Name: Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis meio de uma levedura Screen Two-hybrid (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Descubra interações proteicas entre efetores bacterianos e proteínas hospedeiras de Malus domestica usando o método de dois híbridos em levedura. Esta técnica permite identificar mecanismos moleculares da Doença da Proliferação da Macieira.

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Agradecemos Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner, e Florian Senoner do Centro de Pesquisa Laimburg e Mirelle Borges Dias Schnetzer de Dualsystems Biotech AG para apoio técnico e Julia Strobl pela revisão do manuscrito. Este trabalho foi realizado como parte do projeto APPL2.0 e foi parcialmente financiado pela Província Autónoma de Bozen / Bolzano, Itália e Apple Consórcio Sul tirolesa.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Na tela de Y2H, a proteína efectora potencial é co-expressa com diferentes proteínas que interagem hipotéticas (passo 7). Cada clone de levedura crescendo contém a isca, mas um (potencialmente) interagente diferente. As proteínas que interagem são codificados numa biblioteca de ADNc que foi clonada em plasmídeos de presa. A isca ea presa plasmídeos cada código de co-cistronically para uma parte de um factor de transcrição de levedura. No caso de uma interacção física entre o isco (efector) e um interactor codificada pelo plasmídeo presa, as duas partes do factor de transcrição (o domínio de ligação de ADN e o domínio de activação) são unidos, e a expressão do gene repórter é induzida. A levedura é capaz de crescer em placas de selecção SD histidine- e empobrecido-adenina. O tipo de biblioteca de ADNc de presa é dependente do efector rastreados e devem ser escolhidos em conformidade. O vector isco e presa, assim como a estirpe de levedura, devem ser compatíveis. Nesta tela, o domínio ea domai activação Gal4 de ligação a DNA LexAN foram utilizados como as unidades do factor de transcrição de levedura compatíveis. A biblioteca de cDNA podem ser construídos individualmente, feito à medida, ou obtidos comercialmente. A preparação da biblioteca presa cDNA não faz parte do presente protocolo. Neste protocolo, uma biblioteca de cDNA normalizada auto-construídas a partir do ARN das folhas domestica x Malus foi usada e clonado em pGAD-HA 41. O efector (isca) -expressing estirpe de levedura foi transformada com a biblioteca de presa, e os clones foram seleccionados em placas de selecção SD histidine- e empobrecido-adenina. Para extrair ADN de plasmídeo a partir das colónias de levedura, um plasmídeo de DNA Mini Kit à base de coluna para as bactérias é recomendada em combinação com um passo de ruptura mecânica utilizando esférulas de vidro para melhorar a lise de levedura (passo 8). Neste purificação do plasmídeo, a isca e o vector presa serão purificados simultaneamente em concentrações relativamente baixas. No entanto, a quantidade de DNA de plasmídeo é suficiente para identificar o parceiro de interacção através de sequenciação witHout propagação plasmídeo antes (passo 8.4). Como alternativa, o ADN purificado no passo 8.4 pode ser transformado em competentes de E. coli e com a resistência aos antibióticos seleccionados mediada por vector de presa (por exemplo, ampicilina no caso de o pGAD-HA). A E. coli seleccionada colónias transportar apenas o plasmídeo biblioteca pGAD-HA, e a purificação do plasmídeo de alto rendimento podem ser realizadas com estes clones. A transformação bem-sucedida de construções pLexA-N e pGAD-HA complementa o triptofano e leucina auxotrofia de NMY51. Uma interacção entre o efector e uma proteína (codificada no pGAD-HA) conduz à activação do sistema repórter em estirpes NMY51. No caso de auto-activação, NMY51 transformada com o efector expressando pLexA-N em combinação com o vector de biblioteca vazio pGAD-HA cresce em placas selectivas falta Trp-Leu-His-ade, devido à activação indesejada do sistema repórter NMY51 40. A auto-ativação pode ser wEAK e pode ocorrer na ausência de Trp-Leu-His, ou a activação pode ser forte e caracteriza-se por crescimento em placas de Leu-Trp-His-ade 41. Auto-ativação pode causar um fundo maciço de clones falso-positivos na tela Y2H real. Para evitar isso, deve ser realizado um teste de auto-activação com a isca, em que o vector que expressa efectora é co-transformada com o vector vazio biblioteca. Nesta configuração experimental, a expressão do gene repórter não deve ser induzido. Se o auto-activação (isto é, crescimento em placas selectivas) é visível no teste, o meio pode ser suplementado com diferentes concentrações de 3-amino-1,2,4-triazole 45 (3-AT). 3-AT é um inibidor da desidratase imidazoleglycerol-fosfato (HIS3), uma enzima importante na biossíntese de histidina 46. A suplementação com 3-AT pode reduzir os efeitos fracos de auto-activação durante 47 Y2H telas,48. Diferentes concentrações de 3-AT deve ser testado. Neste protocolo, 1 - foram utilizados 40 mM 3-AT. A concentração mais baixa que leva à repressão da auto-ativação deve ser posteriormente utilizado na tela de Y2H. As placas selectivas do ensaio de auto-activação só pode ser avaliada, se as placas de SD-Trp-Leu do co-transformação contêm um número suficiente de clones. Como uma indicação ≥ 500 colónias por 90 mm (diâmetro) placa de Petri são suficientes. Para determinar a eficiência de transfecção exacta, recomenda-se para preparar diluições em série de levedura co-transformadas e espalhá-los em placas de SD-Trp-Leu. Para reduzir a auto-activação, o efector pode ser clonado pLexA-C, um vector de expressão de isca que funde a etiqueta de LexA para o C-terminal da proteína. A orientação do Lex-A tag pode atenuar auto-ativação 24. No entanto, isso não é possível em todos os casos para reduzir ou abolir a auto-activação. A formação decolónias vermelhas ou avermelhadas indica uma interação fraca ou falso-positivo. O gene repórter de ADE2 NMY51 só é activada quando se trata de uma interacção proteína-proteína, o que por sua vez bloqueia a acumulação de um corante vermelho nesta estirpe de levedura 40. Na ausência de interacção, NMY51 são avermelhada, enquanto que as colónias possuindo interactores fortes são brancos. A observação da cor das colónias nas placas de selecção proporciona, assim, uma outra sugestão importante para avaliar se as respectivas colónias são interactores ou verdadeiro-falso-positivos. É, eventualmente necessário adaptar ou modificar certas configurações de ensaio no que respeita à natureza do isco e as características de interacção. Até agora, um certo número de melhoramentos e técnicas de derivados do Y2H comum