Name: Inchaço na Organóides intestinal induzida por forscolina: An In Vitro Ensaio para a Avaliação de Medicamentos Response na Fibrose Cística Os pacientes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprenda a avaliar a função do CFTR e a resposta a moduladores em organoides intestinais derivados de pacientes com fibrose cística usando o ensaio de inchaço induzido por forscolina. Este método permite testes personalizados de eficácia de medicamentos.

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Este trabalho foi apoiado pelo programa HIT-CF dos holandeses CF fundação (CNSF), ZonMW (40-00812-98-14103), Fundo de Investigação Hospital Infantil de Wilhelmina e CZ, e Zilverenkruis / Achmea. Nós gostaríamos de agradecer a S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot, e G. Berkers (Departamento de Pneumologia Pediátrica, Hospital de Wilhelmina Children, UMC Utrecht), e RHJ Houwen (Departamento de Gastroenterologia Pediátrica, Wilhelmina Hospital infantil, UMC Utrecht) para abordar os pacientes e recebendo as biópsias para a geração de um CF Biobank.

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Hans Clevers é um inventor de patentes para cultura de organoides e o ensaio de inchaço induzido por Forskolin. Jeffrey M Beekman é um inventor de uma patente para o ensaio de inchaço induzido por Forskolin. Sylvia F Boj e Robert Vries são empregados pela Fundação Hubrecht Organoid Technology (HUB), que detém a licença exclusiva para a Organoid Technology. Caso contrário, os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, nós fornecemos um protocolo completo para a geração, a expansão, o congelamento e descongelamento das Organóides colorectal humanos. Enquanto nós estabelecemos culturas organï¿½de humanos há algum tempo atrás 17, tem por vezes sido difícil para estabelecer a tecnologia em outros laboratórios, sem treinamento prático. Prevemos que esses protocolos irá substituir essa formação. -Wnt-3A meio condicionado é um dos reagentes mais importantes para ter sucesso no estab...

