Name: Produção à escala laboratorial e purificação de um anticorpo terapêutico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprenda a produzir anticorpos terapêuticos em escala laboratorial usando células HEK-293 em meio livre de soro. Este método estabelece linhagens estáveis adaptadas para obtenção de rendimentos robustos e reprodutíveis.

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A pesquisa foi apoiada pela Universidade de Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ foi um presente de Andrew Beavil (plasmídeo Addgene # 61883). Agradecemos a Tihomir S. Dodev pelas discussões úteis sobre pVITRO1-Trastuzumabe-IgG1/κ.

NOTA: Um vector de expressão de mamífero adequado deve ser utilizado para este protocolo. Aqui, uma única construção que contém duas cassetes de expressão é utilizado (isto é, expressão da cadeia pesada e leve é conduzida por promotores separados). Trastuzumab cadeias pesadas e leves foram previamente clonado no vector. Este vector foi um presente de Andrew Beavil, obtido através de um lucro não-para-repositório plasmídeo 13. 1. Recuperação e scale-up de DNA Vector NOTA: O ADN do vector foi recebido como uma cultura Stab agar mole em Escherichia coli XL-1 Blue estirpe; vector transporta resistência à higromicina. <ol><li> Insira uma facada inoculação estéril ou alça no agar macio da cultura facada em seguida, raia uma placa de agar Luria Bertani (LB) preparado com 75 ug / ml de higromicina para colónias isoladas. Incubar a placa a 37 ° C durante 18-24 h. </li><li> Inocular uma colónia isolada em 5 ml de caldo Terrific (TB) contendo 75 ug / ml de higromicina. incuBATE a cultura a 37 ° C durante 18-24 horas com agitação 225 rpm. </li><li> Utilizar a cultura durante a noite para preparar um stock de glicerol de ADN do vector misturando suavemente a 800 ul de cultura com 200 ul de 80% de glicerol num criotubo e congelamento a -80 ° C. <ol><li> Adicionar 100 ul da cultura durante a noite a 100 ml de TB contendo 75 ug / ml de higromicina num balão agitador confundido (isto é, diluição 1 / 1.000). Incubar a cultura a 37 ° C durante 18-24 horas com agitação 225 rpm. </li></ol></li><li> Após cultura durante a noite, extrai-se e purifica-se o ADN de acordo com as instruções do fabricante do kit de preparação MIDI / Maxi com a seguinte excepção; durante o passo de, ou eluem ressuspender o ADN final com água (pH 7,0-8,5). </li><li> Verifique a pureza e concentração de DNA por leituras de absorvância a 260 e 280 nm, em seguida, armazena o ADN à temperatura de -20 ° C. NOTA: Opcional (altamente recomendado): DNA Sequence utilizando primers específicos de vetor para confirmar a identidade. </li></ol> 2. Transfecção estável de células HEK 293- <ol><li> Crescer e manter as células HEK-293 (células de suspensão) de acordo com protocolos padrão em meio isento de soro suplementado com 0,1% de agente tensioactivo não iónico em balões de Erlenmeyer. Mantem-se a 2 x 10 5 culas / ml e subcultura cada quarto dia. Células de cultura a 37 ° C com 5% de CO 2 e 120 rotação rpm. NOTA: As células devem ter sido em cultura por não menos de 4 dias e não mais de 4 semanas antes da transfecção. As células HEK-293 crescidas como monocamadas em meio contendo soro, também pode ser usado para este procedimento. </li><li> No dia antes da transfecção, as células HEK-293 de sementes a 3 x 10 5 culas / ml em poços de uma placa de 12 poços em 2 ml de Dulbecco Modified Eagle Meios (DMEM) suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 10% ( FBS). No dia da transfecção, verificar que as células atingiram 80-90% de confluência </li><li> Diluir DNA e polietilenimina (PEI) separadamente em meios de transfecção, em seguida, misture bem.<ol><li> Dilui-se 1,25 ^ g de DNA vector por poço (15 ug por 12 poços) em 300 ul de meio de transfecção. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Dilui-se 2,5 ul de solução de 1 mg / ml de PEI (30 uL para poços 12; ou seja, 1: 2 proporção de ADN para pei) em 300 ul de meio de transfecção. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Adicionar ADN diluído para PEI diluído, misturar suavemente e incuba-se à temperatura ambiente durante 15 min. </li></ol></li><li> Adicionar 50 ul de ADN / PEI mistura gota a gota a cada poço da placa. Balance a placa suavemente para distribuir a mistura de transfecção, em seguida, colocar a placa a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 24 horas. </li><li> Adicionar 50 ug / ml de higromicina B por poço e retornar placa a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 10 dias. NOTA: Ao dia 10, as células transfectadas un-terão morrido e isolada a partir da superfície da placa, enquanto que as células estavelmente transfectadas serão viáveis ​​e ligado à placa. </li><li> Substitua o material em poços com1/4 volume de meio isento de soro e 3/4 volume de DMEM suplementado com FBS a 10% (isto é, 0,5 ml de meio isento de soro + 1,5 ml de DMEM = 7,5% de concentração sérica final) e incubar durante 4 dias. </li><li> Substituir os meios de comunicação em poços com 1/2 meios isentos de soro de volume e 1/2 volume de DMEM suplementado com FBS a 10% (isto é, meios isentos de soro 1 ml + 1 ml de DMEM = concentração de soro final de 5%) e incubar durante 4 dias. </li><li> Substituir os meios de comunicação em poços com 3/4 meios isentos de soro de volume e 1/4 volume de DMEM suplementado com FBS (isto é, 1,5 ml de meio isento de soro + 0,5 ml de DMEM = concentração sérica final de 2,5%) a 10% e incubar durante 4 dias. </li><li> Substituir os meios de comunicação em poços com 2 ml de meio isento de soro suplementado com 0,1% de agente tensioactivo não iónico (isto é, a concentração sérica final 0%) e incubar durante 4 dias. NOTA: Manter a 50 ug / pressão selectiva higromicina B ml de células durante a adaptação sem soro. As células adaptadas a meio sem soro separar da superfície de poços e podem agrupar-iN suspensão. Consulte o passo 2.1 para condições de cultura com o suplemento adicional de 50 ug / ml de higromicina B. </li><li> Usando uma pipeta, misturar suavemente as culturas em suspensão as células em placa e da piscina de 12 poços para um tubo separado. <ol><li> Usando um hemocitómetro, enumerar células reunidas e sementes em 30 ml de meio isento de soro, num balão de Erlenmeyer a 2 x 10 5 culas / ml. Células de cultura a 37 ° C com 5% de CO 2 e 120 rotação rpm. Subcultura e expandir cada quatro dias. </li></ol></li><li> Continuar a expandir o tamanho da cultura a densidade celular necessária para obter 10 frascos a 1 x 10 7 células / frasco de criopreservação em azoto líquido. Congelar as células em meio isento de soro contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). NOTA: condicionado mídia contendo o anticorpo pode ser colhido em cada subcultura para confirmar a produção de proteína ou usado para otimizar as condições de purificação. Para colher os meios condicionados e manter células para subcultura, centrifugar a cultura em300 xg durante 5 min e depois filtrar-esterilizar sobrenadante através de um filtro de 0,22 um. sobrenadante filtrado pode ser mantida a 4 ° C durante 1-2 semanas ou -20 ° C para armazenamento a longo prazo. </li></ol> 3. Grande Escala da Produção de Anticorpos de lote Overgrow Cultura NOTA: A produção de anticorpos pode ser seguido por passo de 2,11, onde as células existentes são expandidos para a densidade celular necessária com base no volume de cultura overgrow lote a configuração. Caso contrário, as células que foram descongelados a partir de criopreservação começar nesta fase uma vez expandido até uma densidade celular apropriada e volume. Vários suplementos de cultura podem ser utilizados para optimizar a produção de anticorpos; o uso de triptona para aumentar o rendimento de anticorpo é demonstrado no presente protocolo. <ol><li> Semear as células a 2 x 10 5 culas / ml em meio isento de soro de 100 mL em dois frascos de Erlenmeyer (comparar os rendimentos de anticorpo a partir de culturas de un-suplementado e suplementada em nutrientes). Cultura a 37 ° C, 5% de CO 2 </sUB&gt; e 120 rpm. </li><li> Após 24 h, adicionar triptona até uma concentração final de 0,5% de cultura suplementado com nutrientes. Equalizar volume de cultura suplementado-un com meios livres de soro. </li><li> A partir do dia 8, realizar contagens de células das culturas diários utilizando um hemocitómetro para monitorar a viabilidade celular. Colheita dos sobrenadantes de cultura uma