foram estabelecidas para permitir a análise de interacções entre proteínas bastante difíceis em diferentes sistemas hospedeiros. A revisão por Stynen et al. 49 endereços de umnd descreve diferentes aspectos da Y2H, suas melhorias e adaptações, e, portanto, fornece informações úteis sobre como escolher o ensaio de interação adequada. telas y2h e técnicas derivados tornaram-se amplamente utilizado em diferentes campos de pesquisa, onde é necessária a identificação de interações proteína binários. Mesmo se os controles críticos sejam executadas, tais como testes de auto-ativação da isca e um-para-um re-transformações das proteínas que interagem identificados, a Y2H é propenso a produzir falsos resultados 26, 50, 51. A levedura como um modelo não é adequado para todos os estudos de interacção. Levedura não constitui necessariamente um ambiente celular que suporte a modificação pós-tradução adequada e dobrável para todas as proteínas 24. Além disso, na configuração Y2H, as proteínas são sobre-expressos, e a sua expressão não é controleliderados por seu promotor natural. O Y2H obriga os parceiros de interacção proteicos para o núcleo, o qual não é necessariamente o seu destino subcelular natural. As circunstâncias celulares nativas da interação, portanto, não pode ser refletida pela levedura e pode levar a resultados falso-negativos ou falso-positivos. A maior parte são baseados em Y2H complementação levedura auxotrofia como princípio selectivo. Esta selecção nutricional caracteriza-se por sensibilidade elevada, mas à custa da diminuição da selectividade em comparação com outros (por exemplo, repórter cromogénico) ensaios 49. Se o auto-activação unreducible (ver acima) ou outras limitações ocorrer durante um certo efectora, o Y2H não é um ensaio apropriado 25. Na Tabela 1 e na Figura 1, os resultados esperados do teste de auto-activação são dadas. A ausência de interacções real (isto é, os falsos negativos) pode ser causado pela toxicidade da proteína, a proteína de translação incorrectaprocessamento, o impedimento estereoquímico da interacção, parceiros de interacção sub-representados na biblioteca de presa, a localização da membrana da isca, em falta ou componentes necessários para a interacção 24. Recomenda-se de novo amplificar o gene de comprimento total da proteína que interage identificados a partir de ADNc, subclonar-lo em pGAD-HA, e realizar um ensaio de interacção de um-para-um, transformando o gerado pGAD-HA arquétipo na isca que expressam estirpe NMY51. Isto é necessário uma vez que a observada interactor presente na biblioteca de presa pode ser apenas um fragmento de uma proteína maior. No entanto, a informação para o respectivo gene completo somente é acessível se considerável de dados de sequência genômica e transcriptomic está disponível. O protocolo de transformação para o ensaio de auto-activação descrito aqui pode ser aplicado para um tal ensaio de um-para-um, e a interacção entre a isca e interactor deve ser reprodutível. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Interações identificados em uma tela Y2H deve sempre ser confirmado por uma outra técnica independente. Esta técnica independente deve estar mais perto do cenário natural da interação proteína-proteína real. No caso do ATP_00189 phytoplasmal efetoras, a interação com os fatores de transcrição TCP de Malus x domestica foi verificada in planta com complementação fluorescente bimolecular (BiFC) em Nicotiana benthamiana protoplastos 28 (não faz parte deste protocolo). O ATP_00189 proteínas efetoras foi derivado da planta patógeno P. mali. Em BiFC planta foi assim escolhido para verificar as interações ATP_00189 com os fatores de transcrição x Malus domestica anteriormente identificada na Y2H 28. BiFC é um ensaio de interacção proteína-proteína que não requer a translocação subcelular das proteínas que interagem para o núcleo, a fim de activar o sistema repórter &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 52. Além disso, as in planta de expressão e de máquinas modificação imita o ambiente da interação natural entre o efetoras bacteriana planta em sua planta hospedeira. No entanto, uma tela global, utilizando BiFC não é viável. Existem várias etapas no protocolo que deve ser cuidadosamente abordada. Ao amplificar o gene de interesse (Passo 4), é importante excluir a possibilidade de os iniciadores se ligam a DNA da planta. Assim, o ADN a partir de plantas não-infectadas deve ser incluído como um controlo negativo. A sequência do gene de interesse não tem de conter os locais de restrição EcoRI e Sall que são usados ​​para a clonagem direccional do inserto. Se a sequência não conter estes locais, diferentes enzimas de restrição para a clonagem deve ser escolhido. transformação de levedura é um método central durante este protocolo. A eficiência de transfecção depende da competência das células de levedura, a sua viabilidade, o estado de crescimento, e a qualidade do Reag transfecçãoent 53, 54. Para o protocolo proposto, é altamente recomendado o uso de leveduras a partir de placas frescos não mais de duas semanas (mantida a 4 ° C) ao realizar as transformações. Muitas vezes, o crescimento de leveduras transformadas é retardada quando as culturas líquidas selectivos são inoculados com as colónias de placas de agar de idade. É também útil utilizar uma cultura de arranque de líquido como um inoculo para as experiências reais e não usar a levedura directamente a partir da placa. Baixa eficiência quando transfecção da presa em levedura expressando isca pode levar à sub-representação de certas proteínas da presa (potenciais interatores) e pode, assim, deforme toda a tela. Neste protocolo, a eficiência de transfecção de levedura de ~ 150.000 ufc / g de ADN transfectado no Y2H funcionou bem. Conhecer as falhas e os inconvenientes da técnica Y2H e interpretar os resultados de forma crítica e adequada é indispensável para desenhar o correct conclusões. ensaios Y2H e os seus derivados têm sido utilizadas há muitos anos e têm sido objecto de muitas melhorias e adaptações no que respeita às diferentes características de isco, a localização subcelular da interacção, os parceiros de ligação esperados, e outros factores que possam ser necessários para a interacção (ver Y3H 55, 56, 57). Recentemente, telas Y2H baseadas em matrizes que têm sido desenvolvidos para permitir a análise automatizada, de alto rendimento de numerosas iscos contra milhões de presas 58. O futuro provavelmente reside nas abordagens de automatização e de alto rendimento para este ensaio para permitir a elucidação das vias de sinalização complexas e interactoma em diferentes áreas de investigação.