FC é causada por mutações no gene da fibrose cística regulador da condutância transmembranar (CFTR), que codifica um canal de anião epitelial. CF afeta cerca de 85.000 pessoas em todo o mundo 1. Mais de 2.000 mutações CFTR foram identificados ( <a href="http://www.genet.sickkids.on.ca">www.genet.sickkids.on.ca</a> ). Esta diversidade explica parcialmente um amplo espectro de fenótipos da doença observados ( <a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a> ) 2, 3. Seis classes de mutações CFTR são definidos com base no seu efeito na expressão da proteína de CFTR e função de: (i) nenhuma síntese, (II) tráfico prejudicada, (III) gating canal defeituoso, (IV) condutância alterada, (v) níveis de normalmente reduzida CFTR funcional, e (VI) a estabilidade da superfície de células deficientes 4. Embora as mutações CFTR comuns são bem estudadas, a função de CFTR e sua relação com o estado clínico permanecem poorlY compreendido no nível do indivíduo, em particular para a grande grupo de &quot;órfãos&quot; mutações raras ( <a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a> ) 1, 3. Recentemente, as drogas que têm sido desenvolvidos como alvo a proteína CFTR de um modo específico da mutação. Duas classes de CFTR drogas-alvo proteínas estão atualmente em uso clínico e têm modos distintos de ação. Potenciadores, tais como VX-770, aumentar a probabilidade, aberto de CFTR mutante apical-localizados e agir diretamente sobre sua adição às células 5. Correctores, tais como VX-809, restaurar o tráfico de endoplasmático CFTR misfolded localizada-retículo e exigem pré-incubação com células antes que os efeitos são observados 6. O potenciador CFTR, VX-770, foi registrado para indivíduos com a mutação G551D 7, 8, bem como para outros oitoCFTR gating mutações, incluindo S1251N 9; em conjunto, estas mutações são realizados por 5% de todos os pacientes com FC. Outros estudos clínicos indicaram que VX-770, combinado com o corrector de VX-809, tem limitado ainda efeitos significativos sobre a função pulmonar e provoca uma diminuição nas taxas de exacerbação em indivíduos homozigóticos para a mutação F508del transportadas por 45-50% dos pacientes 10, 11. ensaios clínicos convencionais para identificar temas de droga-responsivo dentro os restantes 50% de pacientes com FC são dispendiosos e consumidores de tempo e não são viáveis ​​para os indivíduos com genótipos CFTR extremamente raros. Novel,, métodos personalizados de baixo custo são cruciais para coincidir com o número crescente de moduladores de CFTR aos indivíduos portadores de qualquer tipo de mutação CFTR. Até agora, a inclusão julgamento de grupos de pacientes portadores de mutações CFTR específicas tem sido orientada por estudos utilizando mutante transfecção gene CFTR em hsistemas de células de eterologous, seguidos por estudos eletrofisiológicos em câmaras de Ussing 5, 6, 12. Devido a uma falta de modelos animais adequados, CF estudos de eficácia de drogas em células epiteliais brônquicas ar-líquido da interface diferenciadas derivadas de materiais de explante pulmonar FQ têm sido utilizados para o desenvolvimento de fármacos 13, 14, 15. No entanto, a disponibilidade limitada de tecidos de explantes pulmonares e os procedimentos invasivos para obter células brônquicas de indivíduos sem a doença em fase terminal dificultar a análise de mutações CFTR menos comuns e impedir que o teste de drogas de forma personalizada. Para superar essas limitações, tecidos &quot;fácil acesso&quot;, como Organóides colorretais, células das vias aéreas nasais e células das vias respiratórias derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas, estão actualmente a ser exploradas para tratamentos com medicamentos personalizados. <p class= &quot;jove_content&quot;&gt; Anteriormente, estabelecemos protocolos para a cultura de células estaminais epiteliais de qualquer órgão gastrointestinal na forma de 3D Organóides 16, 17. factores de crescimento para o cólon / recto humana, definidos envolvem as condições de cultura (Factor de Crescimento Epitelial (EGF), gastrina, Wnt-3A, R-espondina 3 (Rspo3), e Noggin) combinado com pequenas moléculas (nicotinamida, A83-01, e SB202190) numa matriz de membrana basal. Sob estas condições, as células estaminais individuais ou pequenos fragmentos de tecido crescer até formarem cística, estruturas 3D fechado formado por epitélio altamente polarizada com o lado basal orientada para o exterior. Todos os tipos de células normalmente aparecem em suas proporções normais e posições. Organóides pode ser expandida ao longo de períodos longos por ruptura mecânica semanal e re-plaqueamento. Eles são geneticamente e fenotipicamente estáveis e podem ser armazenados, permitindo a expansão de longo prazo e bio-banking 17. Eles são passíveis detodas as manipulações de células-biológico padrão / genéticos e técnicas de análise desenvolvido para linhas celulares 2D 18. Recentemente, demonstramos que a função CFTR pode ser facilmente medido em Organóides colorretais em um ensaio de edema induzido por forscolina (FIS) 19, 20. Quando exposto a forscolina (FSK) ou, alternativamente, a toxina da cólera, Organóides aumentar rapidamente a sua monofosfato de adenosina cíclico níveis (cAMP), que por sua vez, resulta na abertura do canal CFTR 19. Organóides de indivíduos saudáveis, ou a partir de indivíduos com mutações de CFTR associado com função residual, vai inchar subsequentemente como uma consequência de iões e de transporte de água para o lúmen, organï¿½de o equivalente in vitro de diarreia secretora. A resposta de FIS Organóides colorrectais foi mostrado previamente para ser totalmente CFTR-dependente, tal como indicado por Organóides derivadas de indivíduos CFTR-null, umnd pela utilização de inibidores de CFTR farmacológicas específicas 19. Grandes conjuntos de dados específicos de um assunto pode ser derivada dentro de várias semanas depois de tomar uma biópsia. Para o ensaio de FIS descrito em detalhe aqui, Organóides são cultivadas a partir de biópsias rectais que podem ser obtidos em qualquer idade e com apenas desconforto limitada 21. Organóides são passadas semanalmente por perturbação mecânica em criptas de solteiro que facilmente fechado hermético e formar novos Organóides. Para a execução do ensaio de FIS, ~ 30-80 destes Organóides pequenos rompidas foram semeadas em cada poço de uma placa de 96 poços 19. No dia do ensaio, as Organóides são coradas com verde calceína, um corante fluorescente de células-permeável que é mantido dentro de células vivas, facilitando imagens ao vivo. Em seguida, Fsk, o que aumenta o AMPc intracelular e deste modo activa CFTR, é adicionado a fim de estimular o inchaço organï¿½de. Potenciadores que atuam sobre CFTR apical são adicionados simultaneamente wom o forskolin, enquanto corretores que restauram tráfico CFTR são adicionados 24 horas antes da adição de Fsk. O inchaço organï¿½de é quantificada pela análise de imagem automatizado que calcula o aumento relativo da área total de todos os objectos fluorescentes para cada ponto de tempo após a adição de forscolina. 