vez que a viabilidade das células é inferior a 80%. <ol><li> Colheita sobrenadante por centrifugação das culturas a 3000 xg durante 15 min e depois filtrar-esterilizar o sobrenadante (contendo o anticorpo) através de um filtro de 0,22 um. Armazenar os sobrenadantes a 4 ° C (de curto prazo) ou congelar a -20 ° C (a longo prazo). </li></ol></li></ol> 4. Anticorpo A purificação por cromatografia de afinidade usando um Cromatografia Líquida de Proteínas Rápida automatizada (FPLC) do sistema NOTA: O procedimento que se segue pode geralmente ser aplicada a sistemas mais automatizados. A purificação pode ser realizada à temperatura ambiente ou a 4 ° C (sistema FPLC se é mantida numa sala fria).Uma série de testes de aferição pode ser realizada para identificar as condições óptimas de purificação incluindo a matriz de coluna adequada, tampão, tampão de eluição e do pH de ligação para assegurar a recuperação máxima de anticorpo purificado a partir de meios condicionados (consulte a secção de resultados). As condições óptimas são dependentes do anticorpo ou proteína ser purificado. Purificações foram realizadas num sistema de FPLC automatizado. Purificações foram realizadas à temperatura ambiente usando uma coluna 5 ml de Proteína A coluna. <ol><li> Prepare os seguintes tampões com água ultrapura e ajustar ao pH recomendado, em seguida, filtrar através de um filtro de 0,22 um. <ol><li> Prepare 1 litro de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 (tampão de ligação) através da mistura do seguinte: 0,14 M de NaCl, 0,0027 M de KCl, 0,01 M de Na 2 HPO 4 e 0,001 M de KH 2 PO 4. Ajuste o pH se necessário, antes de se filtrar o tampão. </li><li> Preparar 500 ml de M de glicina-HCl a pH 2,7 (tampão de eluição) 0,1. Ajustar o pH antes de filtrar o lustreer. </li><li> Preparar 50 ml de Tris pH (tampão de neutralização) 9,0 1. </li></ol></li><li> Certifique-se de todas as conexões eléctricas e de comunicação do sistema com computador são feitas. Os dispositivos devem ser visíveis no software do módulo &#39;Sistema de Controle&#39;. Assegurar célula UV é fixado em 280 nm, comprimento de onda. Opcional: Calibrar medidor de pH, se estiver ligado e para ser usado. </li><li> Imergir tubos de entrada de A, B e bomba da amostra em água ultrapura para lavar o sistema. Purifica as bombas com uma seringa, se houver ar no tubo ou uma suspeita de ar no sistema. Lavar o sistema com água por operação manual através do controlador de sistema, ou através de um método automatizado. Observe que a pressão, condutividade, traçado UV280 e pH permaneçam consistentes e que o limite de pressão para a coluna não seja excedido de acordo com as especificações do fabricante. NOTA: Anormalidades pode indicar ar ou bloqueio no sistema que devem ser abordadas antes de prosseguir. </li><li> No módulo controlador do sistema, inicie o caudal ao 1ml / min manualmente através de bomba A em qualquer carga (ignorando loop de amostra) ou injetar (através do loop de amostra) posição para começar a ligar a coluna. tubulação do sistema de desconexão na entrada posição da coluna e retire a tampa ligada à entrada da coluna. <ol><li> Permitir que a água flua do tubo de gota a gota do sistema na parte superior da coluna, em seguida, fixar a tubagem do sistema para a coluna. Ter a entrada da coluna e acessório de entrada transbordando com gotas de água garante uma conexão livre de bolhas de ar. </li></ol></li><li> Fixe a saída da coluna na saída a jusante e verificar todas as conexões estão bem apertados. Com a coluna agora ligado ao sistema, não exceder os limites de limite de pressão máxima e caudal, conforme descrito nas especificações da coluna. </li><li> Lavagem da coluna com 5 volumes de coluna (CV) de água. Se necessário, continue lavagem da coluna até UV280 traçado estabilizou. </li><li> Mergulhe tubos de entrada de A em tampão de ligação B na eluição de tampão e bomba da amostra em tampão de ligação tO equilibrar o sistema em tampões correcção. Encha os tubos de entrada com tampão usando PumpWash pela operação manual. </li><li> No módulo do software do &#39;Method Editor&#39;, utilize o assistente método para configurar um método de cromatografia de afinidade para a coluna que se destina a ser