Produção e Administração de Therapeutic-tronco mesenquimais / celular estromal (MSC) Spheroids condicionadas em culturas 3-D Sob Condições Xeno-livres

O objetivo geral desses experimentos é gerar e injetar de forma eficiente agregados esféricos terapêuticos, ou esferoides, de células-tronco mesenquimais/estromais, ou CSMs, previamente condicionadas em condições livres de componentes xenógenos para aplicações experimentais e clínicas. Esses métodos podem ajudar a superar grandes barreiras no campo da terapia com CSMs, como a baixa retenção celular, sobrevivência e funcionalidade, frequentemente observadas após o transplante de células dispersas e em condições adversas comumente associadas à lesão tecidual.

A principal vantagem desses procedimentos é que os esferoides de CMM podem ser preparados, primados e injetados na ausência de produtos animais imunogênicos, como o soro bovino fetal (FBS), o que atualmente limita algumas aplicações clínicas dessas células e também pode dificultar a interpretação de alguns dados pré-clínicos. Embora esse mecanismo seja potencialmente muito benéfico para mediar a eficácia baseada em CMM, ele também pode ser utilizado para compreender o reparo tecidual mediado por CMM e também como outras formulações de meio podem alterar o perfil terapêutico do genex plus. A demonstração desses procedimentos será realizada por Josh Beaver e Bret Clough, dois técnicos do meu laboratório.

Após semear e incubar as células-tronco mesenquimais, de acordo com o protocolo descrito, utilize tripsina e EDTA para colher as células, seguido de centrifugação das células colhidas a 450 vezes G. Combine todas as células em um único tubo cônico com o meio apropriado. Centrifugue as células e re-suspenda o pellet em um pequeno volume de meio. Em seguida, após a contagem das células, para gerar esferoides com aproximadamente 25.000 células, dilua as MSCs colhidas em um dos seguintes meios a 714 células por microlitro.

Em seguida, pipete gotas de 35 microlitros das células na parte inferior da tampa de uma placa de cultura invertida de 150 milímetros. Transfira 20 mililitros de PBS à temperatura ambiente para a base da placa e, com um movimento contínuo e firme, vire a tampa contendo as gotas de modo que os ápices das gotas fiquem voltados para baixo. Em seguida, coloque cuidadosamente a tampa sobre a base da placa de cultura.

Transfira a placa para a incubadora por três dias sem perturbá-la para permitir a montagem adequada das esferas. Após a incubação, inicie a colheita dos esferoides removendo cuidadosamente a tampa e invertendo-a para que as gotas fiquem novamente voltadas para cima. Em seguida, incline a tampa em um ângulo de aproximadamente 10 a 20 graus e use um levantador celular para empurrar as gotas contendo os esferoides até a borda da placa.

Usando uma pipeta de um mililitro, transfira o meio do final da esfera para um tubo cônico de 15 mililitros e utilize PBS à temperatura ambiente e a mesma ponteira da pipeta para lavar a placa, garantindo a recuperação máxima dos esferoides. Para ensaios de PCR em tempo real, centrifugue a suspensão de esferoides a 450 vezes G à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, aspire o sobrenadante.

Com PBS, lave os esferoides e repita ambos os passos de centrifugação e aspiração. Para entrega em animais, permita que as esferas sedimentem no fundo do tubo sem centrifugação. Para coletar o meio condicionado, ou meio CM para ensaios de potencial imunomodulador e anti-câncer, utilizando um espátula celular e pipeta conforme demonstrado anteriormente, recolha os esferoides e o meio CM em um tubo cônico de 15 mililitros.

No entanto, não lave as tampas com PBS. Após centrifugação a 450 vezes G durante 5 a 10 minutos, transfira o sobrenatante para tubos de 1,5 mililitro. Centrifugue o sobrenatante a 10.000 vezes G e temperatura ambiente por 5 a 10 minutos.

Em seguida, utilize uma pipeta para coletar cuidadosamente o CM clarificado em novos tubos de 1,5 mililitro para armazenamento a menos 80 graus Celsius. Após preparar os esferoides conforme demonstrado neste vídeo e aguardar três a quatro minutos para que sedimentem no fundo do tubo, aspire o sobrenadante e lave os esferoides adicionando HBSS suplementado com 0,2 a 0,5% de HSA para manter condições livres de xênicos. Em seguida, aspire o sobrenadante.

Cubra os esferoides com 100 a 200 microlitros de HBSS/HSA estéril e coloque os tubos sobre gelo. Após anestesiar um camundongo de acordo com o protocolo descrito, posicione o animal dentro da cabine BSL-2 com a face dorsal voltada para baixo e utilize etanol 70% para desinfetar o abdômen inferior do camundongo. Remova a tampa de um cateter intravenoso de 20 gauge e, segurando a pele do camundongo com uma das mãos, localize o ponto médio de uma linha imaginária que conecta a articulação do joelho flexionado à região genital; com a ponta da agulha do conjunto do cateter voltada para a linha média, utilize a outra mão para realizar uma injeção intraperitoneal.