3D organï¿½de inchaço oferece vantagens e desvantagens sobre leituras CFTR eletrofisiológicos existentes nas células das vias aéreas cultivadas em 2D em Ussing câmaras. Uma grande vantagem é a capacidade do ensaio de inchamento. As células são cultivadas e analisadas utilizando um único tipo de meio de cultura, e um técnico experiente pode cultura até 25 amostras organï¿½de numa base semanal, enquanto quantificando cerca de 1.200 pontos de dados por semana em 12 amostras de pacientes. Nós convencionalmente digitar uma única condição experimental por meio de medições em duplicado ou triplicado por placa e repetir tais medições em três momentos de incubação independentes. No total, cerca de 300-500 single organï¿½de estruturas são então medidos por condição experimental, o que leva a medições muito precisas da função CFTR com variabilidade técnica limitada. Esta precisão permite-nos definir claramente diferenças na função residual e resposta para moduladores de CFTR e nos permite escolher facilmente se os efeitos genéticos fundo entre os pacientes portadores de mutações CFTR idênticos 19, 22, 23, 24, 25. A qualidade dos dados pode ser facilmente avaliada a partir de imagens de microscópio. Enquanto FIS é totalmente CFTR-dependente, é uma medida de resultado indirecto para a função CFTR, o seu fora de leitura causada pelo acoplamento de transporte de íons para o transporte de fluidos. Isto contrasta com medições da função CFTR diretos em câmaras Ussing, que medem transepiteliais correntes iônicas 26. câmaras de Ussing permitir a estimulação seleccionado de apical ou basolateral Compartments (que o ensaio organï¿½de não permite); por permeabilização de membranas basolaterais, a secreção dependente de anião CFTR apical pode ser medido selectivamente 27.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco Avançado' s Meio de Águias Modificado com Mistura de Nutrientes F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#12634</td><td>armazenado a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#35050</td><td>armazenado a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td># 15630-056</td><td>armazenado a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#15140-122</td><td>armazenado a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>Placa de cultura de 96 poços</td><td>Cellstar</td><td>#655180</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de 24 poços</td><td>Cellstar</td><td>#662160</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de 6 poços</td><td>Cellstar</td><td>#657160</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Salight (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS)</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#14190-094</td><td>armazenado a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águias Modificadas Médias&nbsp; (DMEM) 500 ml&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#31966-021</td><td>Para Produção Média Condicionada Wnt-3A. Armazenado a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>#SFBS LOTE#11113</td><td>Para Produção Média Condicionada Wnt-3A. Armazenado a -20 > Linha</td></tr><tr><td>celular CL Wnt3A</td><td>ATCC</td><td>#CRL-2647</td><td>para produção de meio condicionado Wnt-3A.</td></tr><tr><td>Plasmídeos TOP/FOP</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>#17-285</td><td>Para medir a atividade Wnt</td></tr><tr><td>pTK-Renilla</td><td>Promega&nbsp;</td><td>#E2241</td><td>Para medir a atividade Wnt</td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>ATCC</td><td>#CRL-1573</td><td>Para medir a atividade Wnt</td></tr><tr><td>Sistema de Ensaio Reporter Dual-Luciferase</td><td>Promega&nbsp;</td><td>#E1910</td><td>Para medir a atividade Wnt</td></tr><tr><td>Zeocin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#R250-01</td><td>Para Wnt-3A Seleção de linha celular</td></tr><tr><td>B27 suplemento&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#17504-044</td><td>armazenado a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>N-Acetilcisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A9165-5G</td><td>armazenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#N0636</td><td>armazenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Epitelial Humano (hEGF)</td> <td>PrepoTech</td><td>#AF-100-15</td><td>armazenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G9145</td><td>armazenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>TGFb tipo I Inibidor do receptor (A83-01)&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>#2939</td><td>armazenado em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato (RhoKi)</td> <td>Selleckchem</td><td>#S1049</td><td>armazenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>p38 Inibidor de MAPK (p38i) (SB202190)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#S7067</td><td>armazenado a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>#ant-pm-1</td><td>armazenado a -20 & C</td></tr><tr><td>Human Noggin (hNoggin)</td> <td>PrepoTech</td> <td># 120-10C</td><td>armazenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>R-sespondina humana 3 (hRspo-3)</td><td>R& D Systems</td><td>#3500-RS/CF</td><td>armazenado a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>Vancomicina</td><td>Sigma Aldrich</td> <td># 861987 - 250mg</td><td>armazenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#15710-049</td><td>armazenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiamina tetracético (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#431788</td><td>Armazenado a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td> <td># 354230</td><td>armazenado a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>TryplE Express&nbsp;</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#12605-010</td><td>para tripsinização de organoides para congelamento</td></tr><tr><td>Congelamento de cultura de células de recuperação Medium</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#12648010</td><td>para congelamento</td></tr><tr><td>de calceína</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#C3100MP</td><td>armazenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>R& D Systems</td><td>#1099-50 mg</td><td>armazenado a -80 &graus; C</td></tr><tr><td>Lumacaftor (VX-809)</td><td>Selleckchem</td><td>#s1565</td><td>armazenado a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Ivacaftor (VX-770)</td><td>Selleckchem</td><td>#s1144</td><td>armazenado a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Nome dos Reagentes/Material</td><td>Solvente</td><td>Concentração de estoque</td><td>Concentração Final</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td></td><td>200 mM</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td>1 M</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td></td><td>10K U/ml 10K &micro; g/ml</td><td>100 U/ml 100 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>de zeocina&nbsp;</td><td></td><td>100 mg/ml&nbsp;</td><td>125 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>de suplemento de B27</td><td></td><td>100x</td><td>1x</td></tr><tr><td>N-Acetilcisteína</td><td>MiliQ H2O</td><td>500 mM</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>DPBS</td><td>1 M</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Epitelial Humano (hEGF)</td><td>DPBS 0,1% BSA</td><td>0,5 mg</td><td>/ml 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Gastrina</td><td>DPBS</td><td>100 &micro; M</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>TGFb tipo I Inibidor do receptor (A83-01)&nbsp;</td><td>DMSO</td><td>5 mM</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato (RhoKi)</td><td>DMSO</td><td>10 mM</td><td>10 &micro; </td></tr><tr><td>M p38 inibidor de MAPK (p38i) (SB202190)</td><td>DMSO</td><td>30 mM</td><td>10 &micro; </td></tr><tr><td>M Primocin</td><td></td><td>50 mg/ml&nbsp;</td><td>100 &micro; g / ml</td></tr><tr><td>de Noggin Humano (hNoggin)</td> <td>DPBS 0,1% BSA</td><td>100 e micro; g/ml</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>R-spondina humana 3 (hRspo-3)</td><td></td><td>varia por lote</td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>Vancomicina</td><td></td><td>10 mg/ml</td><td>50 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td></td><td>10 mg/ml</td><td>50 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiamina tetracético (EDTA)</td><td>MiliQ H2O</td><td>0,5 M</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Calceína</td><td>DMSO</td><td>10 &micro; g/ml</td><td>3,3 ng/ml</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>DMSO</td><td>10 mM</td><td>variável</td></tr><tr><td>Lumacaftor (VX-809)</td><td>DMSO</td><td>20</td><td>mM variável</td></tr><tr><td>Ivacaftor (VX-770)</td><td>DMSO</td><td>20</td><td>mM variável</td></tr></tbody></table>

