Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

proteínas efetoras bacterianas são importantes para o estabelecimento de infecções bem-sucedidas. Este protocolo descreve a identificação experimental de parceiros de ligação proteicas de uma proteína efetora bacteriana em seu hospedeiro natural da planta. A identificação dessas interações efetoras através de levedura telas de dois híbridos tornou-se uma ferramenta importante para desvendar as estratégias de patogenicidade moleculares.

O objetivo geral deste procedimento é desvendar estratégias virulentas e sistemas de patógenos hospedeiros, identificando a interação de uma proteína malefator do fitoplasma candidatus com proteínas do hospedeiro de malus domestica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em muitos campos de pesquisa biológica diferentes e é aqui usado na pesquisa de plantas para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento da Doença da Proliferação da Maçã. A principal vantagem dessa técnica é que um único efetor de patógeno pode ser rastreado contra milhares de interagentes potenciais, tornando esse método um ponto de partida facilmente viável na pesquisa de infecções.

Para começar, identifique as árvores infectadas com sintomas específicos da proliferação da maçã e controle as árvores que não apresentam sintomas. Usando tesouras de podar limpas, corte amostras de raízes de três locais diferentes do sistema radicular com um diâmetro de 0,5 1 cm e um comprimento de cerca de 5 cm. Coloque as amostras de raiz em sacos plásticos adequadamente rotulados.

Em seguida, coloque as amostras em uma caixa fria com bolsas térmicas resfriadas e armazene-as a quatro graus Celsius até o processamento posterior. Enxágue as amostras de raízes com água para remover o solo. Em seguida, transfira as amostras para uma placa de Petri estéril e use um bisturi esterilizado para remover a epiderme da raiz e o córtex.

Com um lenço de papel limpo e sem fiapos, limpe o bisturi. Em seguida, mergulhe o instrumento em etanol a 70% e esterilize-o por calor em fogo aberto. Use o bisturi para arranhar o floema.

Pique a amostra em pedaços pequenos e alíquota de 30-100 miligramas dos pedaços em um tubo de reação estéril de dois mililitros. Armazene as amostras a 80 graus Celsius ou use-as imediatamente para isolar o DNA, que serve como modelo para a amplificação do gene efetor e subsequente clonagem do efetor no vetor isca. Depois de isolar o DNA poliespecífico do fitoplasma de árvores infectadas, clonar em vetores de isca e testá-lo para autoativação e expressão de acordo com o protocolo de texto.

O efetor Streak plex A ATP 00189 transformou NMY51 em uma placa SD-trp fresca e cultivou-o a 30 graus Celsius por dois a três dias até que as colônias vermelhas apareçam. Use uma colônia vermelha da placa de ágar para inocular três mililitros de meio SD-trp em um pequeno frasco de agitação e incube a cultura durante a noite a 30 graus Celsius com agitação a 120-150 rotações por minuto. No dia seguinte, com um mililitro da cultura noturna, inocular 20 mililitros de SD-trp em um frasco agitado e deixar crescer por oito horas.

Use o meio SD-trp para ajustar a cultura para um OD600 de 0,2 e, com dez mililitros da cultura, inocule dois frascos contendo 100 mililitros cada de meio SD-trp. Incube as culturas a 30 graus Celsius com agitação durante a noite. Em seguida, meça o OD600 da cultura e o pellet 120 unidades OD600.

Por exemplo, se um OD600 de 1,2 for medido, gire 100 mililitros de amostra, descarte o sobrenadante e use 800 mililitros de 2xYPAD pré-aquecido para ressuspender o pellet em dois frascos agitadores e incubar a 30 graus Celsius. Incube a cultura de levedura a 30 graus Celsius e 120-150 rotações por minuto. Meça o OD600 a cada 1.5 horas de acordo com o protocolo de texto até que um OD600 de 0.6 seja alcançado.

Depois de preparar o DNA do esperma de salmão, Te Lithium OAc e PEG Lithium OAc de acordo com o protocolo de texto, centrifugue 800 mililitros de cultura de levedura a 700 x G por cinco minutos para pellet as células. Remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets em um total de 200 mililitros de água bidestilada estéril. Em seguida, jogue as células novamente e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda o pellet em 16 mililitros de mistura de Te Lithium OAc e gire a amostra novamente. Então, depois de descartar o sobrenadante, use 9,6 mililitros de Te Lithium OAc para ressuspender o pellet. Em recipientes de reação de tamanho apropriado, prepare doze frascos com sete microgramas de pico Adicionar vetor de biblioteca de DNA HAC, 100 microlitros de DNA de esperma de salmão 2% e 2,5 mililitros de mistura de PEG Lithium OAc.