Remova cuidadosamente a agulha metálica do conjunto da agulha guia do cateter. Verifique a presença de sangue, urina e fezes na agulha e descarte-a. Confirme a colocação correta do cateter plástico inserindo uma ponteira de pipeta de 100 a 200 microlitros com 100 microlitros de HBSS/HSA estéril no adaptador do cateter, formando um selo hermético.

Em seguida, injete lentamente o fluido dentro da cavidade peritoneal. Com uma ponteira de pipeta de 100 a 200 microlitros, colete os esferoides de MSA e o HBSS/HSA e transfira todo o volume para a cavidade peritoneal através do cateter, conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, com 100 microlitros de HBSS/HSA, lave o tubo que contém as esferas e transfira todo o volume de esferas para a cavidade peritoneal.

Coloque uma gaze embebida em antisséptico sobre o cateter e remova lentamente o cateter da cavidade peritoneal, descartando-o em seguida. Inspecione o cateter para verificar a presença de esferoides remanescentes. Em seguida, massageie suavemente a cavidade peritoneal com os dedos para garantir a distribuição uniforme dos esferoides.

Imediatamente após a administração dos esferoides nos camundongos, avalie o nível de ativação dos esferoides preparados para injeção transferindo de 40 a 120 esferas para o cateter em uma placa de 12 ou 6 poços contendo um a dois mililitros de MEM alfa suplementado com 2% de FBS e penicilina-estreptomicina 1X. Seis horas depois, transfira o meio dos poços para tubos de 1,5 ou 15 mililitros e centrifugue os tubos a 450 × g e temperatura ambiente por cinco minutos. Por fim, transfira o CM clarificado para novos tubos de 1,5 mililitro e utilize um kit comercial de ELISA de acordo com o protocolo do fabricante para dosar a concentração de PGE-2.

Como visto aqui, quando aproximadamente 25.000 CMMs são suspensas em gotas de 35 microlitros de MCC, as células primeiro se organizam em agregados pequenos, mas eventualmente coalescem para gerar uma única esfera compacta no ápice da gota após 72 horas. Esta figura demonstra que a formação de esferas compactas únicas e XFM-1 requer suplementação com 13 miligramas por mililitro de HSA, uma concentração que reflete o conteúdo estimado total de proteína na MCC. Durante a montagem da esfera, o fenótipo das CMMs muda radicalmente e, quando em meio quimicamente definido livre de componentes xenógenos apropriado, a expressão de diversos fatores anti-inflamatórios, incluindo PGE2 e TSG6, é aumentada.

No entanto, a produção de TSG6 e PGE2 não é acentuadamente aumentada em MSCs cultivadas como esferoides em XFM-2 ou XFM-1 sem HSA. Por fim, de forma semelhante aos efeitos in vitro, esferoides de XFM-1 com HSA injetados na cavidade peritoneal de camundongos, imediatamente após a indução de inflamação sistêmica pela administração IV de LPS, aumentaram os níveis de PGE2 e IL-10 no peritônio, ao mesmo tempo em que reduziram o TNF alfa pró-inflamatório. Após dominar a técnica, cada placa de gotas suspensas pode ser preparada em um a dois minutos.

E a administração intraperitoneal de esferoides intactos pode ser concluída em 5 a 10 minutos por animal quando realizada corretamente. Ao produzir esferoides de MSCs utilizando a técnica de gota suspensa, é importante lembrar que diferentes formulações de meio livre de xeno não são iguais no que diz respeito à formação de esferas e à potencialização da expressão de genes terapêuticos. Após este procedimento, outros métodos, como a microscopia confocal, podem ser utilizados para compreender a organização das MSCs nos esferoides e também quais vias de sinalização adicionais podem estar ativadas nas MSCs em diferentes regiões do esferoide.

Após esse desenvolvimento, este método permitiu que os cientistas das CMM estudassem outras condições de cultivo tridimensionais e como elas afetam o condicionamento das CMM e a expressão gênica terapêutica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como condicionar CMM como esferoides utilizando a técnica da gota suspensa, como avaliar sua eficácia terapêutica in vitro e como entregar efetivamente esferoides intactos em camundongos para testes de eficácia in vivo. E não se esqueça de que o trabalho com células-tronco humanas adultas requer equipamentos especiais e treinamento, e pode ser perigoso se as células não forem manipuladas corretamente.

É necessário usar EPI apropriado em todos os momentos ao manipular células-tronco humanas adultas.