Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis meio de uma levedura Screen Two-hybrid
20 de janeiro de 2017
proteínas efetoras bacterianas são importantes para o estabelecimento de infecções bem-sucedidas. Este protocolo descreve a identificação experimental de parceiros de ligação proteicas de uma proteína efetora bacteriana em seu hospedeiro natural da planta. A identificação dessas interações efetoras através de levedura telas de dois híbridos tornou-se uma ferramenta importante para desvendar as estratégias de patogenicidade moleculares.
O objetivo geral deste procedimento é desvendar estratégias de virulência e sistemas de patógenos hospedeiros ao identificar a interação de uma proteína efetora do candidatus phytoplasma malefactor com proteínas hospedeiras de Malus domestica. Este método pode ajudar a responder questões-chave em diversas áreas de pesquisa biológica e é aqui utilizado na pesquisa com plantas para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento da doença de Proliferação da Macieira. A principal vantagem desta técnica é que um único efetor do patógeno pode ser testado contra milhares de interatores potenciais, tornando este método um ponto de partida facilmente viável na pesquisa de infecções.
Para começar, identifique árvores infectadas com sintomas específicos da Proliferação da Macieira e árvores controle que estejam livres de sintomas. Usando tesouras de poda limpas, corte amostras de raiz de três locais diferentes do sistema radicular com diâmetro entre 0,5 e 1 cm e comprimento de aproximadamente 5 cm. Coloque as amostras de raiz em sacos plásticos devidamente rotulados.
Em seguida, coloque as amostras em uma caixa térmica com pacotes térmicos gelados e armazene-as a quatro graus Celsius até o processamento posterior. Enxágue as amostras de raiz com água para remover o solo. Em seguida, transfira as amostras para uma placa de Petri estéril e use um bisturi esterilizado para remover a epiderme e o córtex radicular.
Com um tecido limpo e livre de fiapos, limpe o bisturi. Em seguida, mergulhe o instrumento em etanol 70% e esterilize-o com calor sobre uma chama aberta. Use o bisturi para riscar o floema.
Macere a amostra em pequenos pedaços e alíquota de 30 a 100 miligramas dos fragmentos em um tubo de reação estéril de dois mililitros. Armazene as amostras a 80 graus Celsius ou utilize-as imediatamente para isolamento de DNA, o qual servirá como molde para a amplificação do gene efetor e posterior clonagem do efetor no vetor isca. Após o isolamento do DNA poliespecífico de fitoplasma de árvores infectadas, clonagem em vetores isca e teste quanto à autoativação e expressão conforme o protocolo descrito no texto.
Estriar o efetor plex A ATP 00189 transformado em NMY51 em uma placa SD-trp fresca e cultivar a 30 graus Celsius por dois a três dias até o aparecimento de colônias vermelhas. Utilize uma colônia vermelha da placa de ágar para semear três mililitros de meio SD-trp em um frasco pequeno com agitação e incubar o cultivo durante a noite a 30 graus Celsius com agitação a 120-150 rotações por minuto. No dia seguinte, com um mililitro do cultivo noturno, semeie 20 mililitros de SD-trp em um frasco com agitação e deixe crescer por oito horas.
Utilize meio SD-trp para ajustar a cultura a uma OD600 de 0,2 e, com dez mililitros dessa cultura, inocule dois frascos contendo 100 mililitros cada de meio SD-trp. Incube as culturas a 30 graus Celsius com agitação durante a noite. Em seguida, meça a OD600 da cultura e pelletize 120 unidades de OD600.
Por exemplo, se for medido um OD600 de 1,2, centrifugue 100 mililitros da amostra, descarte o sobrenadante e use 800 mililitros de 2xYPAD pré-aquecido para ressuspender o precipitado em dois frascos de agitação e incube a 30 graus Celsius. Incube a cultura de levedura a 30 graus Celsius e 120-150 rotações por minuto. Meça o OD600 aproximadamente a cada 1,5 horas de acordo com o protocolo descrito no texto até que um OD600 de 0,6 seja atingido.