utilizado. NOTA: Sistemas automáticos de FPLC vêm com métodos pré-cheias com as configurações recomendadas (ou seja, vazão e limite de pressão) e execute os passos com base na coluna (fabricante, matriz e tamanho) seleccionado para a purificação. <ol><li> Use as seguintes etapas de execução para Proteína A cromatografia de afinidade: <ol><li> sistema de equilibrar com 5 CV de tampão de ligação e recolher flowthrough no recipiente de resíduos. </li><li> amostra de carga para a coluna (volume a ser carregado é especificada manualmente no método) e recolher flowthrough para um recipiente separado. </li><li> sistema de lavagem com 5 CV de tampão de ligação e recolher flowthrough em um recipiente separado. </li><li> coluna eluir com 5 CV isocratIC fraccionamento utilizando tampão de eluição e recolher amostras de anticorpo purificado em fracções por colector de fracções. </li><li> sistema de equilibrar com 5 CV de tampão de ligação e recolher flowthrough no recipiente de resíduos. </li></ol></li></ol></li><li> Uma vez que o método tem sido de configuração, especificar o volume de meio condicionado a ser aplicada à coluna e guardar o método. NOTA: O volume especificado no método deve ser de 5-10 ml menos do que o volume real para evitar a introdução de ar durante o exemplo de execução. O volume especificado utilizado neste protocolo é 90-120 ml. </li><li> Submergir o tubo de bomba da amostra para dentro do vaso que contém o meio condicionado. </li><li> Preparar um recipiente separado para recolher flowthrough amostra através do tubo de saída especificada. NOTA: É importante recolher o flowthrough no caso ocorre um erro durante a execução ou a capacidade de ligação da coluna é excedido exigindo a flowthrough para ser reaplicada para a coluna ou a purificação repeated. </li><li> Prepare tubos de coleta no coletor de fração. Adicionar 100 ul de tampão de neutralização por 1 ml de volume de fracção. O sistema de FPLC irá eluir automaticamente as fracções em tubos de colheita. </li><li> No módulo do software do &#39;Sistema de Controle&#39;, abra o método a ser executado. NOTA: O método de execução é iniciado em uma série de páginas que incluem a verificação das variáveis ​​do método, a configuração do coletor de frações e definir o nome arquivo de resultado e local de armazenamento. </li><li> Clique em Iniciar para iniciar a execução. O prazo pode ser monitorado no módulo do &#39;Sistema de Controle&#39;. </li><li> Após a conclusão da purificação prazo, verificar o cromatograma resultando no módulo &#39;Avaliação&#39; no software do sistema. </li><li> Combinar todas as fracções contendo proteína num tubo, a troca de tampão separada e concentra-se em PBS utilizando um dispositivo de filtro de centrífuga com 30 kDa de peso molecular de corte. Realize os passos de centrifugação de acordo com o fabricante doinstruções. </li><li> Medir a concentração de anticorpo utilizando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Se outra purificação prazo é para ser realizado, privilegiada a tubulação da bomba de amostra em tampão de ligação e repita os passos 4,9-4,14. </li><li> Na conclusão de corridas de purificação, mergulhe tubos de entrada de A, B e bomba da amostra em água ultrapura e lavar o sistema e coluna como executou na etapa 3. </li><li> Submergir A, B e tubulação da bomba de exemplo no procedimento de lavagem 20% de etanol e repita para o armazenamento do sistema e coluna. </li><li> Desligue a coluna da tomada a jusante e substituir rolha de coluna, em seguida, desligue coluna na entrada e substituir tampa, volte a ligar a tubulação para o sistema. Armazenar na coluna a 4 ° C. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este protocolo detalha a transfecção, a expressão estável e a purificação de um anticorpo terapêutico em células HEK-293. A expressão estável de genes de anticorpo é o primeiro passo na geração de uma linha de células produtoras de anticorpo para o desenvolvimento e a fabricação de um anticorpo terapêutico. Enquanto ovário de hamster chinês (CHO) continuam a plataforma de escolha para proteínas terapêuticas expressão, a linha de células HEK-293 está a ganhar proeminência com a percepção de que as proteínas produzidas ne...