<html> Levedura telas de dois híbridos (y2h) foram desenvolvidos cerca de 27 anos atrás 1 e já foram amplamente utilizado em vários campos para determinar interações específicas proteína-proteína 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . A interacção física de um efector bacteriana com uma proteína alvo do hospedeiro muitas vezes é a condição prévia para a manipulação funcional desta proteína alvo. Analisando essas interações mudou-se para o foco de diversos setores da infecção biologia 12, 13, 14, 15,&quot;&gt; 16, 17, 18. O princípio da tela de Y2H é que a interacção entre duas proteínas leva à reconstituição de um factor de transcrição funcional, que dirige a expressão de genes repórter. O efector conhecido (o&quot; isco &quot;) é fundida na tradução com para o domínio de ligação de DNA (DBD) do factor de transcrição, e os potenciais parceiros de interacção (o &quot;presas&quot;) está fundida com o domínio de activação (AD) do respectivo factor de transcrição. uma vez que o parceiro de interacção é desconhecida, uma biblioteca de potenciais interactores é clonado no assim chamado &quot;presa-biblioteca&quot;. Normalmente, esta biblioteca é feita por clonagem de ADNc num plasmídeo adequado expressão presa vector que codifica o anúncio que é compatível com a isca-vector codificado DBD. no caso de uma interacção, o factores de transcrição reconstituída induzir a expressão de genes repórter, que geralmente permitem a selecção de crescimento de levedura. oidentificação dos interactores é obtida por sequenciação do plasmídeo presa com iniciadores específicos para o plasmídeo. As bactérias desenvolveram várias estratégias para manipular e explorar o metabolismo do seu hospedeiro ou para fugir mecanismos de defesa e secretam moléculas efetoras através de diferentes sistemas de secreção bacterianas 19, 20, 21. Determinando os parceiros de ligação destes efectores bacterianas é, assim, o primeiro passo para identificar a via manipulada no hospedeiro. Isto leva a uma melhor compreensão dos mecanismos de patogenicidade específicos. Y2H telas são realizadas para identificar interacções bacterianas efectoras durante phytoplasmoses, e, muitas vezes, Y2H é uma experiência inicial crucial para a posterior caracterização dos mecanismos moleculares de patogenicidade em investigação phytoplasma 22, 23. No entanto, o metA inscrição hod na maioria das publicações é bastante escassa, e essas técnicas muitas vezes são terceirizadas para empresas de biotecnologia. Para chamar a atenção para a viabilidade deste método, este protocolo fornece informações passo-a-passo para identificar parceiros de interação de uma molécula efectora bacteriana em seu hospedeiro natural. Apesar da ampla utilização e a abordagem de avanço rápido de telas y2h, não se deve esquecer que certas interações podem não ocorrer no sistema de levedura. Isto é devido ao facto de a célula de levedura é usado como uma espécie de &quot;in vivo vaso de reacção&quot; com certas limitações biológicas. Vários autores têm abordado as vantagens e desvantagens de Y2H e seus derivados 11, 24, 25, 26, 27. Considerações gerais são, por exemplo, que a célula de levedura pode não proporcionar a adequadaa expressão do gene, (pós-) translacional, ou condições translocational para as respectivas proteínas em estudo. Isso pode levar a resultados falso-negativos na tela. Interacções positivas podem por sua vez ser artefactos e pode não ocorrer na situação natural (ou seja, em caso de efectores no hospedeiro apropriado). É, portanto, indispensável para confirmar as interacções do sistema de expressão de levedura heteróloga com um teste de interacção independente num sistema biológico mais intimamente relacionados. Neste estudo, foram identificados os parceiros de ligação do ATP_00189 efetoras do patógeno de planta não-cultiváveis Candidatus Phytoplasma mali (P. mali). Os resultados fornecem importantes insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento dos sintomas da proliferação de maçã 28, uma doença que causa grandes perdas econômicas em regiões de cultivo de maçã afetados na Europa 29.