Após preparar o DNA de esperma de salmão, Te Lithium OAc e PEG Lithium OAc de acordo com o protocolo descrito, centrifugue 800 mililitros de cultura de levedura a 700 × g durante cinco minutos para obter o pellet celular. Remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets em um volume total de 200 mililitros de água estéril duplamente destilada. Em seguida, reencentrifugue as células e descarte o sobrenadante.
Resuspenda o pellet em 16 mililitros da mistura Te Lithium OAc e centrifugue a amostra novamente. Em seguida, após descartar o sobrenadante, utilize 9,6 mililitros de Te Lithium OAc para ressuspender o pellet. Em recipientes reacionais apropriados, prepare doze frascos com sete microgramas do vetor da biblioteca de DNA Add HAC pico, 100 microlitros de DNA de esperma de salmão a 2% e 2,5 mililitros da mistura PEG Lithium OAc.
Adicione 600 microlitros da suspensão de células de levedura previamente preparada a cada um dos doze frascos e misture vigorosamente durante um minuto. Em seguida, incube as reações em banho-maria a 30 graus Celsius por 45 minutos, misturando a cada 15 minutos. A seguir, adicione 160 microlitros de DMSO a cada frasco e misture vigorosamente.
Em seguida, incubar os tubos a 42 graus Celsius por mais 20 minutos. Após a centrifugação das células, descartar o sobrenadante e usar três mililitros de 2xYPAD para ressuspender cada pellet. Reunir as células dos doze tubos em um frasco erlenmeyer de 100 mililitros e incubar as leveduras por 90 minutos a 30 graus Celsius e 120 rotações por minuto.
Após a incubação, depois de centrifugar as células e descartar o sobrenadante, utilize uma pipeta serológica de dez mililitros e 4,5 mililitros de cloreto de sódio estéril a 0,9% para ressuspender completamente o pellet, pipetando cuidadosamente para cima e para baixo. Retire 50 microlitros da suspensão e utilize cloreto de sódio a 0,9% para preparar diluições sucessivas de dez vezes, de 1:10 até 1:1000. Em seguida, plaque 100 microlitros de cada diluição em placas de Petri de 90 milímetros contendo ágar SD-trp-leu.
Espalhe o restante da suspensão de levedura não diluída em placas de Petri de 16x150 milímetros de diâmetro contendo ágar SD-trp-leu-His-ade. Incube as placas a 30 graus Celsius por três dias para as placas SD-trp-leu e por quatro dias para as placas SD-trp-leu-his-ade. Determine a eficiência de transfeção contando as colônias das diferentes diluições seriadas nas placas de seleção SD-trp-leu.
Transfira cada clone utilizando uma ponteira estéril para coletar e semear a colônia em placas seletivas frescas de SD-trp-leu-his-ade. Incube as placas a 30 graus Celsius por 24 horas. Repita a transferência dos clones a cada dia até que um total de cinco repiques seja alcançado.
Para analisar os clones, sob uma capela estéril, prepare um tubo de reação estéril de dois mililitros com um mililitro de SD-trp-leu-his-ade para cada clone. Use uma agulha quente para fazer um furo em cada tubo e utilize um selante permeável a gases para cobrir o furo. Inocule cada frasco com material fresco de colônia proveniente de um clone e incube os frascos a 30 graus Celsius e 150 rotações por minuto durante 24 horas.
Após centrifugar as células e descartar o sobrenatante, reconstitua o pellet no tampão apropriado e transfira-o para um novo tubo de reação de dois mililitros. Adicione 100 microlitros de esferas de vidro lavadas com ácido à suspensão e agite vigorosamente o tubo por cinco minutos. Por fim, purifique o DNA plasmidial de acordo com o protocolo descrito no texto.
