Viva Imagem Confocal de Desenvolvimento de Arabidopsis Flores

O objetivo geral deste procedimento é preparar inflorescências de Arabidopsis thaliana para imagens de botões florais vivos em desenvolvimento com um microscópio confocal. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento floral sobre a formação e posicionamento dos órgãos florais e a dinâmica das células-tronco florais. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite imagens ao vivo das flores à medida que se formam, o que é fundamental para entender o que é essencialmente um processo dinâmico.

Para expor os botões florais para imagens, use uma pinça para remover as inflorescências secundárias e os botões florais mais antigos da inflorescência primária. Em seguida, use a pinça para fazer um orifício vertical na agarose de um prato de dissecação. Agora corte os últimos 0,5 centímetros da inflorescência e instale-a na vertical na agarose com os botões de flores restantes acima da superfície da agarose.

Encha o prato com água deionizada estéril para que o ápice do broto fique totalmente imerso e use uma pipeta de 1.000 microlitros para liberar qualquer ar preso ao redor do ápice do broto. Em seguida, coloque a amostra sob um microscópio estéreo. Use a pinça para remover os botões de flores que não devem ser fotografados da amostra imersa.

Ao atingir o estágio sete botões florais, remova a água da placa de dissecação, recoloque a placa de dissecação sob o microscópio e termine a dissecção. O ápice pode então ser colocado na vertical no meio de uma placa de imagem, de modo que apenas o meristema apical do caule e os botões florais circundantes fiquem acima da superfície do meio. Se não corar o ápice imediatamente, use uma pipeta de 1.000 microlitros para adicionar uma gota de água à amostra para mantê-la hidratada.

Para manchar os botões florais, primeiro remova a água da superfície da placa de imagem com um pedaço de papel de seda. Em seguida, coloque o prato de lado para drenar a água restante da superfície média. Espere um minuto e remova a água acumulada com um novo lenço de papel.

Em seguida, sob o microscópio, use uma pipeta de 10 microlitros para aplicar 20 a 30 microlitros da coloração apropriada, cuidando para que toda a amostra seja coberta para garantir uma coloração homogênea. Após o período de incubação apropriado, enxágue os brotos duas vezes com água deionizada estéril. Para imagens em um microscópio invertido, use uma pipeta de 1.000 microlitros para colocar uma gota de água deionizada estéril na ponta da lente.

Em seguida, virando o prato de imagem de cabeça para baixo, adicione uma gota de água deionizada estéril ao ápice de dissecação e coloque a amostra de cabeça para baixo no estágio do microscópio, tomando cuidado para não esmagar a amostra. Use os controladores X, Y e Z para colocar o ápice dissecado em contato com a gota na ponta da lente. Uma coluna de água se formará.

Para imagens em um microscópio vertical, encha o prato de imagem com água deionizada estéril para que a superfície do meio e as amostras fiquem completamente imersas em 2,5 a cinco milímetros de água. Em seguida, coloque o prato no microscópio vertical stage e ajuste a lente de imersão em água no stage para que a ponta da lente mergulhe na água. Em seguida, use uma pipeta de 1.000 microlitros para remover qualquer bolha de ar presa na ponta da lente.

Para qualquer tipo de microscópio, quando a amostra estiver pronta, use o controlador X, Y para posicionar um dos ápices dissecados dentro do campo da lente e o controlador Z para focar na amostra. Quando uma amostra for localizada, use o software do microscópio confocal para ampliar o botão de flor de interesse para obter uma imagem. Defina os parâmetros de imagem e defina a parte superior e inferior da pilha Z e, em seguida, prossiga para a imagem do botão floral.

Para ablação a laser dos primórdios sépalas, mude o caminho da luz para a câmera associada ao sistema de ablação a laser. Em seguida, use o software do sistema de ablação a laser para definir a zona de ablação. Em seguida, defina a potência do laser e o tempo de permanência para os parâmetros apropriados para ablação de células suficientes sem infligir muitos danos aos tecidos subjacentes e, em seguida, inicie a ablação.

Se forem realizados experimentos de lapso de tempo, decantar a água e cobrir o prato para evitar a desidratação entre os pontos de tempo da imagem. Em seguida, colocar as amostras nas condições de cultura adequadas. A maioria dos sistemas confocais permite a aquisição de imagens de dois fluoróforos com espectros de emissão não sobrepostos juntos, como GFP ou YFP com iodeto de propídio ou FM4-64.

Os melhores sistemas confocais também são capazes de separar vários fluoróforos com espectros de emissão parcialmente sobrepostos nas mesmas amostras, como GFP ou YFP, DsRed e iodeto de propídio, conforme ilustrado nesta imagem representativa. Aqui, são mostrados exemplos de experimentos de lapso de tempo com botões florais que se desenvolveram normalmente após a ablação sépala com um sistema de ablação a laser ou manualmente com uma torna de pino e um pino de metal. A ablação a laser da primodia sépala emergente deste botão de flor os impediu de cobrir o meristema da flor, que ainda podia ser fotografado no estágio cinco.

Por outro lado, neste botão floral, a ablação a laser apenas atrasou o crescimento da sépala, embora as sépalas tenham crescido para cobrir a maioria dos meristemas florais no estágio cinco. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar Arabidopsis para a imagem confocal de botões de flores vivas. Seguindo este procedimento, dados qualitativos e quantitativos podem ser extraídos de suas imagens confocais usando diferentes softwares de análise de imagem.

Essa técnica ajudará os pesquisadores no campo do desenvolvimento de plantas a explorar a dinâmica da expressão gênica, divisão celular e formação de órgãos em flores vivas em desenvolvimento.