Name: Síntese de 1,2-Azaborines e preparação dos seus complexos de proteínas com T4 lisozima Mutantes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprenda a síntese de 1,2-azaborinas e a preparação de complexos proteicos com mutantes de lisozima T4. Este método confiável utiliza paládio em carbono e permite aplicações em pesquisa biomédica.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo National Institutes of Health NIGMS (R01-GM094541) e Boston College.

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</ol>

Todos os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes neste manuscrito.

Na primeira parte deste protocolo, descrevemos uma síntese modificada de 1,2-azaborines baseados em métodos previamente relatados 12, 13. Triallylborane 22 foi utilizado como um substituto para as rotas usando allyltriphenyl estanho ou de potássio allyltrifluoroborate para preparar N N -allyl- -TBS- B -alil aduto de cloreto de (1). Este método permite uma abordagem mais átomos de-econômica e amb...

Boro-azoto contendo heterociclos (ou seja, 1,2-azaborines) têm atraído recentemente a atenção significativa como isï¿½teros de arenes. Este isosterism pode levar a diversificação dos motivos estruturais existentes para expandir o espaço químico 2, 3, 4. Azaborines ter utilidade potencial para aplicação na investigação biomédica 5, 6, 7, 8, especialmente na área da química medicinal, em que os químicos realizar a síntese de bibliotecas de moléculas estruturalmente e funcionalmente relevantes. Significativamente, no entanto, embora existam inúmeras vias sintéticas bem desenvolvidos para moléculas contendo areno disponíveis, apenas um número limitado de métodos para a síntese de azaborines foram relatados 9, 10, </s-se&gt; 11, 12, 13. Isto é principalmente devido a um número limitado de opções para a fonte de boro e do ar e da natureza sensível à humidade da molécula na fase inicial da sequência sintética. Na primeira parte deste artigo, iremos descrever uma síntese escala multi-grama de N -TBS- B Cl-1,2-azaborine (3) utilizando técnicas livre de ar padrão. Este composto serve como um intermediário versátil que pode ser adicionalmente funcionalizado para moléculas estruturalmente mais complexo 14, 15. A partir de 3, será descrita a síntese e purificação de N -H- B -etil-1,2-azaborine (5) para utilização em estudos de ligação de proteína. Devido à volatilidade de 5, o seu isolamento eficiente requer um controlo preciso da temperatura de reacção, tempo, e distilação condições. Na segunda parte, os protocolos para a expressão da proteína e o isolamento de mutantes de T4 lisozima (L99A e L99A / M102Q) 17, 18, 19, 20 irá ser apresentada, seguido por cristalização de proteínas e preparação de complexos de cristais de proteína-ligando. Mutantes lisozima T4 e L99A L99A / M102Q foram escolhidos como sistemas modelo biológicos para examinar a capacidade de ligação de hidrogénio de moléculas contendo NH azaborine 17. Usando um protocolo padrão de biologia molecular, a proteína é expressa na estirpe Escherichia coli RR1 e induzidas com isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). purificação de proteínas é realizada utilizando cromatografia em coluna de permuta iónica. cristalização de proteínas é realizada com uma solução altamente concentrada de proteína purificado (&gt; 95% de pureza por electroforese em gel) usando a suspensãosoltar método de difusão de vapor. Devido à sensibilidade de ligandos deste estudo a oxigénio, os complexos proteína-ligando são preparados sob condições isentas de ar.