O sucesso de anticorpos terapêuticos continua a impulsionar o investimento substancial no desenvolvimento de anticorpos como uma onda de terapêuticas próxima geração começa. O mercado de anticorpo deverá ser remodelada por fragmentos de anticorpos 1, conjugados de anticorpos droga-2, anticorpos biespecíficos 3 e anticorpos modificados com propriedades favoráveis 4. Outra classe ganhando interesse farmacêutico são biossimilares. anticorpos biossimilares são &quot;altamente semelhantes&quot; replicar produtos de um anticorpo terapêutico que já recebeu aprovação regulatória. A biossimilar proposto deve ser comparável com o anticorpo originador no que diz respeito à sua estrutura, função, toxicidade animal, a segurança clínica e eficácia, farmacocinética humana (PK), farmacodinâmica (PD) e imunogenicidade 5, 6. A aprovação rates de anticorpos biossimilares têm sido lentos devido às limitações estritas sobre a qualidade final do produto. Os processos de fabrico exactas, tais como linhas de células e condições de cultura específica através dos passos de processamento finais podem permanecer proprietária. O que é mais, a produção de anticorpos envolve inerentemente um grau de variabilidade que pode adicionar ao desafio de produzir um produto altamente semelhantes. A caracterização e comparação físico-química e biofísica abrangente é bastante difícil, mas uma série de estudos que demonstram as características dos anticorpos biossimilares estão surgindo na literatura 7, 8, 9. Geração de um anticorpo terapêutico começa com a transfecção de células hospedeiras de mamífero com um vector portador de genes para o respectivo anticorpo. projeto do vetor, as condições da linha celular e cultura são aspectos fundamentais para configurar o exsistema de pressão. As sequências de DNA de anticorpos podem ser provenientes de Drogas Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) ou publicações de pesquisa, incluindo patentes. Por exemplo, a sequência de trastuzumab está disponível através da droga Bank (DB ID: DB00072). A sequência de aminoácidos das regiões variáveis ​​podem ser submetidos a concepção do gene e a optimização para a síntese nas espécies hospedeiras desejadas. É importante para um anticorpo biológico similar que nenhuma modificação é feita com a sequência de aminoácidos. Uma vez sintetizados, os genes de anticorpo pode ser subclonado no vector apropriado de escolha. anticorpos IgG humana consistem de duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. Expressão fortemente regulada de ambas as cadeias é essencial para a produção óptima de proteína IgG heterólogo em células de mamífero 10. Intra-, bem como ligações dissulfureto inter-cadeias tem que ser formado e uma série de modificações pós-tradução tem que estar emtroduced durante a biossíntese da proteína. Uma série de vectores estão disponíveis, que foram especificamente concebidos para expressar genes de anticorpos (consultar a Tabela de Materiais). Estes vectores específicos de anticorpos normalmente expressam as regiões constantes para ambas as cadeias pesada e leve de modo que apenas as regiões variáveis ​​de cada cadeia requerem clonagem. A transfecção de células com duas construções independentes (co-transfecção), é a abordagem mais comum para a libertação de genes pesada e leve que codifica cadeia. Isto é, cada gene é conduzido pelo seu próprio promotor e transcrito como cadeias de anticorpo separadas antes de serem montadas no retículo endoplasmático. Por outro lado, os vectores multi-cistrónico têm elementos internos local de entrada de ribossoma (IRES) incorporados que permitem a expressão de múltiplos genes como um único transcrito de ARNm com tradução permitida a partir de regiões internas do ARNm 11. Neste exemplo, as pesadas e leves genes codificadores da cadeia são acoplados numa Arrangement para conseguir a co-expressão de ambas as cadeias de anticorpos 10, 12. Enquanto as células transfectadas transientemente produzir proteína suficiente para executar um número limitado de experiências, as linhas celulares transfectadas de forma estável que tenham sido submetidos a selecção para a integração do genoma pode proporcionar rendimentos mais elevados. Quantidades de proteína mais elevado para permitir que o desenvolvimento do ensaio, relativa a caracterização in vitro e pode proporcionar uma indicação da qualidade de anticorpos em consideração para aplicações a jusante, tais como a linha celular clonal e selecção de candidatos de chumbo. O objetivo deste artigo é descrever a expressão estável e a purificação de um anticorpo terapêutico produzido num sistema de expressão de mamífero. Com efeito, este método pode ser aplicado para a expressão de um anticorpo biológico similar. O método pode ser utilizado para a caracterização inicial de anticorpos, antes de prosseguir para o crítico, embora ste demoradops de identificar um clone desejável para o fabrico de maior escala. Além disso, este método pode ser utilizado para expressar proteínas e outros não apenas anticorpos. O protocolo detalhado seguinte descreve a expressão do anticorpo trastuzumab terapêutica. Esta consiste na preparação de DNA do vector seguido por transfecção estável na linha celular HEK-293 e a purificação da proteína do anticorpo por um método de cromatografia automatizado.