Um resumo dos resultados esperados do ensaio de autoativação e sua interpretação é apresentado nesta tabela e figura. A autoativação fraca leva ao crescimento em placas de seleção com deficiência de trp-leu-his, mas não em placas de seleção com deficiência de trp-leu-his-ade. Enquanto isso, leveduras transformadas com uma isca que apresenta forte autoativação cresceriam em meio sem trp-leu-his-ade.
Uma cotransformação bem-sucedida de isca e presa é caracterizada pelo crescimento em placas seletivas desprovidas de trp e leu. A interação entre a isca e uma proteína presa leva à complementação da auxotrofia de his e ade em NMY51. É mostrado aqui um exemplo de interação entre isca e presa em um experimento de duplo híbrido em levedura. Os parceiros de interação da espécie Malus domestica, MdTCP24 e MdTCP25, foram identificados e a interação foi confirmada por transformação de cone de novo com o efetor.
Uma vez dominado, o teste de duplo híbrido em levedura pode ser realizado em um dia, desde que todos os equipamentos e materiais necessários, especialmente a levedura, sejam devidamente preparados com antecedência. Ao realizar este procedimento, é importante evitar contaminação e sempre trabalhar em condições estéreis. Após este procedimento, outro método independente deve ser realizado, como por exemplo a complementação bimolecular de fluorescência, para confirmar as interações proteína-proteína encontradas.
Isso é particularmente importante porque a levedura ou o híbrido em si é relativamente propenso a gerar resultados falso-positivos. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores em diversas áreas de pesquisa compreenderem melhor os princípios moleculares envolvidos nas interações proteína-proteína, especialmente nas interações hospedeiro-patógeno, e em muitas outras áreas da pesquisa biológica. Além disso, você entenderá que realizar este método é facilmente viável em qualquer laboratório de biologia molecular razoavelmente equipado.
Não se esqueça de que trabalhar com certos produtos químicos, bisturis e chamas abertas pode ser extremamente perigoso; portanto, ao realizar este procedimento, você sempre deve considerar certas precauções. Isso significa usar seus equipamentos de segurança pessoal, como luvas e óculos de proteção, além de utilizar os equipamentos gerais de segurança do laboratório.
Visão Geral
Este protocolo descreve a identificação de interações proteicas entre uma proteína efetora bacteriana e proteínas do hospedeiro em Malus domestica. Ao utilizar ensaios de duplo híbrido em levedura, os pesquisadores podem explorar os mecanismos moleculares de patogenicidade relacionados à Doença da Proliferação da Macieira.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Fitopatologia
- Interações Microbianas
- Biologia Molecular
Contexto
- As proteínas efetoras bacterianas desempenham um papel crucial nas infecções.
- Compreender essas interações pode revelar estratégias de virulência.
- Os ensaios de duplo-híbrido em levedura são eficazes para identificar interações proteicas.
- Este estudo foca-se nas interações em um hospedeiro vegetal natural.
Objetivo do Estudo
- Identificar parceiros de ligação de uma proteína efetora bacteriana.
- Elucidar os mecanismos moleculares da Doença do Enxameamento da Macieira.
- Fornecer um método para triagem de efetores de patógenos contra inúmeros interatores.
Métodos Utilizados
- Isolamento de amostras de raízes de árvores infectadas e controles.
- Isolamento de DNA e clonagem de genes efetores em vetores isca.
- Transformação de levedura e cultivo para triagem de interações.
- Seleção de colônias e determinação da eficiência de transfeção.
Resultados Principais
- Identificação bem-sucedida de interações proteicas.
- Estabelecimento de um protocolo para triagem de proteínas efetoras.
- Compreensão da base molecular da patogenicidade em plantas.
- Demonstração da aplicabilidade do método em diversas áreas biológicas.
Conclusões
- O protocolo fornece uma estrutura robusta para o estudo das interações de efetores.
