Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

O objetivo geral deste procedimento é identificar alterações no número de cópias de DNA em escala de megabase em células individuais. Para categorizar a heterogeneidade genômica em populações de células, é necessário identificar alterações genômicas na resolução de uma única célula. Tradicionalmente, isso era alcançado usando abordagens citológicas, no entanto, esses métodos eram limitados em sua sensibilidade e especificidade.

O sequenciamento de célula única pode detectar uma variedade de alterações genômicas, com sensibilidade e especificidade aprimoradas em relação às abordagens anteriores, mas somente quando executadas com cuidado. Aqui, descrevemos como usar o sequenciamento de célula única para detectar de forma confiável alterações no número de cópias em escala de megabase em células únicas. Para montar o microaspirador, comece removendo a extremidade de plástico transparente do conjunto do tubo do aspirador e insira a extremidade estreita em uma extremidade de um tubo de PVC de trinta centímetros de comprimento com um diâmetro interno de 3/16 de polegada.

Insira a saída de um filtro de seringa de 0.2 micrômetro na outra extremidade do tubo de PVC de um pé de comprimento com um diâmetro interno de 3/16 de polegada. Em seguida, insira a entrada do filtro de seringa de 0.2 micrômetro em uma extremidade de um tubo de PVC de seis polegadas de comprimento com um diâmetro interno de 5/16 de polegada. Quebre uma pipeta sorológica plástica de cinco mililitros na graduação de um mililitro e insira a extremidade quebrada na extremidade aberta do tubo de PVC com o diâmetro interno de 5/16 de polegada.

Em seguida, insira a saída da pipeta sorológica de plástico de cinco mililitros na extremidade flexível de um conjunto de tubo aspirador e, em seguida, use um tubo de plástico estéril para cobrir o bocal vermelho do conjunto do tubo para armazenamento. Puxe um tubo capilar de vidro para um diâmetro interno de 10-30 micrômetros, posicionando o meio do tubo próximo a uma chama e aplicando tensão em cada extremidade do tubo. Quebre o tubo desenhado em duas metades para criar duas agulhas aspiradoras em potencial.

Repita esta etapa com vários tubos para garantir que agulhas suficientes sejam preparadas com um diâmetro interno apropriado para a coleta de células individuais. Para preparar células de aderência, como linhagens celulares de fibroblastos humanos, colha células por tripsinização e transfira as células para um tubo cônico contendo o meio apropriado. Configure uma capa para amplificação do genoma inteiro usando alvejante a 10% para pulverizar a superfície da capa, caixas de ponteiras de pipeta e ponteiras de pipeta.

Em seguida, use uma toalha de papel para limpá-los antes de repetir a lavagem com etanol a 70%. Adicione oito microlitros de água do kit de Amplificação do Genoma Completo, ou WGA, a poços individuais em uma placa de PCR de 96 poços. Em seguida, cubra a placa de PCR de 96 poços com uma tampa de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços e coloque a placa no gelo.

Em seguida, adicione 1.000 células a 10 mililitros de meio ou PBS em uma placa de Petri de 15 centímetros e coloque a placa no gelo para evitar que as células adiram à placa. Em seguida, ainda no gelo, transfira as células da placa de Petri e da placa de PCR de 96 poços para um microscópio óptico com objetiva de 10X. Aumente a abertura da agulha do aspirador batendo suavemente a extremidade estendida da agulha em uma superfície dura para que a ponta se quebre.

Em seguida, insira a extremidade larga da agulha na extremidade transparente do microaspirador. Em seguida, coloque a placa de Petri contendo células no microscópio stage. Insira o bocal vermelho do aspirador na boca.

Então, durante o uso, era necessário mover a agulha do aspirador e a outra mão para mover a placa de Petri, identificar células individuais a serem sequenciadas. Usando a sucção bucal, puxe uma única célula para a agulha do aspirador junto com aproximadamente um a dois microlitros de meio ou PBS. Transfira a célula para os oito microlitros de água em um único poço da placa de PCR de 96 poços.

A qualidade e a utilidade dos dados de sequenciamento de células únicas dependem do estado de cada célula e de seu genoma, portanto, tome cuidado durante a preparação celular e microaspiração para isolar células viáveis e não apoptóticas. Depois de aspirar cada célula e transferi-la para um poço da placa de PCR, marque o poço que recebeu uma célula. Repita isso para o número desejado de células.

