempo de pré-disparo. Menos dez milissegundos.

Digite o número de repetições, 20. No software Polychrome, selecione o modo de iluminação do gatilho externo. Execute o software Clampex.

Protocolo de estimulação de carga. O protocolo está disponível para download em nossa página de laboratório no site da Universidade Federal de Kazan. Antes de gravar, capture um quadro escuro no software Turbo-SM.

No cubo trinocular, selecione os níveis de troca do caminho da luz. 100 por cento para a câmera. Execute o protocolo de estimulação.

Selecione a região de interesse e verifique o sinal. Em resposta à estimulação nervosa, registramos a mudança na intensidade da fluorescência que reflete a entrada de cálcio na terminação nervosa. Análise de dados.

No software Turbo-SM, selecione file. Em seguida, selecione arquivos médios. Selecione os arquivos.

Insira o nome do arquivo médio e calcule-os a média. Salve o arquivo médio como arquivo de ajuste. Selecione, salve como arquivo de ajuste.

Digite o nome do arquivo e salve-o. Execute a imagem J e abra os instrumentos abaixo. Análise, ferramentas, ROI Manager.

Encontre o arquivo médio salvo no formato de ajuste. Arraste e solte-o na imagem J.Zoom a janela para uma melhor visualização. Selecione uma região retangular de interesse sobre o que você acredita ser o plano de fundo.

Adicione-o ao gerenciador de ROI. No ROI Manager, selecione mais. Multi-medida. Média de carga.

Copie dados, exporte para o Excel. No Excel, use a função média para calcular o valor médio do plano de fundo para uma proporção. Sem fechar o Excel, volte para a imagem J.Feche a janela com cálculo em segundo plano sem salvar.

Use o ROI Manager, exclua o desenho de fundo retangular. Processo de instrumento aberto, matemática, subtrair. Insira o valor médio calculado do limite do Excel e subtraia o solo das pilhas.

Selecione uma região retangular de interesse ao redor de um terminal nervoso. Adicione-o ao ROI Manager. No ROI Manager, selecione, mais, Multimedida, carregar para baixo, significar.

Copie e cole na janela do Excel. Use o gráfico gráfico do instrumento Excel. Selecione uma área plana antes de iniciar o sinal.

Carregue o gráfico com os detalhes desde os primeiros valores de fluorescência no repouso até o início do sinal. Em seguida, determine o número de pontos para valores médios de fluorescência em repouso. Faça a média desses valores e, em seguida, encontre o número médio da fluorescência no restante.

Divida os sinais por fluorescência no restante. Subtraia um e multiplique por 100%. Plote o sinal e calcule a amplitude do transiente de cálcio.

Os parâmetros de tempo dos sinais de fluorescência dependem da velocidade das reações diretas e/ou reversas da formação do complexo de corante de cálcio. O tempo de subida do sinal de cálcio representa a dinâmica da entrada de cálcio. É a difusão no terminal e a interação do cálcio com o corante.

O decaimento do transiente de cálcio depende da afinidade do corante e da taxa de tamponamento do cálcio e sua retirada. A análise da amplitude transitória do cálcio pode ser usada para estudar a influência de diferentes substâncias ativas na entrada de cálcio que participam da liberação de neurotransmissores. Esta técnica de carregamento é bem adequada para a imagem de alterações no cálcio citossomal.

Com indicadores fluorescentes e estimulação de um único nervo e atividade sináptica rítmica. A análise da amplitude transitória do cálcio pode ser usada para estudar a influência de diferentes substâncias na entrada de cálcio que participa da liberação de neurotransmissores. Existem alguns pontos importantes aos quais queremos prestar atenção.

O procedimento de incubação inclui duas etapas. Incubação em temperatura ambiente e na geladeira. É importante controlar o tempo de incubação com o corante à temperatura ambiente.

Dependendo do comprimento do coto nervoso, do corante e da temperatura da sala, o tempo de incubação pode variar. Se você superexpor os terminais pré-operatórios e as partes proximais, próximas ao coto do nervo, podem ficar sobrecarregadas. Devido à longa incubação na geladeira, o corante é distribuído uniformemente ao longo das terminações nervosas.

É essencial colocar o nervo na solução de carga do corante, dentro de alguns minutos após o corte, para permitir que o corante entre no nervo, uma vez que intervalos de tempo mais longos produziram carga ineficaz, presumivelmente devido ao recebimento do nervo fechado. Para reduzir a compartimentalização do corante, é possível usar a forma estendida do corante. É muito importante evitar a longa iluminação fluorescente do tecido, pois afeta sua sobrevivência.

Usamos a óptica Nomarski no canal de luz visível para procurar os terminais. Durante a gravação, limitamos a visão iluminada, pelo diafragma. A longa duração do processo de carregamento pode ser reduzida usando o carimbo do obturador do nervo.

Neste caso, pode ser utilizado micro-bypass de vidro.