<table><tbody><tr><td>Brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB)</td><td>Applichem</td><td>A6284</td><td>para preparação de DNA</td></tr><tr><td>Trishidroximetilaminometano (Tris)</td><td>Applichem</td><td>A2264</td><td>para meios e tampão</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Applichem</td><td>A2942</td><td>para meios e tampão</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético Sal dissódico (NaEDTA)</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td>para meios e tampão</td></tr><tr><td>N-Lauroilsarcosina sal de sódio</td><td>Applichem</td><td>A7402</td><td>para preparação de DNA</td></tr><tr><td>acetato de amônio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>9688</td><td>para preparação de DNA</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Applichem</td><td>A1108</td><td>para preparação de DNA</td></tr><tr><td>Isopropanol (2-Propanol)</td><td>Applichem</td><td>A3928</td><td>para preparação de DNA</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>51976</td><td>para preparação de DNA</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Applichem</td><td>A2760</td><td>para preparação de DNA</td></tr><tr><td>Clorofórmio: Isoamil 24: 1</td><td>Applichem</td><td>A1935</td><td>para preparação de DNA</td></tr><tr><td>Revisão de polimerase (por exemplo iProof)</td> <td>Bio-Rad</td><td>203433</td><td>para PCR</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0271</td><td>para clonagem</td></tr><tr><td>SalI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0641</td><td>para clonagem</td></tr><tr><td>Kit de purificação de DNA baseado em coluna (por exemplo QIAquick)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>para clonagem</td></tr><tr><td>de Sulfato de Canamicina</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>para seleção microbiológica</td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8056</td><td>para ensaio de autoativação</td></tr><tr><td>Monocloridrato de L-Arginina&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3680</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>L-Isoleucina&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3642</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>L-lisina Monohidratada&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3448</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>L-Metionina&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3897</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>L-fenilalanina&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3464</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>L-Treonina&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3946</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>L-Tirosina&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3401</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>L-Uracile</td><td>Applichem</td><td>A0667</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>L-Valine&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3406</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>L-Adenina Hemisulfato Sal&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1596</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Filtro de Poros</td><td>Sartorius</td><td>16541</td><td>para filtração estéril</td></tr><tr><td>Monocloridrato de L-Histidina</td><td>Applichem</td><td>A3719</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>L-Leucina&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3496</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>L-Triptofano&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3410</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>Base de Nitrogênio de Levedura&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51483</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>D-Glucose Monohidrato&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1349</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2641-1</td><td>para cultura de levedura e bactéria</td></tr><tr><td>Peptona</td><td>Applichem</td><td>A2208</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>Polietilenoglicol 4000 (PEG)</td><td>Applichem</td><td>A1249</td><td>para transformação de levedura</td></tr><tr><td>Acetato de Lítio Dihidratado (LiOAc)</td><td>Applichem</td><td>A3478</td><td>para transformação de levedura</td></tr><tr><td>DNA de esperma de salmão&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A2159</td><td>para transformação de levedura</td></tr><tr><td>Anticorpo contra etiqueta Lex-A (por exemplo região de ligação ao DNA Anti-LexA)</td> <td>Millipore</td><td>06-719</td> para <td></td></tr><tr><td>kit Miniprep de plasmídeo de Western blot ( por exemplo Kit Miniprep de plasmídeo GenElute)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>PLN350</td><td>para purificação de plasmídeo de leveduras e bactérias</td></tr><tr><td>Contas de vidro lavadas com ácido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>para purificação de plasmídeo de levedura</td></tr><tr><td>Ampicilina Sal de Sódio</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td>para seleção microbiológica</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>Centrífuga concentradora a vácuo (por exemplo Concentrador 5301)</td> <td>Eppendorf</td><td>Z368245 (Sigma)</td> <td>para preparação de DNA</td></tr><tr><td>Vetor de isca (por exemplo pLexA-N)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td> para vetor de presa <td>Y2H</td></tr><tr><td>(e.g. pGAD-HA)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td> para vetor de presa <td>de controle Y2H</td></tr><tr><td>(e.g. pLexA-p53)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td> para vetor de isca <td>de controle Y2H</td></tr><tr><td>(e.g. pACT-largeT)</td><td>Sistemas duplos</td><td>P01004</td><td>para Y2H</td></tr><tr><td>Eletrocompetentes E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td><td>Invitrogen</td><td>C640003</td><td>para clonagem de</td></tr><tr><td>cepa repórter de levedura (NMY51:MATahis3&Delta; 200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td> para filme de parafina <td>plástica Y2H</td></tr><tr><td>(e.g. Parafilm M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>para cultura de leveduras e bactérias</td></tr><tr><td>Selante permeável a gás (e.g. BREATHseal)</td><td>Greiner</td><td>676 051</td><td>para cultura de leveduras</td></tr><tr><td>Ciclador de PCR (por exemplo Termociclador T100)</td> <td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>para PCR</td></tr><tr><td>Ciclador de PCR quantitativo (por exemplo Sistema de detecção de PCR em tempo real CFX96 Touch)</td> <td>Bio-Rad</td><td>1855195</td><td>para microcentrífuga de PCR quantitativa</td></tr><tr><td>(por exemplo Centrífuga 5417 R)</td> <td>Equipamento</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de laboratório geral Eppendorf 5417 RCentrífuga (e.g. Centrífuga 5804 R)</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td> equipamento <td>de laboratório