- A identificação dessas interações é fundamental para compreender doenças em plantas.
- Este método pode facilitar pesquisas adicionais sobre a dinâmica planta-patógeno.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A identificação de interações entre proteínas efetoras de patógenos e proteínas hospedeiras fornece validação essencial de alvos para estratégias antimicrobianas e anti-virulência. Essa abordagem de duplo híbrido em levedura permite a redução de riscos mecanicistas ao revelar os determinantes moleculares da manipulação do hospedeiro em patógenos não cultiváveis. O método apóia fluxos de trabalho de descoberta precoce ao gerar hipóteses testáveis sobre a função de efetores e a modulação de vias do hospedeiro.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao mapear interações de efetores com vias do hospedeiro envolvidas na suscetibilidade à doença.
- Valor Operacional: Oferece um sistema escalonável para priorizar efetores com base na intensidade da interação e na relevância biológica.
- Valor Preditivo: Apoia a avaliação da confiança no alvo ao vincular a atividade do efetor a fenótipos mensuráveis do hospedeiro.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera dados quantitativos de interação a partir de proteomas complexos de hospedeiros, permitindo a padronização de ensaios para campanhas de triagem de efetores.
- Valor Operacional: Estabelece fluxos de trabalho reprodutíveis para etapas de clonagem, transformação e seleção, compatíveis com triagem de média escala.
- Prontidão do Ensaio: Produz bibliotecas de presas validadas que podem ser reutilizadas em múltiplas triagens de efetores, reduzindo a construção redundante de bibliotecas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Identifica proteínas do hospedeiro que servem como biomarcadores traducionais potenciais para a gravidade da infecção ou modulação da resposta do hospedeiro.
- Valor Operacional: Cria sistemas relevantes para a doença que conectam achados in vitro com resultados fenotípicos in planta.
- Redução de Riscos: Permite a eliminação pré-clínica de riscos ao validar se a interrupção de interações específicas entre efetores e hospedeiros atenua a patogenicidade.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se encaixa nas fases iniciais de descoberta até a identificação de compostos líderes, especialmente para alvos nos quais a manipulação genética é limitada e é necessária uma análise de interações para inferir a função.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao revelar quais vias do hospedeiro são alvejadas por efetores, fornecendo subsídios para estudos sobre mecanismos de ação.
- Triagem: Fornece dados de interação prontos para ensaios, que podem orientar a triagem de compostos contra interfaces efetor-hospedeiro.
- Análises: Oferece leituras binárias e semi-quantitativas (crescimento em meio seletivo) que permitem comparar forças de interação entre variantes de efetores.
- Pesquisa Translacional: Conecta interações moleculares a respostas fenotípicas em Malus domestica, apoiando a continuidade do alvo até o fenótipo.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada de Y2H que pode ser implementada em múltiplos pares efetor-alvo sem a necessidade de redesenhar os fluxos de trabalho principais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na seleção de alvos ao reduzir a dependência exclusiva de previsões in silico.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de procedimentos padronizados de isolamento de DNA, clonagem e manipulação de leveduras.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de avançar ou não ao fornecer dados empíricos sobre a essencialidade do efetor e a dependência do hospedeiro.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos antimicrobianos com base na centralidade e conservação na rede de interações.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em clonagem molecular, manipulação de leveduras e sistemas de marcadores de seleção.
- Depende do acesso a cepas de levedura, meios seletivos e infraestrutura de incubação capaz de manter condições de 30 °C e 42 °C.
- Necessita padronização entre equipes quanto aos controles de qualidade do DNA e aos parâmetros de eficiência de clonagem de efetores.
- Envolve considerações de adaptação ao ser estendido a outros sistemas hospedeiros, devido à compatibilidade da biblioteca e à variabilidade de expressão.
- Inclui limitações práticas, como taxas de falsos positivos que exigem validação ortogonal e incompatibilidade de proteínas de membrana em sistemas Y2H padrão.