<table><tbody><tr><td>Tetrahidrofurano (THF), livre de inibidores, para HPLC, &ge; 99,9%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>34865</td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico (Et2O), para HPLC, &ge; 99,9%, livre de inibidores</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de metileno&nbsp; (CH2Cl2), (ACS estabilizado/certificado)</td><td>Fisher</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>Fisher</td><td>T290-4</td><td></td></tr><tr><td>Pentano, HPLC</td><td>Fisher</td><td>P399-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Fisher</td><td>A21-4</td><td></td></tr><tr><td>Hidreto de cálcio (CaH2), grau de reagente, 95%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>208027</td><td>Paládio pirofórico</td></tr><tr><td>em carvão ativado (Pd/C), 10% em peso Pd</td><td>Strem</td><td>46-1900</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M Solução de tricloreto de boro em hexano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>211249</td><td>Trietilamina altamente tóxica/pirofórica</td></tr><tr><td>, &ge; 99,5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471283</td><td></td></tr><tr><td>Grubbs Catalisador < geração >st</td><td>materia</td><td>C823</td><td></td></tr><tr><td>Acetamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0500</td><td></td></tr><tr><td>n-Butanol, anidro, 99,8%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>281549</td><td></td></tr><tr><td>Solução de etillítio, 0,5&nbsp; M em benzeno/ciclohexano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>561452</td> Solução de HCl <td>altamente tóxico/pirofórico</td></tr><tr><td>, 2.0 M em Et2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>455180</td><td></td></tr><tr><td>2-Metilbutano, anidro, &ge; 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli, (Migula) Castellani e Chalmers (ATCC&reg; 31343&trade;)</td><td>ATCC</td><td>31343</td><td></td></tr><tr><td>T4 lisozima WT* (L99A)</td><td>Addgene</td><td>18476</td><td></td></tr><tr><td>T4 lisozima mutante (S38D L99A M102Q N144D)</td><td>Addgene</td><td>18477</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina sal de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>isopropil-&beta;-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico anidro</td><td>Fisher</td><td>BP329</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico anidro</td><td>Fisher</td><td>BP332</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher</td><td>S642212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Fisher</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4880</td><td>Corrosivo</td></tr><tr><td>Thermo scientific pierce DNaseI</td><td>Fisher</td><td>PI-90083</td><td></td></tr><tr><td>GE Healthcare&nbsp; Meio de Troca Catiônica de Fluxo Rápido Sepharose</td><td>Fisher</td><td>45-002-931</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>TCI</td><td>S0489</td><td>Altamente tóxico</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Fisher</td><td>ICN806443&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sartório&nbsp; Concentradores Centrífugos Vivaspin 20</td><td>Fisher</td><td>14-558-501</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>2-Hidroxietil dissulfeto</td><td>Sigma Aldrich</td><td>380474</td><td></td></tr><tr><td>N-paratone&nbsp;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-643</td><td></td></tr><tr><td>4 RC Tubo de Membrana de Diálise 12.000 a 14.000 Dalton MWCO&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CryoLoop</td><td>Hampton Research</td><td></td><td>tubulação criogênica em forma de loop</td></tr><tr><td>CryoTong</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>criogênico tong</td></tr><tr><td>Coot</td><td></td><td></td><td>Imagens de densidade eletrônica são geradas a partir do software</td></tr></tbody></table>

síntese de 1,2-azaborines e preparação dos seus complexos de proteínas com t4 lisozima mutantes

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Descrevemos uma síntese geral de 1,2-azaborinas usando técnicas padrão sem ar e preparação de complexo proteico com mutantes de lisozima T4 por difusão de vapor. Os compostos sensíveis ao oxigénio e à humidade são preparados e isolados sob uma atmosfera inerte (N2) utilizando um colector de gases a vácuo ou um porta-luvas. Como exemplo de síntese de azaborina , demonstramos a síntese e purificação do volátil N-H-B-etil-1,2-azabourina por uma sequência de cinco etapas envolvendo destilação e cromatografia em coluna para o isolamento de produtos. Os mutantes L99A e L99A/M102Q da lisozima T4 são expressos com a cepa RR1 de Escherichia coli. Protocolos padrão para lise de células químicas seguidas de purificação usando coluna de troca iônica carboximetil fornecem proteínas de pureza suficientemente alta para cristalização. A cristalização de proteínas é realizada em várias concentrações de precipitante em diferentes faixas de pH usando o método de difusão de vapor de gota suspensa. A preparação complexa com as pequenas moléculas é realizada pelo método de difusão de vapor sob uma atmosfera inerte. A análise de difração de raios-X do complexo cristalino fornece evidências estruturais inequívocas de interações de ligação entre o local de ligação da proteína e as 1,2-azaborinas.

A via de síntese para 1,2-esquemática azaborines é mostrado na Figura 1. Isto aplica-se o protocolo para a síntese de cinco moléculas de boro-azoto contendo diferentes. A Figura 2 representa espectros de RMN de 11 B medida no decurso do passo 1.3 para monitorizar a formação do produto desejado (3). Purificação de proteínas foi realizada por cromatografia usando o sistema de baixa pressão e um cromatograma representativo é most...