geral</td></tr><tr><td>Água livre de nuclease (sem DNAse, sem RNAse, sem protease)</td><td>5Prime</td><td>2500010</td><td>para PCR e trabalhos de DNA</td></tr><tr><td>Scalpell</td><td>Swann-Morton</td><td>0301</td><td>para preparação de DNA</td></tr><tr><td>Filtro estéril (0,22 &micro; m; Polietersulfona)</td><td>VWR-International</td><td>514-0073 (Número de catálogo europeu)</td><td>para cultura de leveduras e bactérias</td></tr><tr><td>Placas de Petri &Oslash; 90 mm&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td>para cultura de leveduras e bactérias</td></tr><tr><td>Placas de Petri &Oslash; 150 mm&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639161</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>Fotômetro (e.g. Biofotômetro)</td><td>Eppendorf</td><td>550507804</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>Fotômetro Cuvetes</td><td>Marca</td><td>759015</td><td>para cultura de levedura</td></tr><tr><td>Banho-maria (e.g. Banho-maria Memmert WB7)</td><td>Memmert</td><td>WB7</td><td>para transformação de levedura</td></tr><tr><td>Western Blot Equipment</td><td>Bio-Rad</td><td>diverso</td><td>para detecção de proteínas</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>5Prime</td><td>2201210</td><td>para clonagem</td></tr><tr><td>de frascos Shaker (Erlenmeyer) (100 mL; 1.000 mL; 2.000 mL) e plugues de algodão respirável (por exemplo frascos de gargalo estreito Duran Erlenmeyer)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z232793, Z232858, Z232866</td><td>para cultura de leveduras e bactérias</td></tr><tr><td>Incubadora de agitação (por exemplo GFL 3031)</td><td>GFL</td><td>3031</td><td>para cultura de leveduras e bactérias</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Aglutinante</td><td>KB 53 (E3.1)</td><td>para cultura de leveduras e bactérias</td></tr><tr><td>Máquina de fazer gelo (por exemplo Máquina de gelo IF 825)</td>Equipamento <td>de laboratório geral</td> <td>Omniwash</td><td>IF 825</td></tr><tr><td>Frascos de reação de 0,2 mL, 1,5 mL e 2,0 mL (polipropileno)</td><td>Eppendorf</td><td>0030.124.332 (0,2 ml); 0030.123.328 (1,5 ml); 0030.123.344 (2,0 ml)</td><td>Equipamento de laboratório geral</td></tr><tr><td>Pipetas e pontas de pipeta descartáveis (volume diferente: 10 - 1.000 &micro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>diversos</td><td>equipamentos de laboratório geral</td></tr><tr><td>Espalhador</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SPR-L-S01</td><td>para cultura de leveduras e bactérias</td></tr><tr><td>Agitador de vórtice (por exemplo MS 3 Minishaker)</td> <td>IKA</td><td>3617000</td><td>equipamento de laboratório geral</td></tr><tr><td>T4-Ligase</td><td>Thermo</td><td>Fisher EL0011</td><td>para clonagem</td></tr><tr><td>de geladeira (4 &deg; C) (por exemplo Liebherr Medline FKEX 5000)</td><td>Liebherr</td><td>81.767.580.4</td><td>equipamento geral de laboratório</td></tr><tr><td>Freezer (-20 &deg; C) (por exemplo Liebherr Comfort Professional G5216)</td><td>Equipamento de laboratório geral</td> <td>Liebherr</td><td>G5216</td></tr><tr><td>Cilindro graduado (marca por exemplo)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z327352; Z327417; Z327441&nbsp; &nbsp;</td><td>Equipamento de laboratório geral</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas (e.g. Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S55701</td><td>para cultura de leveduras e bactérias</td></tr><tr><td>Pipetador mecânico (e.g. Pipetboy acu 2)</td><td>Integra-Biosciences</td><td>155000</td><td>equipamento geral de laboratório</td></tr><tr><td>Cuvetes para eletroporação (1 mm)</td><td>Bio produtos moleculares</td><td>5510-11</td><td>para transformação</td></tr> <tr><td>de bactériasElectroporator (e.g. Eporator)</td><td>Eppendorf</td><td>4309000019</td><td>para transformação de bactérias</td></tr><tr><td>Sistema de imagem em gel e Blot (e.g. ChemiDoc MP System)</td><td>Bio-Rad</td><td>1708280</td><td>equipamento de laboratório geral</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos (Polipropileno) (50 mL)</td><td>VWR-International&nbsp;</td><td>525-0403 (Número de catálogo europeu)</td> <td>Equipamentos de laboratório geral</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cônicos (Polipropileno) (13 mL)</td> <td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Equipamento de laboratório geral</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT; 1 M)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>P2325</td><td>para trifosfato de</td></tr><tr><td>adenosina de ligação (ATP, por exemplo Solução de ATP (10 mM))Ambion</td><td>&nbsp;</td><td>AM8110G (distribuído pela Thermo Scientific)</td> <td>para ligadura</td></tr><tr><td>Mistura de dropout sem histidina, leucina, triptofano e adenina (DO, e.g. Suplementos Médios Drop-out Sintéticos de Levedura)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2021 Sigma&nbsp;</td><td>para cultura de levedura (mistura pronta)</td></tr></tbody></table>

desvendando a função de uma bacteriana effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura screen two-hybrid

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Desvendando os mecanismos moleculares de manifestações da doença é importante compreender patologias e desenvolvimento de sintomas em ciência das plantas. As bactérias têm evoluído diferentes estratégias para manipular seu metabolismo de acolhimento para seu próprio benefício. Esta manipulação bacteriana é muitas vezes associada com o desenvolvimento de sintomas graves ou a morte das plantas afetadas. Determinar as moléculas responsáveis ​​bacterianas específicas para a manipulação de acolhimento tornou-se um importante campo de pesquisa microbiológica. Após a identificação destas moléculas bacterianas, chamados &quot;efectores,&quot; é importante para elucidar a sua função. Uma abordagem simples para determinar a função de um efector é identificar o seu parceiro de ligação proteináceo no seu hospedeiro natural através de uma tela de levedura de dois híbridos (Y2H). Normalmente, o anfitrião abriga numerosos parceiros de ligação potenciais que não podem ser previstos suficientemente por qualquer algoritmo em silico. É, portanto, a melhor escolha para perform a tela com o efetor hipotética contra toda uma biblioteca de proteínas do hospedeiro expressas. É especialmente difícil se o agente causador não é cultivável como fitoplasma. Este protocolo fornece instruções passo-a-passo para a purificação de DNA a partir de uma planta infectada-fitoplasma acolhimento lenhosa, a amplificação do effector potencial, bem como a identificação posterior de parceiro de interacção molecular da planta com uma tela Y2H. Apesar de telas y2h são comumente usados, há uma tendência de terceirizar essa técnica para empresas de biotecnologia que oferecem o serviço Y2H a um custo. Este protocolo fornece instruções sobre como executar uma Y2H em qualquer laboratório de biologia molecular decentemente equipados usando técnicas de laboratório padrão.