inchaço na organóides intestinal induzida por forscolina: an<em&gt; in vitro</em&gt; ensaio para a avaliação de medicamentos response na fibrose cística os pacientes

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Drogas moduladoras do regulador de condutância transmembrana (CFTR) de fibrose cística recentemente desenvolvidas corrigem a expressão superficial e/ou função do canal CFTR mutante em indivíduos com fibrose cística (FC). A identificação de indivíduos que podem se beneficiar desses medicamentos é um desafio devido à extensa heterogeneidade das mutações do CFTR, bem como a outros fatores desconhecidos que contribuem para a eficácia individual do medicamento. Aqui, descrevemos um ensaio simples e relativamente rápido para medir a função individual do CFTR e a resposta aos moduladores CFTR in vitro. Organoides epiteliais tridimensionais (3D) são cultivados a partir de biópsias retais em meio organoide padrão. Uma vez estabelecidos, os organoides podem ser bioarmazenados para análise futura. Para o ensaio, 30-80 organoides são semeados em placas de 96 poços na matriz da membrana basal e são então expostos a drogas. Um dia depois, os organoides são corados com verde calceína e o inchaço induzido por forscolina é monitorado por microscopia confocal de células vivas a 37 ° C. O inchaço induzido por forscolina é totalmente dependente de CFTR e é suficientemente sensível e preciso para permitir a discriminação entre as respostas medicamentosas de indivíduos com mutações CFTR diferentes e até idênticas. As respostas de inchaço in vitro se correlacionam com a resposta clínica à terapia. Este ensaio fornece uma abordagem econômica para a identificação de indivíduos responsivos a medicamentos, independentemente de suas mutações no CFTR. Também pode ser fundamental no desenvolvimento de futuros moduladores CFTR.