Um protocolo para a síntese de 1,2-azaborinas e a preparação de seus complexos proteicos com mutantes de lisozima T4 é apresentado.

Síntese de 1,2-Azaborines e preparação dos seus complexos de proteínas com T4 lisozima Mutantes

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

O objetivo geral deste protocolo é descrever um método geral para a síntese de 1,2-azaborinas e suas potenciais aplicações em pesquisas biomédicas. A principal vantagem dessa técnica é que ela demonstra uma síntese segura de compostos de 1,2-azaborina, que são isósteros contendo boro derivados do ubiquitário motivo benzeno. O precursor descrito pode ser posteriormente funcionalizado em moléculas potencialmente mais complexas.A preparação de complexos proteicos com 1,2-azaborina fornecerá algumas perspectivas sobre aplicações futuras em pesquisas biomédicas. Para iniciar este procedimento, prepare o produto com o anel fechado conforme descrito no protocolo textual. Adicione 14 gramas de paládio sobre carbono a este produto preparado em tolueno.Em seguida, retire o frasco da caixa. Adapte ao frasco um condensador de refluxo 24/40 secado em estufa e previamente purgado com nitrogênio, equipado com água refrigerante. Coloque o frasco em um banho de óleo e aqueça a reação até refluxo vigoroso a 135 graus celsius, sob agitação.Mantenha a reação em refluxo durante 16 horas. Após esse período, remova o balão do banho de óleo para resfriar a reação até a temperatura ambiente. Depois que estiver resfriado, substitua o condensador de refluxo pela septa no balão de reação.Usando uma seringa equipada com uma agulha Luer Lock previamente seca em estufa, retire uma alíquota de 5 mililitros. Transfira a alíquota para um tubo de RMN com tampa rosqueável. Analise a amostra por meio de RMN de Boro-11.Se a reação estiver incompleta, transfira o frasco de reação para uma caixa de luvas. Em seguida, adicione mais três gramas de paládio sobre carvão. Depois, remova o frasco da caixa de luvas.Adapte o balão com uma condensadora de refluxo 24/40 que tenha sido purgada com nitrogênio e equipada com água gelada. Utilizando um banho de óleo, aqueça a reação até uma fervura vigorosa a 135 graus celsius, sob agitação, por 24 horas. Utilizando RMN de Boro-11, analise outra alíquota para garantir que a reação está completa.Após isso, transfira o frasco de reação de volta para a caixa de luvas. Passe a mistura de reação por uma coluna de cromatografia em fase rápida, preenchida com lenços de papel. Em seguida, colete o filtrado em um frasco redondo de um litro equipado com um bastão de agitação.Lave a coluna com 50 mililitros de tolueno. Remova o recipiente do filtrado da caixa de luvas e conecte-o a um sistema de vácuo equipado com uma linha de nitrogênio. Coloque um banho-maria sob o frasco e um dewar contendo nitrogênio líquido para aprisionar o solvente.Abra a válvula de alto vácuo para iniciar a remoção de todos os voláteis do filtrado. Em seguida, retorne a mistura de reação para a caixa de luvas. Transfira a mistura para um balão de fundo redondo de 250 mililitros, junta 24/40, previamente seco em estufa, contendo um bastão de agitação.Lave a mistura reacional residual com diclorometano e transfira-a para o frasco. Tampe o frasco com uma septa. Transfira o frasco da caixa de luvas para o sistema de vácuo e conecte-o.Abra a válvula de alto vácuo para remover o solvente residual. Em seguida, remova rapidamente a septa e adicione hidreto de cálcio usando uma espátula. Conecte o balão de fundo redondo ao aparato de destilação descrito no protocolo do texto e ajuste a temperatura do banho de óleo para 100 graus Celsius.Após a conclusão