Antes da tela Y2H real pode ser realizada a isca deve ser testada para a auto-activação. Isto é conseguido através da transformação do vector de expressão de isca em conjunto com o vector vazio biblioteca presa e verificar o crescimento em placas selectivas. Para analisar se o ATP_00189 proteína phytoplasmal é auto-activação, o teste de auto-ativação foi realizada como descrito no capítulo 5. O plasmídeo isca está complementando o trp ea presa plasmídeo a auxotrofia leu de S. cerevisiae NMY51 40. Um co-transformação bem sucedida é assim caracterizada por crescimento em placas selectivas e falta Trp Leu. Interação da isca e uma proteína presa leva a uma complementação do seu e ade auxotrofia de NMY51. Se a auto-activação da isca na ausência de uma interacção parece, a levedura cresce em placas selectivas e a sua falta ADE. auto-fortes e fracosactivação pode ocorrer. auto-activação forte da isca é caracterizada por um crescimento da levedura co-transformadas em placas de selecção Trp-Leu-His-ade empobrecido. auto-activação fraco leva ao crescimento em Trp-Leu-His mas não em placas de selecção Trp-Leu-His-ade empobrecido. controlos positivos adequados são indispensáveis ​​para a interpretação dos resultados do ensaio de auto-ativação. Um resumo dos resultados esperados do ensaio de auto-activação e a sua interpretação é fornecida na Tabela 1 e visualizado na Figura 1. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> Figura 1: Exemplo de Isca testes de auto-ativação de uma isca antes de executar uma tela Y2H. S. cerevisiae NMY51 foi co-transformada com interagindo isca (Plex-p53) e presa (PACT-larget) como um controlo positivo (painel esquerdo: ac), uma fraca auto-ativação, mais uma presa vazia libravector ry (painel do meio: df) e uma isca não é auto-ativação, mais um vector de biblioteca presa vazio (painel direito: gi). A levedura co-transformadas foram cultivadas em placas de SD falta trp e leu (painel superior: a, d, g), Trp, Leu e seu (painel do meio: b, E, H) e Trp, Leu, His e ade (inferior painel: C, F, I). Selecção no meio sem trp e leu é um controlo positivo para a co-transformação bem sucedida, tal como o vector isco complementa a auxotrofia trp e o vector presa a auxotrofia de NMY51 Leu (crescimento em SD-Trp-Leu). Em caso de uma interação entre a isca e presa ou uma auto-ativação da isca, a expressão repórter de NMY51 está ligado e complementa o dele e auxotrofia ade (crescimento em SD-trp-leu-a-ade). Uma fraco de auto-activação é caracterizado por um crescimento em SD-Trp-Leu-suas placas (painel do meio, DF). auto-ativação fraca de uma isca deve ser diminuída prévia para analisar a iscaem uma tela Y2H, por exemplo, adicionando 3-AT para a mídia seletiva. esgotamento de aminoácidos são indicados com &quot;-&quot;, no respectivo nome do papel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> Nenhum </td><td> colónias </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td></tr><tr><td> Nenhum </td><td> pGAD-HA </td><td> nenhum crescimento </td><td> colónias </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> Nenhum </td><td> colónias </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td> colónias </td><td> colónias </td><td&gt; colónias </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td></tr><tr><td> pLexA-p53 </td><td> pacto de larget </td><td> colónias </td><td> colónias </td><td> colónias </td><td> colónias </td><td> colónias </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> colónias </td><td> colónias </td><td> colónias </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Resultados esperados em um ensaio de auto-ativação isca. A transformação de S. cerevisiae NMY51 produz no crescimento diferencial em meios selectivos com base nas características de isca co-transformado e presa. O crescimento em placas selectivas foi avaliada mediante a transformação de diferentes combinações de vectores (AF) após 72 h de incubação a 30 ° C. auto-activação fraco é caracterizado pelo crescimento de levedura em SD-Trp-Leu-His e auto-activação forte por crescimento em SD-Trp-Leu-His-ade plat selecçãoes na ausência de um parceiro de interação. O pLexA-N phytoplasmal codificado efectora ATP_00189 não exibem auto-activação, que se caracteriza pela incapacidade do vector isco transformado NMY51 para crescer na ausência da sua e ade. Dependendo do isco, uma tela Y2H pode obter numerosos clones de levedura que crescem em placas selectivas. Todos os clones devem ser analisados ​​e verificados para possíveis redundâncias. Mesmo se uma biblioteca de cDNA normalizada foi usado, é muito provável que um interactor é representado em muitos clones diferentes. Dependendo da técnica de clonagem de biblioteca, é também possível que apenas os fragmentos do gene completo, são inseridos em vectores de algumas presas. Assim, é aconselhável para amplificar de novo (a partir de ADNc) e subclonar o gene de comprimento completo do interactor e para testar a interacção de uma análise Y2H um-para-um (Figura 2). <img alt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2: Exemplo de uma interação entre Bait and Prey Em um experimento Y2H. Uma tela de levedura de dois híbridos (Y2H) foi realizado e os plasmídeos dos clones positivos foram purificados interactors. O vector presa foi sequenciado e foram identificados os Malus x domestica parceiros de interacção hospedeiro MdTCP24 e MdTCP25. Como um controlo negativo MdTCP34 (para os quais não foi identificado interactor no rastreio da biblioteca Y2H) foi subclonado em paralelo. Os genes de comprimento total foram amplificados a partir de ADNc de maçã, subclonado no vector de presa (co-cistronically expressando o domínio AD activação) e de novo co-transformada com o vector isco expressando o ATP_00189 efectora bacteriana acoplado ao domínio de ligação ao ADN (BD). Este valor é retirado a partir de 28. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma maior</a>versão desta figura.