Adicione 600 microlitros da suspensão de células de levedura previamente preparada a cada um dos doze frascos e misture vigorosamente por um minuto. Em seguida, incube as reações em banho-maria a 30 graus Celsius por 45 minutos, misturando a cada 15 minutos. Em seguida, adicione 160 microlitros de DMSO a cada frasco e misture vigorosamente.

Em seguida, incube os frascos a 42 graus Celsius por mais 20 minutos. Após a peletização das células, descarte o sobrenadante e use três mililitros de 2xYPAD para ressuspender cada pellet. Agrupe as células de todos os doze frascos em um frasco agitador de 100 mililitros e incube a levedura por 90 minutos a 30 graus Celsius e 120 rotações por minuto.

Após a incubação, depois de peletizar as células e descartar o sobrenadante, use uma pipeta sorológica de dez mililitros e 4,5 mililitros de cloreto de sódio estéril a 0,9% para ressuspender completamente o pellet, pipetando cuidadosamente para cima e para baixo. Retire 50 microlitros da suspensão e use cloreto de sódio a 0,9% para preparar diluições de dez vezes de 1:10 a 1:1000. Em seguida, coloque 100 microlitros de cada diluição em placas de Petri de 90 milímetros contendo ágar SD-trp-leu.

Espalhe o resto da suspensão de levedura não diluída em placas de Petri de 16x150 milímetros de diâmetro com ágar SD-trp-leu-His-ade. Incubar as placas a 30 graus Celsius durante três dias para as placas SD-trp-leu e durante quatro dias para as placas SD-trp-leu-his-ade. Determine a eficiência da transfecção contando as colônias das diferentes diluições seriadas nas placas de seleção SD-trp-leu.

Transfira cada clone usando uma ponta de pipeta estéril para pegar e listrar a colônia em placas seletivas SD-trp-leu-his-ade frescas. Incube as placas a 30 graus Celsius por 24 horas. Repita a transferência de clones todos os dias até atingir um total de cinco passagens.

Para analisar os clones, sob uma capa estéril, preparar um tubo de reação estéril de dois mililitros com um mililitro de SD-trp-leu-his-ade para cada clone. Use uma agulha quente para fazer um furo em cada tubo e use um selante permeável a gás para cobrir o furo. Inocular cada frasco com material de colónia fresco de um clone e incubar os frascos a 30 graus Celsius e 150 rotações por minuto durante 24 horas.

Depois de granular as células e descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet no tampão apropriado e transfira-o para um novo tubo de reação de dois mililitros. Adicione 100 microlitros de contas de vidro lavadas com ácido à suspensão e misture o tubo vigorosamente por cinco minutos. Finalmente, purifique o DNA do plasmídeo de acordo com o protocolo de texto.

Um resumo dos resultados esperados do ensaio de autoativação e sua interpretação é fornecido nesta tabela e figura. A autoativação fraca leva ao crescimento em trp-leu-his, mas não em placas de seleção esgotadas de trp-leu-his-ade. Enquanto o fermento transformado com uma isca forte e autoativada cresceria em trp-leu-his-ade sem meio.

Uma cotransformação bem-sucedida de isca e presa é caracterizada pelo crescimento em placas seletivas sem trp e leu. A interação da isca e de uma proteína de presa leva a uma complementação da oxitrofia his e ade de NMY51 Aqui está um exemplo de interação entre isca e presa em um experimento híbrido de levedura 2. Os parceiros de interação do hospedeiro malus domestica, MdTCP24 e MdTCP25 foram identificados e a interação foi confirmada pela transformação do cone de novo com o efetor.

Uma vez dominado, o híbrido de levedura 2 pode ser executado em um dia se todos os equipamentos e materiais necessários, especialmente a levedura, forem devidamente preparados com antecedência. Ao tentar este procedimento, é importante evitar contaminação e sempre trabalhar em condições estéreis. Após este procedimento, outro método independente deve ser realizado como a complementação de fluorescência bimolecular, por exemplo, para confirmar as interações proteína-proteína encontradas.

Isso é particularmente importante, pois a levedura ou híbrido per se é relativamente propenso a gerar resultados falsos positivos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores em muitos campos de pesquisa diferentes entenderem melhor os princípios moleculares que envolviam interações proteína-proteína, especialmente em interações patógeno-hospedeiro e muitos outros campos de pesquisa biológica. Além disso, você entenderá que a execução desse método é facilmente viável em qualquer laboratório de biologia molecular decentemente equipado.

Não se esqueça de que trabalhar com certos produtos químicos, bisturis e chamas abertas pode ser extremamente perigoso, portanto, ao realizar este procedimento, você sempre deve considerar certos cuidados. Isso significa usar seu equipamento de segurança pessoal, como luvas e óculos de proteção, e usar o equipamento geral de segurança do laboratório.