<table><tbody><tr><td>Série de vetores pFUSE</td><td>InvivoGen</td><td>N/A</td><td>Genes de anticorpos pesados e leves expressos em vetores separados que requerem co-transfecção.</td></tr><tr><td>Série vetorial mAbXpress</td><td>ACYTE Biotech Pty Ltd.</td><td></td><td>Genes de anticorpos pesados e leves expressos em vetores separados que requerem co-transfecção. Consulte: Jones, M. L. et al. Um método para reformatação rápida e independente de ligação de anticorpos monoclonais recombinantes. J Métodos Imunológicos. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).</td></tr><tr><td>Vetor pVITRO1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Os genes de anticorpos pesados e leves são acionados por um promotor separado em um único vetor. Consulte: Dodev, T. S. et al. Um kit de ferramentas para clonagem rápida e expressão de anticorpos recombinantes. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).</td></tr><tr><td>Série de vetores GS</td><td>Vetor multicistrônico Lonza com genes de anticorpos pesados e leves co-expressos e traduzidos como transcrito único.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetor multicistrônico série 1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Vetor multicistrônico com genes de anticorpos pesados e leves co-expressos e traduzidos como transcrito único. Consulte: Li, J. et al. Um estudo comparativo de diferentes desenhos vetoriais para a expressão de anticorpos IgG recombinantes em mamíferos. J Métodos Imunológicos. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).</td></tr><tr><td>Vetor multicistrônico série 2</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>Vetor multicistrônico com genes de anticorpos pesados e leves co-expressos e traduzidos como transcrito único. Consulte: Ho, SC et al. Vetores tricistrônicos mediados por IRES para aumentar a geração de linhas celulares CHO com alto teor de anticorpos monoclonais. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).</td></tr><tr><td>pVITRO1-Trastuzumabe-IgG1/&kappa;</td><td>Addgene</td><td>61883</td><td>Vetor de expressão de mamíferos contendo genes de anticorpos trastuzumabe com gene de resistência à higromicina; pVITRO1-Trastuzumabe-IgG1/&kappa; foi um presente de Andrew Beavil.</td></tr><tr><td>Ágar Higro de Mídia Rápida</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-s</td><td>Usado para preparar ágar LB com baixo teor de sal contendo 75 &micro; g/ml de higromicina.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro TB</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-l</td><td>Usado para preparar caldo TB com baixo teor de sal contendo 75 &micro; g/ml de higromicina.&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicerol, BioXtra, &ge; 99%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td>Prepare a 80% com água e autoclave. Armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit</td><td>Astral Scientific</td><td>G221020</td><td>Plasmid Maxi Prep Kit; eluir ou ressuspender DNA em água (pH 7.0-8.5).</td></tr><tr><td>Células FreeStyle 293-F</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td>Linha celular HEK-293 adaptada à cultura em suspensão em meio sem soro.</td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>Meio sem soro especialmente formulado para manutenção da linha celular 293-F e alta expressão de proteínas.</td></tr><tr><td>Kolliphor P188</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4894</td><td>Surfactante não iônico; plurônico F-68; prepare a 10% em água e esterilize por filtro usando 0,22 &mu; m. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Inativado por Calor Bovino</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina, Linear, MW 25,000&nbsp;</td><td>Policiências, Inc.</td><td>23966</td><td>Preparar para 1 mg/ml em água. Ajuste para pH 7,0 com HCl 1 M (a solução fica transparente) e esterilize com filtro usando 0,22 &mu; m. Armazene a -80 & C até o uso.</td></tr><tr><td>OptiPro SFM</td><td>Life Technologies</td><td>12309-050</td><td>Meio de transfecção formulado sem soro</td></tr> Solução de <tr><td>higromicina B Jomar</td><td>Life Research</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AJA2225</td><td></td></tr><tr><td>Triptona (peptona de caseína)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0042B</td><td>Prepare a 20% em PBS e esterilize com filtro usando 0,22 &mu; m. Armazene a 4 ° C.&nbsp;</td></tr><tr><td>Comprimidos de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4, 100 ml</td><td>Astral Scientific</td><td>09-2051-100</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Protein A High Performance, 1 x coluna de 5 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0403-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTApurifier 100</td><td>GE Healthcare</td><td>28406266</td><td>Sistema FPLC automatizado, que pode incluir uma bomba de amostra P-960 e um coletor de frações Frac-920.</td></tr><tr><td>Glicina-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Cítrico, monohidrato</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOC2123</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de Sódio, sal trissódico di-hidratado&nbsp;</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOCB0035</td><td></td></tr><tr><td>1 M Solução Tris-HCl pH 9.0</td><td>Filtros</td> Ultra Centrífugos <td>Astral Scientific BIOSD8146</td><td></td></tr><tr><td>Amicon (30 MWCO)</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC803008/UFC903008</td><td>Usado para tampão de troca e concentração de proteína purificada.</td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Ácido Bicinchonínico (BCA) Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>BLItz System</td><td>fort&eacute; BIO</td><td>45-5000</td><td>Instrumento usado para medições de interferometria de biocamada (BLI).</td></tr><tr><td>Os biossensores de proteína A</td><td>são fortes; BIO</td><td>18-5010</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida/Bisacrilamida (37,5:1), solução a 40%</td><td>Astral Scientific</td><td>786-502</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de Amônio (APS)</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0486</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0761</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Astral Scientific</td><td>786-498</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Proteína de Duas Cores Bio-Rad</td><td></td><td>padrão 1610374</td><td></td></tr></tbody></table>