proteínas efetoras bacterianas são importantes para o estabelecimento de infecções bem-sucedidas. Este protocolo descreve a identificação experimental de parceiros de ligação proteicas de uma proteína efetora bacteriana em seu hospedeiro natural da planta. A identificação dessas interações efetoras através de levedura telas de dois híbridos tornou-se uma ferramenta importante para desvendar as estratégias de patogenicidade moleculares.

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

O objetivo geral deste procedimento é desvendar estratégias de virulência e sistemas de patógenos hospedeiros ao identificar a interação de uma proteína efetora do candidatus phytoplasma malefactor com proteínas hospedeiras de Malus domestica. Este método pode ajudar a responder questões-chave em diversas áreas de pesquisa biológica e é aqui utilizado na pesquisa com plantas para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento da doença de Proliferação da Macieira. A principal vantagem desta técnica é que um único efetor do patógeno pode ser testado contra milhares de interatores potenciais, tornando este método um ponto de partida facilmente viável na pesquisa de infecções.Para começar, identifique árvores infectadas com sintomas específicos da Proliferação da Macieira e árvores controle que estejam livres de sintomas. Usando tesouras de poda limpas, corte amostras de raiz de três locais diferentes do sistema radicular com diâmetro entre 0,5 e 1 cm e comprimento de aproximadamente 5 cm. Coloque as amostras de raiz em sacos plásticos devidamente rotulados.Em seguida, coloque as amostras em uma caixa térmica com pacotes térmicos gelados e armazene-as a quatro graus Celsius até o processamento posterior. Enxágue as amostras de raiz com água para remover o solo. Em seguida, transfira as amostras para uma placa de Petri estéril e use um bisturi esterilizado para remover a epiderme e o córtex radicular.Com um tecido limpo e livre de fiapos, limpe o bisturi. Em seguida, mergulhe o instrumento em etanol 70% e esterilize-o com calor sobre uma chama aberta. Use o bisturi para riscar o floema.Macere a amostra em pequenos pedaços e alíquota de 30 a 100 miligramas dos fragmentos em um tubo de reação estéril de dois mililitros. Armazene as amostras a 80 graus Celsius ou utilize-as imediatamente para isolamento de DNA, o qual servirá como molde para a amplificação do gene efetor e posterior clonagem do efetor no vetor isca. Após o isolamento do DNA poliespecífico de fitoplasma de árvores infectadas, clonagem em vetores isca e teste quanto à autoativação e expressão conforme o protocolo descrito no texto.Estriar o efetor plex A ATP 00189 transformado em NMY51 em uma placa SD-trp fresca e cultivar a 30 graus Celsius por dois a três dias até o aparecimento de colônias vermelhas. Utilize uma colônia vermelha da placa de ágar para semear três mililitros de meio SD-trp em um frasco pequeno com agitação e incubar o cultivo durante a noite a 30 graus Celsius com agitação a 120-150 rotações por minuto. No dia seguinte, com um mililitro do cultivo noturno, semeie 20 mililitros de SD-trp em um frasco com agitação e deixe crescer por oito horas.Utilize meio SD-trp para ajustar a cultura a uma OD600 de 0,2 e, com dez mililitros dessa cultura, inocule dois frascos contendo 100 mililitros cada de meio SD-trp. Incube as culturas a 30 graus Celsius com agitação durante a noite. Em seguida, meça a OD600 da cultura e pelletize 120 unidades de OD600.Por exemplo, se for medido um OD600 de 1,2, centrifugue 100 mililitros da amostra, descarte o sobrenadante e use 800 mililitros de 2xYPAD pré-aquecido para ressuspender o precipitado em dois frascos de agitação e incube a 30 graus Celsius. Incube a cultura de levedura a 30 graus Celsius e 120-150 rotações por minuto. Meça o OD600 aproximadamente a cada 1,5 horas de acordo com o protocolo descrito no texto até que um OD600 de 0,6 seja atingido.Após preparar o DNA de esperma de salmão, Te Lithium OAc e PEG Lithium OAc de acordo com o protocolo descrito, centrifugue 800 mililitros de cultura de levedura a 700 × g durante cinco minutos para obter o pellet celular. Remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets em um volume total de 200 mililitros de água estéril duplamente destilada. Em seguida, reencentrifugue as células e descarte o sobrenadante.Resuspenda o pellet em 16 mililitros da mistura Te Lithium OAc e centrifugue a amostra novamente. Em seguida, após descartar o sobrenadante, utilize 9,6 mililitros de Te Lithium OAc para ressuspender o pellet. Em recipientes reacionais apropriados, prepare doze frascos com sete microgramas do vetor da biblioteca de DNA Add HAC pico, 100 microlitros de DNA de esperma de salmão a 2% e 2,5 mililitros da mistura PEG Lithium OAc.Adicione 600 microlitros da suspensão de células de levedura previamente preparada a cada um dos doze frascos e misture vigorosamente durante um minuto. Em seguida, incube as reações em banho-maria a 30 graus Celsius por 45 minutos, misturando a cada 15 minutos. A seguir, adicione 160 microlitros