Inchaço na Organóides intestinal induzida por forscolina: An In Vitro Ensaio para a Avaliação de Medicamentos Response na Fibrose Cística Os pacientes

Este protocolo descreve um ensaio para medir a função do CFTR e as respostas do modulador do CFTR em tecido cultivado de indivíduos com fibrose cística (FC). Os organoides intestinais derivados de biópsia incham de forma impulsionada pelo AMPc, uma resposta que é defeituosa (ou fortemente reduzida) nos organoides da FC e pode ser restaurada pela exposição a moduladores de CFTR.

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a função individual do CFTR na eficácia dos tratamentos moduladores do CFTR usando um inchaço induzido por forscolina, ou ensaio FIS, em organoides intestinais gerados a partir de pacientes com fibrose cística. Este método aborda questões-chave no campo da fibrose cística. Mais notavelmente, ajuda na identificação de pacientes que podem se beneficiar a longo prazo de medicamentos existentes ou experimentais.

A principal vantagem dessa técnica é que o tecido de fácil acesso pode ser usado para gerar organoides de qualquer paciente com FC, independentemente da idade. As implicações desta técnica se estendem à ortoterapia da fibrose cística e atendem a uma necessidade atual urgente de testar a eficácia do medicamento de maneira econômica e individual. Demonstrando o procedimento estarão Marvin Statia da Hubrecht Organoid Technology e Annelot Vonk do grupo Jeffrey Beekman.

Para obter dados ideais do ensaio de inchaço induzido por forscolina, é essencial trabalhar com uma cultura contendo grandes organoides com vários brotamentos. Depois de identificar essa cultura, rotule um tubo cônico de 15 mililitros com o nome da amostra e um tubo como lavado. Em seguida, use uma pipeta p1000 para aspirar cuidadosamente o meio dos poços de cultura organoide sem perturbar as gotas da matriz da membrana basal.

E adicione um mililitro de meio basal a cada poço. Agora use a pipeta para quebrar as gotas da matriz da membrana basal em cada poço e transfira as suspensões organoides resultantes para o tubo de 15 mililitros com o nome da amostra. Enxágue cada poço com outro milímetro de meio basal e puxe as lavagens no tubo de amostra.

Quando todas as amostras tiverem sido coletadas, encha o tubo de amostra até um volume final de 12 mililitros com meio basal e use uma pipeta pré-úmida de cinco mililitros para misturar a solução. Em seguida, centralize os organoides, ressuspendendo o pellet em um mililitro de meio basal fresco. Cubra a mesma ponteira de pipeta p1000 com uma ponteira p10 sem filtro e tente classificar a suspensão 20 vezes.

Em seguida, descarte as duas pontas e use uma pipeta de cinco mililitros para adicionar quatro mililitros de meio basal fresco à amostra. Incline o tubo cerca de 70 graus e misture vigorosamente a solução duas a três vezes com a nova ponta de pipeta p1000 pré-molhada. Segure o tubo na posição inclinada por 10 segundos.

Em seguida, use a mesma pipeta p1000 para transferir o mililitro superior da amostra para os tubos lavados quatro vezes. Após a colheita da última amostra, colete os organoides por centrifugação e ressuspenda o pellet em 120 microlitros de matriz de membrana basal a 50%. Em seguida, coloque uma gota de três microlitros em uma lâmina de microscópio de vidro e confirme a presença de pelo menos 30 a 50 organoides dentro da gota sob um microscópio de luz.

Em seguida, coloque três gotículas de oraganóide de microlitro no meio de cada poço de uma placa de 96 poços e coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius por 15 minutos para solidificar a matriz da membrana basal. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio de cólon completo mais VX809, ou um meio de cólon completo sozinho aos poços organoides apropriados e retorne a placa à incubadora por 18 a 24 horas. No dia seguinte, use uma pipeta repetidora para adicionar 10 microlitros de solução de cálcio a cada poço, ressuspendendo os poços uma vez com uma pipeta multicanal para garantir que estejam se misturando e retorne a placa à incubadora por mais 30 minutos.

Enquanto as células estão sendo coradas, predefina a ferramenta de imagem ao vivo no microscópio confocal de imagem de células vivas para 37 graus e cinco por cento de dióxido de carbono para pré-incubar a câmara de imagem. No final da incubação, transfira a placa para o suporte da placa no microscópio confocal e use a opção de configuração inteligente para selecionar a pista Alexa floor 488. Em seguida, defina as cinco lentes ex e a área de varredura para 0,6x para diminuir o zoom e capturar todo o poço.

Ajuste a potência do laser e a sensibilidade do detector para permitir a detecção ideal dos organoides marcados com verde cálcio sobre o fundo. E defina a profundidade de bits para oito e o tamanho do quadro para 512 por 512 pixels. Use a opção de série temporal para definir o tempo, a frequência e os intervalos de medição.

E a opção de bloco para determinar manualmente as posições individuais do poço. Agora adicione 100 microlitros de forscolina recém-preparada e/ou VX770 aos poços correspondentes, começando com o primeiro poço a ser fotografado, e comece a medição. Devido à disfunção do regulador de condutância transmembrana da fibrose cística, ou CFTR, a maioria dos organoides da fibrose cística do cólon são compactos em tamanho e não incham ou demonstram muito pouco inchaço 60 minutos após a estimulação da forscolina, dependendo de seu genótipo.

No entanto, quando os organoides da FC são tratados com moduladores de CFTR antes da estimulação da forscolina, os organoides exibem um aumento no inchaço. Para quantificar o inchaço, as áreas totais da superfície verde de cálcio podem ser medidas em cada ponto de tempo. Uma vez dominadas, essas técnicas podem ser concluídas em três ou quatro horas se forem executadas corretamente.

Antes de tentar este procedimento, o passo mais importante é a otimização das condições de cultura para organoides intestinais, uma vez que culturas de boa qualidade determinarão o desempenho ideal do ensaio FIS. Depois de assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como trabalhar com culturas organoides intestinais e, posteriormente, medir a atividade do CFTR e a resposta dos moduladores do CFDR usando um ensaio de inchaço induzido por forscolina.