A Figura 1A mostra um isolamento fresco representante da criptas incorporados em BMM. As criptas são a partir de uma biópsia de um sujeito colorrectal CF. Normalmente, um organï¿½de é gerado a partir de cada cripta (Figura 1A - C). Devido à disfunção da CFTR, a maioria dos Organóides cólon CF não são cística, mas sim são compactos e com projecções e brotos (Figura 2A - 2B). No entanto, alguns CF organï¿½...

Este protocolo descreve um ensaio para medir a função do CFTR e as respostas do modulador do CFTR em tecido cultivado de indivíduos com fibrose cística (FC). Os organoides intestinais derivados de biópsia incham de forma impulsionada pelo AMPc, uma resposta que é defeituosa (ou fortemente reduzida) nos organoides da FC e pode ser restaurada pela exposição a moduladores de CFTR.

Inchaço na Organóides intestinal induzida por forscolina: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio para a Avaliação de Medicamentos Response na Fibrose Cística Os pacientes

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a função individual do CFTR e a eficácia de tratamentos moduladores do CFTR utilizando um ensaio de inchaço induzido por forskolina, ou ensaio FIS, em organoides intestinais gerados a partir de pacientes com Fibrose Cística. Este método aborda questões fundamentais na área da Fibrose Cística. Notadamente, auxilia na identificação de pacientes que podem se beneficiar a longo prazo de medicamentos existentes ou experimentais.A principal vantagem dessa técnica é que tecidos facilmente acessíveis podem ser utilizados para gerar organoides de qualquer paciente com fibrose cística, independentemente da idade. As implicações dessa técnica estendem-se à terapia ortogênica da Fibrose Cística e atendem a uma necessidade urgente atual de testar a eficácia de medicamentos de forma econômica e individualizada. O procedimento será demonstrado por Marvin Statia, da Hubrecht Organoid Technology, e por Annelot Vonk, do grupo de Jeffrey Beekman.Para obter dados ideais do ensaio de inchaço induzido por forskolina, é essencial trabalhar com uma cultura contendo organoides grandes com múltiplas brotações. Após identificar tal cultura, rotule um tubo cônico

forskolin-induced-swelling-intestinal-organoids-an-vitro-assay-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Aqui, um protocolo para a colheita, manter, e tratar rato pequenas Organóides intestinais com padrões de agentes patogénicos associados moleculares (PAMPs) e Listeria monocytogenes é descrito, bem como a ênfase na expressão de genes e técnicas de normalização adequada para a proteína.

o<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Reconhecimento de Padrões Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organóides

Este protocolo descreve a medição da permeabilidade da barreira epitelial em tempo real seguir tratamento farmacológico em organoids intestinal humana, usando microscopia fluorescente e vive microscopia de célula.

Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana

Aqui nós descrevemos um método para gerar culturas esferoide tridimensional de células epiteliais nasais humanas. Esferoides são então estimulados a unidade de fibrose cística regulador de condutância transmembrana (CFTR)-íon dependente e secreção fluida, quantificar a mudança no tamanho luminal esferoide como um proxy para função CFTR.

Geração de células epiteliais nasais humanas esferoides para individualizado fibrose cística condutância transmembrana regulador estudo

Um protocolo detalhado é apresentado aqui para descrever um modelo organoide in vitro de células epiteliais nasais humanas. O protocolo tem opções de medições que requerem equipamentos de laboratório padrão, com possibilidades adicionais de equipamentos e softwares especializados.

Cultura e Imagem de Organoides Epiteliais Nasais Humanos

Este protocolo descreve um método para o estudo de proteínas de membrana eletrogênicas através da medição de mudanças no potencial de membrana. Este ensaio fornece uma plataforma para a leitura funcional de múltiplos canais iônicos expressos endogenamente em linhagens celulares epiteliais.

Ensaio de Potencial de Membrana Baseado em Fluorescência para Estudo Funcional de Alto Rendimento de Dois Canais Iônicos Endógenos em Duas Linhagens Celulares Epiteliais

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a cultura dos organoides intestinais caninos em um sistema de suporte permeável de câmara dupla. São descritos os suportes permeáveis, a manutenção da monocamada e os experimentos subsequentes de permeabilidade de drogas.

Organoides intestinais caninos em um sistema de suporte permeável de câmara dupla

Organoides intestinais derivados da biópsia e tecnologias de órgãos em chips são combinados em uma plataforma microfisiológica para recapitular a funcionalidade intestinal específica da região.

Combinando organoides humanos e tecnologia organ-on-a-chip para modelar funcionalidade específica da região intestinal

Este protocolo descreve a análise da morfologia organoide retal (ADM), um novo ensaio diagnóstico para fibrose cística (FC). As características morfológicas, nomeadamente a arredondamento (índice de circularidade, IC) e a presença de um lúmen (razão de intensidade, RI), são uma medida da função CFTR. A análise de 189 sujeitos mostrou perfeita discriminação entre FC e não FC.

Análise da Morfologia Organoide Retal (ADM): Um Ensaio Diagnóstico na Fibrose Cística

Co-culturas organóide-fibroblastos fornecem um modelo para estudar o nicho de células-tronco in vivo . Aqui é descrito um protocolo para co-culturas esofágico-organóide-fibroblasto. Além disso, imagens de montagem inteira são usadas para visualizar a interação fibroblasto-organoide.

Caracterização funcional e visualização de fibroblastos esofágicos utilizando co-culturas organoides

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar organoides intestinais de ratos e usá-los em várias aplicações a jusante. Os ratos são frequentemente um modelo pré-clínico preferido, e o robusto sistema organoide intestinal preenche a necessidade de um sistema in vitro para acompanhar os estudos in vivo .

Geração e Manipulação de Organoides Intestinais em Rato

Este estudo descreve um protocolo para gerar monocamadas 2D de organoides suínos derivados dos intestinos delgado e grosso. O crescimento dessas monocamadas é marcado pelo aumento dos valores de TEER, indicando integridade epitelial robusta. Além disso, essas monocamadas exibem respostas secretoras fisiológicas em experimentos de câmara de Ussing após a aplicação de forscolina.

Organoides intestinais suínos bidimensionais refletindo as propriedades fisiológicas do intestino nativo

Aprenda a avaliar a função do CFTR e a resposta a moduladores em organoides intestinais derivados de pacientes com fibrose cística usando o ensaio de inchaço induzido por forscolina. Este método permite testes personalizados de eficácia de medicamentos.

Inchaço na Organóides intestinal induzida por forscolina: An In Vitro Ensaio para a Avaliação de Medicamentos Response na Fibrose Cística Os pacientes (Vídeo) | JoVE Journal

Inchaço na Organóides intestinal induzida por forscolina: An

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