da destilação, remova a fonte de calor e resfrie o aparato até a temperatura ambiente. Re-pressurize o aparato resfriado com nitrogênio e feche firmemente a válvula de esfera no frasco de armazenamento isento de ar. Após transferir o produto isolado do frasco para um vial em uma caixa de luvas, armazene o vial no congelador da caixa de luvas.Após purificar a proteína, transfira a solução purificada para um tubo de membrana de diálise. Coloque o tubo de diálise em um recipiente contendo quatro litros de solução de fosfato de sódio 100 milimolar, cloreto de sódio 550 milimolar e azida de sódio 0,2%. Agite durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte, adicione 2-mercaptoetanol à amostra dialisada, de modo que a concentração final seja de cinco milimolares. Em seguida, utilize um concentrador centrífugo para concentrar a solução até 40 miligramas por mililitro. Gire a amostra a 5.000 RPM e seis graus Celsius, e remova qualquer precipitado após a concentração.Em seguida, em uma placa de 24 poços, prepare várias condições com a solução reservatório, conforme descrito no protocolo textual. Utilize graxa para selar firmemente, aplicando-a na borda de cada poço. Misture cinco microlitros da solução concentrada de proteína com cinco microlitros da solução reservatório em uma lamínula de vidro silanizada.Coloque a lamínula virada ao contrário sobre as cavidades contendo a solução reservatório. Armazene a placa a 4 graus celsius para o crescimento de cristais. Usando um laço de tubo criogênico, retire os cristais formados e coloque-os em um tubo de microcentrifugação de 6 mililitros.Adicione 50 microlitros de licor-mãe. Em seguida, transfira o tubo para uma caixa de luvas. Transfira cinco microlitros do ligante azaborina preparado para o interior da tampa do tubo.Tampe o tubo e armazene-o em uma geladeira dentro da caixa de luvas por dois a sete dias para equilíbrio por difusão de vapor. Após esse período, deposite uma gota de N Paratone sobre uma lâmina de vidro. Usando uma micropipeta, transfira um cristal para a lâmina.Em seguida, use um laço de tubo criogênico para pegar o cristal e transferi-lo da solução aquosa para o N Paratone. Mergulhe o cristal protegido com N Paratone em um recipiente contendo nitrogênio líquido. Usando pinças criogênicas, monte o cristal congelado por choque no laço.Em seguida, analise os dados cristalinos coletados conforme descrito no protocolo textual. Neste estudo, apresenta-se uma síntese modificada de 1,2-azaborinas com base em métodos previamente relatados. O tri-álcool borino é utilizado para preparar o aduto de cloreto de N-álcool NTBSB-álcool.Uma sequência de uma etapa e dois passos é empregada para a síntese do NTBS BCl 1,2-azaborina, o que resulta em um rendimento isolado maior do que os métodos anteriores. A síntese da 1,2-azaborina N-H-B-etil é realizada em duas etapas, utilizando etillítio no lugar do complexo de cromo empregado nos métodos previamente descritos. A proteína é purificada utilizando um sistema de cromatografia de baixa pressão.Um cromatograma realizado a 280 nanômetros mostra um pico compatível com a mutante da T4 lisozima, L99am102q. A proteína é então cristalizada e complexada com ligantes. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a síntese da azaborina requer o uso de condições livres de ar, como uma caixa de luvas e um manifold de vácuo e gás, para prevenir a decomposição dos compostos.Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para explorar as propriedades químicas e físicas únicas das azaborinas em comparação com os aromáticos carbocíclicos em bolsões clássicos de recuperação areal biológica.