Enquanto isso, descongele o tampão de fragmentação de lise de célula única 10X do kit de amplificação do genoma inteiro. Para evitar a contaminação durante a amplificação do genoma completo, adicione todos os reagentes dentro de uma capa de cultura de tecidos. Use ponteiras de pipeta com filtros e troque a ponteira da pipeta entre os poços.

Para cada conjunto de até 32 células, combine 32 microlitros de tampão de lise e fragmentação de célula única 10X e dois microlitros de solução de proteinase K em um tubo de microcentrífuga e, em seguida, vórtice o tubo para misturar o conteúdo. Adicione um microlitro da solução a cada poço e pipete para cima e para baixo para misturar. Cubra a placa e use filme plástico para selar todos os poços.

Em seguida, centrifugue brevemente a placa em um mini centrifugador de placas. Em seguida, passe a placa pelo termociclador usando o seguinte programa. Em seguida, resfrie o prato no gelo e centrifugue-o brevemente.

Para preparar uma solução tampão de preparação de biblioteca de trabalho do kit de amplificação do genoma completo, para cada célula, combine dois microlitros de 1X tampão de preparação de biblioteca de célula única e um microlitro de solução de estabilização de biblioteca. A lise celular adequada e a fragmentação completa do genoma são essenciais para minimizar o viés durante a amplificação do genoma completo e garantir a preparação de bibliotecas de sequenciamento de alta qualidade. Como tal, tome cuidado para executar essas etapas exatamente como estão escritas.

Retire o filme plástico do prato e adicione três microlitros da solução a cada poço. Pipete o conteúdo do poço para cima e para baixo para misturar e, em seguida, substitua o filme plástico. Depois de girar brevemente a placa, incube as células a 95 graus Celsius por dois minutos, depois resfrie a placa no gelo e centrifugue brevemente a placa novamente.

Agora, remova o filme plástico, adicione um microlitro de enzima de preparação de biblioteca a cada poço e pipete o conteúdo do poço para cima e para baixo para misturar e, em seguida, substitua o filme plástico. Depois de girar brevemente a placa, coloque-a no termociclador e execute o seguinte programa. Depois de resfriar a placa e dar uma breve rotação, prepare uma mistura de amplificação funcional do kit de amplificação do genoma completo combinando 48,5 microlitros de água, 7,5 microlitros de master mix de amplificação 10X e 5 microlitros de WGA DNA polimerase, para cada célula.

Mantenha a mistura de trabalho no gelo. Remova o filme plástico da placa. Adicione 61 microlitros da mistura de amplificação de trabalho a cada poço e pipete o conteúdo de cada poço para cima e para baixo para misturar e, em seguida, substitua o filme plástico.

Centrifugue brevemente a placa e o termociclo da seguinte forma. Sequencie as amostras e realize a análise dos dados de acordo com o protocolo de texto. Conforme demonstrado nesta figura, se a amplificação do genoma completo for bem-sucedida, a amostra aparecerá como um esfregaço em um gel de agarose.

Um esfregaço fraco ou ausente indica uma reação de amplificação fracassada e a amostra não deve ser sequenciada. Como mostrado aqui, a análise dos tamanhos dos fragmentos foi realizada por meio de eletroforese capilar em um analisador de fragmentos. Bibliotecas preparadas com sucesso terão uma distribuição bastante uniforme de tamanhos de fragmentos de 150 a 900 pares de bases.

A falha na preparação da biblioteca resultará em uma distribuição de tamanho de fragmento distorcida e essas bibliotecas não devem ser sequenciadas. Usando o modelo oculto de Markov e a segmentação binária circular, o genoma de cada célula foi analisado em segmentos de número estimado de cópias. Esta tabela mostra os resultados sobrepostos de uma única célula e revela um ganho no cromossomo 10 de 67 a 130 megabases, e um ganho no cromossomo 19 de 0 a 20 megabases.

O isolamento e a amplificação do genoma completo de células individuais podem e devem ser realizados em um único dia. A preparação de bibliotecas de sequenciamento, sequenciamento do genoma completo e análise de dados pode ser realizada em um cronograma flexível. Quando o isolamento celular e a amplificação do genoma completo são realizados corretamente, e a análise dos dados é realizada rigorosamente conforme descrito, as alterações no número de cópias que excedem cinco megabases podem ser detectadas com alta sensibilidade e especificidade.

Embora nosso protocolo descreva especificamente o uso de sequenciamento de célula única para a detecção de alterações no número de cópias, aspectos desse protocolo, como isolamento de célula única e preparação de biblioteca, podem ser aplicados para detectar outras alterações genômicas.