produção à escala laboratorial e purificação de um anticorpo terapêutico

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Garantir que a produção bem-sucedida de um anticorpo terapêutico comece no início do processo de desenvolvimento. O primeiro estágio é a expressão vetorial dos genes de anticorpos, seguida pela transfecção estável em uma linhagem celular adequada. Os clones estáveis são submetidos a triagem para selecionar os clones com características de produção e crescimento desejadas. Esta é uma etapa crítica, embora demorada, no processo. Este protocolo considera a seleção de vetores e a fonte de sequências de anticorpos para a expressão de um anticorpo terapêutico. Os métodos descrevem a preparação de DNA vetorial para transfecção estável de uma variante de suspensão da linhagem celular 293 (HEK-293) do rim embrionário humano, usando polietilenimina (PEI). As células são transfectadas como células aderentes em meios contendo soro para maximizar a eficiência da transfecção e, posteriormente, adaptadas a condições livres de soro. A produção em larga escala, configurada como culturas de crescimento excessivo em lote, é usada para produzir proteína de anticorpo que é purificada por cromatografia de afinidade usando um instrumento automatizado de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC). Os rendimentos de anticorpos produzidos por este método podem fornecer proteína suficiente para iniciar a caracterização inicial do anticorpo. Isso pode incluir o desenvolvimento de ensaios in vitro ou caracterização físico-química para auxiliar na demorada tarefa de triagem clonal para candidatos principais. Este método pode ser transferível para o desenvolvimento de um sistema de expressão para a produção de anticorpos biossimilares.

Produção estável de trastuzumab por células HEK-293 transfectadas foi confirmada utilizando interferometria-camada de bio (BLI), como apresentado na Figura 1. Uma curva padrão de IgG foi gerado através da medição da taxa de ligação entre um padrão de anticorpos IgG e proteína A biossensor (Figura 1A). A amostra de sobrenadante em bruto foi medida de modo análogo, em seguida, a sua concentração interpolada a partir da curva padrão (Figura 1B).</st...

Este protocolo descreve a produção de um anticorpo terapêutico num sistema de expressão de mamífero. Os métodos descritos incluem a preparação de ADN do vector, transfecção estável e adaptação isento de soro de uma linha celular de rim embrionário humano 293, configurado de culturas em larga escala e a purificação utilizando cromatografia de afinidade.

Produção à escala laboratorial e purificação de um anticorpo terapêutico

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

O objetivo geral deste método é desenvolver um sistema de expressão livre de soro com alto rendimento para a produção em escala laboratorial de um anticorpo terapêutico. Este método pode abordar aspectos fundamentais no design de um sistema de expressão de anticorpos, como a produção de uma linhagem celular estável, a adição de suplementos e a otimização de estratégias de purificação. A principal vantagem desta técnica é que a produção de uma linhagem celular estável adaptada ao meio com soro gerará quantidades robustas e reprodutíveis de anticorpo terapêutico.Para começar, cultive células HEK-293 de acordo com protocolos padrão em meio livre de soro suplementado com 0,1% de agente tensoativo não iônico, em frascos erlenmeyer. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono a 120 rotações por minuto. Mantenha a cultura em duas vezes 10 à quinta células por mililitro e subcultive a cada quarto dia.No dia anterior à transfeção, semeie células HEK-293 a três vezes 10 elevado a cinco células por mililitro nos poços de uma placa de 12 poços em dois mililitros de DMEM com 10% de FBS inativado pelo calor. No dia da transfeção, verifique se as células atingiram 80 a 90% de

laboratory-scale-production-and-purification-of-a-therapeutic-antibody

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

A alta taxa de transferência de plataforma, desenvolvimento, fabricação automatizada de células da linha para a produção de proteínas terapêuticas é descrito. Implementação de BD Sorter celular FACS Aria, CloneSelect Imager e TECAN Freedom EVO sistema de manipulação de líquidos tem demonstrado capacidade de processamento aumentou significativamente no desenvolvimento de linhagem de células com melhor qualidade de células de linha e alta reprodutibilidade.