synthesis-12-azaborines-preparation-their-protein-complexes-with-t4

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Partículas de adenovírus são concebidos para conter tanto o azidohomoalanine análogo não natural amino ácido ou o açúcar...

Modificação de Superfícies quimiosseletiva virais através Química Clique Bioorthogonal

Um protocolo para o diastereosseletivo preparação de um pote de cis - N-Ts-iodoaziridines é descrito. A geração de diiodomethyllithium, além de N-Ts aldiminas e ciclização do amino-gem-di-iodeto intermediário para iodoaziridines é demonstrada. Também está incluído um protocolo para avaliar rapidamente e quantitativamente a fase estacionária mais adequada para a purificação por cromatografia.

Síntese e Purificação de Iodoaziridines Envolvendo Quantitative Seleção do Optimal fase estacionária para cromatografia

Aqui, apresentamos um protocolo para introduzir sondas químicas específicas do local em um fragmento de anticorpo, incorporando geneticamente um aminoácido contendo azida e, subsequentemente, acoplando a azida a uma sonda química por cicloadição de azida-alcino promovida por cepa (SPAAC).

Eficiente e Rotulagem de anticorpos por cicloadição Azide-alcino promoveu-Strain Site-specific

Íons aziridinium bicíclicos como 1-azoniabicyclo [4.1.0] heptano tosilato foram gerados a partir de 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl] aziridina polivalentes, o qual foi utilizado para a preparação de piperidines substituídos e azepanes via regio - e estereoespecífico expansão do anel-com vários nucleófilos. Este protocolo altamente eficiente nos permitiu preparar azaheterocycles diversas, incluindo produtos naturais, tais como fagomine, febrifugine analógica e balanol.

Preparação de Íons Aziridínio Bicíclicos Estáveis e sua Abertura de Anel para a Síntese de Azaheterociclos

3-Aroyl-N-hidroxi-5-nitroindoles foram sintetizados por cicloadição de 4 nitronitrosobenzeno com uma alquino terminal conjugada em um procedimento térmico de um passo. A preparação do nitrosoarenno e das alquinonas foi adequadamente relatada e, respectivamente, por meio de procedimentos de oxidação na anilina correspondente e no alquinol.

Uma síntese direta, regioseletiva e atom-econômica de 3-Aroyl-N-hidroxi-5-nitroindoles por Cycloaddition de 4-Nitronitrosobenze com Alkynones

Neste estudo, preparamos tanto os enantiomers de aziridina-2-carboxilato, que são usados na síntese assimétrica de alcaloides, incluindo biemamida B e D, e (-)-epiallo-isomuscarina.

Preparação de Aziridinas Não Ativadas Enantiopure e Síntese de Biemamida B, D e epiallo-Isomuscarina

Este protocolo descreve como realizar a marcação de proteína específica do tipo celular com azidonorleucina (ANL) usando uma linha de camundongo expressando uma L274G-Metionina tRNA sintetase mutante (MetRS*) e as etapas necessárias para o isolamento de proteínas específicas do tipo celular marcadas. Delineamos duas possíveis vias de administração de ANL em camundongos vivos por (1) água potável e (2) injeções intraperitoneais.

Purificação e identificação de proteínas específicas do tipo celular de tecidos complexos usando uma linha de camundongo mutante de metionina tRNA sintetase

As bisaziridinas contíguas contendo aziridinas não ativadas e ativadas foram sintetizadas por aziridinas organocatalíticas assimétricas e, em seguida, submetidas a reações quimiosseletivas de abertura de anéis em condições ácidas ou básicas. O anel de aziridina não ativado se abre com nucleófilos menos reativos sob condições ácidas, enquanto o anel de aziridina ativado se abre com nucleófilos mais reativos em condições básicas.

Preparação de bisaziridinas contíguas para reações regiosseletivas de abertura de anéis

Este protocolo descreve um método para produzir e avaliar a atividade antimicrobiana e a citotoxicidade do peptídeo catiônico Mel4 e do mímico de peptídeos RK758. Ao integrar síntese química, expressão recombinante e ensaios funcionais padronizados, proporciona um fluxo de trabalho simplificado para a produção e teste de peptídeos e imitadores de pequenas moléculas.

Produção e Testes de Peptídeos Antimicrobianos e Seus Mimics

Descrevemos procedimentos para a preparação e entrega de microcristais de proteínas de membrana em fase cúbica lipídica para cristalografia seriada em lasers de elétrons livres de raios-X e fontes síncrotron. Esses protocolos também podem ser aplicados para incorporação e entrega de microcristais de proteínas solúveis, levando a uma redução substancial do consumo de amostras em comparação com a injeção de líquidos.

Preparação e entrega de microcristais de proteína na fase cúbica lipídico para Serial Femtosecond Cristalografia

Aprenda a síntese de 1,2-azaborinas e a preparação de complexos proteicos com mutantes de lisozima T4. Este método confiável utiliza paládio em carbono e permite aplicações em pesquisa biomédica.

Síntese de 1,2-Azaborines e preparação dos seus complexos de proteínas com T4 lisozima Mutantes

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