de DMSO a cada frasco e misture vigorosamente.Em seguida, incubar os tubos a 42 graus Celsius por mais 20 minutos. Após a centrifugação das células, descartar o sobrenadante e usar três mililitros de 2xYPAD para ressuspender cada pellet. Reunir as células dos doze tubos em um frasco erlenmeyer de 100 mililitros e incubar as leveduras por 90 minutos a 30 graus Celsius e 120 rotações por minuto.Após a incubação, depois de centrifugar as células e descartar o sobrenadante, utilize uma pipeta serológica de dez mililitros e 4,5 mililitros de cloreto de sódio estéril a 0,9% para ressuspender completamente o pellet, pipetando cuidadosamente para cima e para baixo. Retire 50 microlitros da suspensão e utilize cloreto de sódio a 0,9% para preparar diluições sucessivas de dez vezes, de 1:10 até 1:1000. Em seguida, plaque 100 microlitros de cada diluição em placas de Petri de 90 milímetros contendo ágar SD-trp-leu.Espalhe o restante da suspensão de levedura não diluída em placas de Petri de 16x150 milímetros de diâmetro contendo ágar SD-trp-leu-His-ade. Incube as placas a 30 graus Celsius por três dias para as placas SD-trp-leu e por quatro dias para as placas SD-trp-leu-his-ade. Determine a eficiência de transfeção contando as colônias das diferentes diluições seriadas nas placas de seleção SD-trp-leu.Transfira cada clone utilizando uma ponteira estéril para coletar e semear a colônia em placas seletivas frescas de SD-trp-leu-his-ade. Incube as placas a 30 graus Celsius por 24 horas. Repita a transferência dos clones a cada dia até que um total de cinco repiques seja alcançado.Para analisar os clones, sob uma capela estéril, prepare um tubo de reação estéril de dois mililitros com um mililitro de SD-trp-leu-his-ade para cada clone. Use uma agulha quente para fazer um furo em cada tubo e utilize um selante permeável a gases para cobrir o furo. Inocule cada frasco com material fresco de colônia proveniente de um clone e incube os frascos a 30 graus Celsius e 150 rotações por minuto durante 24 horas.Após centrifugar as células e descartar o sobrenatante, reconstitua o pellet no tampão apropriado e transfira-o para um novo tubo de reação de dois mililitros. Adicione 100 microlitros de esferas de vidro lavadas com ácido à suspensão e agite vigorosamente o tubo por cinco minutos. Por fim, purifique o DNA plasmidial de acordo com o protocolo descrito no texto.Um resumo dos resultados esperados do ensaio de autoativação e sua interpretação é apresentado nesta tabela e figura. A autoativação fraca leva ao crescimento em placas de seleção com deficiência de trp-leu-his, mas não em placas de seleção com deficiência de trp-leu-his-ade. Enquanto isso, leveduras transformadas com uma isca que apresenta forte autoativação cresceriam em meio sem trp-leu-his-ade.Uma cotransformação bem-sucedida de isca e presa é caracterizada pelo crescimento em placas seletivas desprovidas de trp e leu. A interação entre a isca e uma proteína presa leva à complementação da auxotrofia de his e ade em NMY51. É mostrado aqui um exemplo de interação entre isca e presa em um experimento de duplo híbrido em levedura. Os parceiros de interação da espécie Malus domestica, MdTCP24 e MdTCP25, foram identificados e a interação foi confirmada por transformação de cone de novo com o efetor.Uma vez dominado, o teste de duplo híbrido em levedura pode ser realizado em um dia, desde que todos os equipamentos e materiais necessários, especialmente a levedura, sejam devidamente preparados com antecedência. Ao realizar este procedimento, é importante evitar contaminação e sempre trabalhar em condições estéreis. Após este procedimento, outro método independente deve ser realizado, como por exemplo a complementação bimolecular de fluorescência, para confirmar as interações proteína-proteína encontradas.Isso é particularmente importante porque a levedura ou o híbrido em si é relativamente propenso a gerar resultados falso-positivos. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores em diversas áreas de pesquisa compreenderem melhor os princípios moleculares envolvidos nas interações proteína-proteína, especialmente nas interações hospedeiro-patógeno, e em muitas outras áreas da pesquisa biológica. Além disso, você entenderá que realizar este método é facilmente viável em qualquer laboratório de biologia molecular razoavelmente equipado.Não se esqueça de que trabalhar com certos produtos químicos, bisturis e chamas abertas pode ser extremamente perigoso; portanto, ao realizar este procedimento, você sempre deve considerar certas precauções. Isso significa usar seus equipamentos de segurança pessoal, como luvas e óculos de proteção, além de utilizar os equipamentos gerais de segurança do laboratório.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para a expressão de efetores tipo bacteriana III em levedura ea identificação de fenótipos efetoras induzida por inibição do crescimento. Esses fenótipos podem ser posteriormente explorada para elucidar funções efetoras e metas.

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