Uma plataforma de alta capacidade automatizada para o Desenvolvimento de linhagens celulares para a fabricação de proteínas Therapeutics

Este vídeo demonstra uma técnica para estudar a localização in vivo de anticorpos específicos do tumor em um modelo de xenoenxerto de tumor de camundongo. Após a injeção subcutânea de células cancerígenas em camundongos para a formação de tumores, são injetados anticorpos marcados com fluorescência que se ligam a receptores específicos do tumor, permitindo a avaliação in vivo da localização do anticorpo por meio de imagens.

Uma técnica para avaliar a localização in vivo de anticorpos específicos do tumor

O vídeo explica o processo de produção de anticorpos em células hospedeiras de mamíferos, desde a expressão gênica até a secreção. Envolve transcrição, tradução, reconhecimento de sinal, dobramento correto e eventual liberação no meio extracelular por meio de vesículas secretoras.

Produção e purificação de anticorpos recombinantes de células de mamíferos

Este vídeo demonstra um ensaio para purificar anticorpos monoclonais de fluido de cultura de células colhidas de células ovarianas de hamster chinês. Ele emprega uma resina de vidro porosa com proteína A imobilizada, que se liga à região Fc dos anticorpos na amostra, separando-os efetivamente dos contaminantes. O uso de um tampão de eluição de baixo pH enfraquece a interação, facilitando a recuperação de anticorpos purificados.

Uma técnica para purificar anticorpos monoclonais produzidos por células de ovário de hamster chinês

O vídeo demonstra um método para produzir anticorpos terapêuticos usando células de mamíferos transfectadas de forma estável. A suplementação de triptona estimula a divisão celular, resultando em crescimento excessivo e apoiando um maior rendimento de anticorpos. O meio contendo anticorpos é colhido, filtrado e armazenado para uso posterior.

Produção de anticorpos a partir de uma cultura de crescimento excessivo em lote de células de mamíferos transfectadas

Este vídeo demonstra uma técnica para purificar anticorpos monoclonais do sobrenadante de cultura obtido de uma cultura de células produtoras de anticorpos. O processo envolve o uso de uma matriz de grânulos de agarose reticulados com proteína A conjugada, que imobiliza os anticorpos no sobrenadante nos grânulos, permitindo uma separação eficaz dos contaminantes. Ao aplicar um tampão de eluição com pH baixo, a interação proteína-anticorpo A é afrouxada, facilitando a coleta de frações contendo...

Uma técnica de cromatografia de afinidade para a purificação de anticorpos monoclonais

Este vídeo demonstra um método para detectar as cepas de cianobactérias em uma amostra ambiental usando um chip de microarray de anticorpos. Amostras portadoras de várias bactérias interagem com anticorpos impressos, e a imunocoloração com anticorpos anti-cianobactérias marcados com fluoróforo revela a presença de cepas específicas de cianobactérias por meio de fluorescência em pontos distintos.

Uma técnica para detectar cepas de cianobactérias usando um chip de microarray de anticorpos

A presença de toxinas cianobacterianas em reservatórios de água doce para consumo humano é uma grande preocupação para as autoridades de gestão da água. Para avaliar o risco de contaminação da água, este artigo descreve um protocolo para a detecção em campo de cepas de cianobactérias em amostras líquidas e sólidas usando um chip de microarray de anticorpos.

Protocolo experimental para Detectar Cianobactérias Em amostras líquidas e sólidas com um Microarray Chip Antibody

Um protocolo detalhado para a purificação e a análise subseqüente de um anticorpo monoclonal do líquido de cultura de pilha colhido (HCCF) de microbioreactors automatizados foi descrito. O uso de análises para determinar os atributos críticos de qualidade (CQAs) e maximizar o volume de amostra limitado para extrair informações vitais também é apresentado.

Purificação e análise de um anticorpo monoclonal de células de ovário de hamster chinês usando um sistema de Microbioreator automatizado

Aqui apresentamos um protocolo para estudar a localização in vivo de anticorpos em modelos de xenoenxerto de tumores de camundongos.

Analisando tumor e distribuição de tecidos de anticorpo terapêutico específico de antígeno alvo

Aprenda a produzir anticorpos terapêuticos em escala laboratorial usando células HEK-293 em meio livre de soro. Este método estabelece linhagens estáveis adaptadas para obtenção de rendimentos robustos e reprodutíveis.

Produção à escala laboratorial e purificação de um anticorpo terapêutico

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