Name: Isolamento eficaz de ilhotas funcionais a partir de ratinho neonato Pâncreas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T11:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprenda a isolar ilhotas intactas de pâncreas de ratinhos neonatos usando colagenase e centrifugação por gradiente. Este método simples permite obter 20 a 80 ilhotas por pâncreas para estudos de secreção de insulina e expressão gênica.

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Este trabalho foi financiado por uma bolsa do NIDDK (DK065949 para GG). Agradecemos à Dra. Brenda M. Jarvis e Jeff Duryea Jr. pela leitura do manuscrito.

utilização de animais segue os procedimentos especificados no protocolo M / 11/181 aprovado pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use Vanderbilt para Gu. ratinhos CD1 ou CBA / Bl6 foram adquiridos de fornecedores comerciais e cruzou no biotério Vanderbilt obter camundongos neonatais. 1. Preparação de Ratos, Soluções de Stock, and Equipment <ol><li> Para a cruz mouse: configurar uma cruz mouse e registrar as datas entupimento para auxiliar o planejamento experimental. ratinhos CD1 normalmente dão à luz por volta do dia 19 após o acasalamento. Use CD1 ou CBA / BL6 cruza para obter CD1 ou CBA / Bl6 neonatos, respectivamente. Intercruzamentos entre as duas linhas de utilizar fêmeas CD1 e machos CBA / Bl6. </li><li> Para o estoque de colagenase: pesar 200 mg de colagenase tipo IV com uma balança de alta precisão. Transferir para um tubo de centrífuga de 50 mL. Dissolve-se em 40 ml de HBSS com Ca2 + / Mg2 + (1,26 e 0,5 mM, respectivamente) para produzir uma solução stock de 5 mg / mL. <ol><li> Permitir que a colagenasedissolver para ~ 30 min com agitação suave. Alíquotas e manter a solução congelada em -20 ° C como estoque, que permanece activo durante pelo menos um ano. </li></ol></li><li> Autoclave para esterilizar vários pares de pinças, tesouras e dicas P20 para dissecção e picking ilhéu. </li><li> Para o estoque de glucose 1 H: pesar 9 g de glucose em um tubo de centrífuga de 50 ml, adicionar 50 ml de meio RPMI 1640 para dissolver a glicose. Tenha em 4 ° C até à sua utilização, mas não mais do que 6 meses. </li></ol> 2. As soluções de trabalho NOTA: O dia de isolamento de ilhotas, preparar os seguintes reagentes. <ol><li> Para a solução IV trabalho colagenase tipo: descongelar e diluir estoque colagenase no gelo. Dispensar 0,15 mL estoque em cada tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Adicionar 1,35 mL de HBSS com Ca2 + / Mg2 +. Inverta o tubo 5 vezes. Deixar em gelo durante 15 min. <ol><li> Girar em alta velocidade por 3 min numa microcentrífuga. Transferir o sobrenadante para um novo tubo. Deixar em gelo até à sua utilização. Rejeitar o tubo de detritos insolúveis. </li></ol></li><li> Para completo de mídia RPMI 1640: adicionar 2,5 mL 1 glucose M, 50 mL de calor FBS inactivado, e 5 mL 100x estoque Pen-strep em 500 ml RPMI 1640. Deixar em gelo até à sua utilização. </li></ol> 3. Isolamento pâncreas e Digestão <ol><li> Eutanásia neonatos com isoflurano, seguido por decapitação de acordo com protocolos aprovados. </li><li> Coloque o mouse com a barriga virada para cima. Spray com 70% de etanol para esterilização. </li><li> Levantar a pele de barriga para cima, com uma pinça e cortar as camadas da pele e músculo longitudinalmente ao longo da linha média com um par de tesouras, a partir da área genital para a caixa torácica. Isto abre a cavidade abdominal para expor todos os órgãos internos. </li><li> Transferir todos os órgãos internos, de 100 cm de placa com um par de pinças. Localize o pâncreas, que é um órgão-dispersa com uma porção dorsal que se agarra ao estômago e baço e uma porção ventral que se agarra ao duodeno 11. </li&gt; <li> Adicionar HBSS no prato para submergir os órgãos. Em solução, os tecidos pancreáticos não se agarram ao duodeno, estômago, ou baço. É facilmente reconhecível sob um escopo de dissecação causa de sua cor branca típica. Use um par de pinças para descascar os tecidos pancreáticos longe do tecido circundante e transferir para um novo prato 60 mm, com HBSS. </li><li> Corte cada pâncreas com uma tesoura em pedaços menores que 5 mm em qualquer dimensões. Transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Até cinco pancreata (menores de P7) pode ser digerida em um tubo. Para ratos P8-P16, use um tubo por pâncreas. </li><li> Adicionar 0.5 - Solução de trabalho de 1 ml a cada tubo colagenase (0,2 ml para cada pâncreas P1-P7 Utilizar 0,5 mL por cada pâncreas P8-P16.). Deixar o tubo numa incubadora a 37 ° C durante até 15 min. Inverta o tubo duas vezes a cada min. </li><li> Depois de ~ 5 min, toque no tubo para monitorar o estado de digestão do tecido pancreático. Prosseguir o processo de digestão até que a maior parte do pâncreastecido aparece como grupos de células fragmentadas, com diâmetro &lt;2 mm. O ligado aparece turva, o que é devido a autólise celular acinar normal. </li></ol> 4. Lysate de lavar roupa <ol><li> Girar o lisado a 500 xg durante 10 s numa microcentrifuga. Retirar a camada sobrenadante com um Pipetman P1,000. O sobrenadante deve aparecer turva mas desprovido de agregados de células. Não utilizar aspiração, que pode aspirar rapidamente afastado os fragmentos de tecido na parte inferior devido à presença de uma amostra de DNA pegajoso. </li><li> Adicione 1 mL RPMI 1640 mídia completo. Toque suavemente o tubo para voltar a suspender o lisado fragmentado. Inverta cima e para baixo 10 vezes. Repita o passo 4.1. </li><li> Repita o passo 4.2 mais duas vezes ou até que o sobrenadante claro. Re-suspender pancreï¿½ticos lavadas em 1 mL completos RPMI 1640. </li></ol> 5. Isolamento Islet NOTA: Para um pequeno número de pancreata, mão-picking direto como a seguir (5.1) pode ser usado para o isolador do ilhéução. Para grandes números de pâncreas (&gt; 6), é preferido o método descrito no ponto 5.2. <ol><li> mão-picking direto: <ol><li> Transferir o lisado do passo 4.3 para um prato de 60 mm. Adicionar 5 ml completos RPMI 1640. Traga sob um microscópio de dissecação. </li><li> Configurar a iluminação de campo brilhante no microscópio. Ajustar a intensidade da luz de ~ 50% da potência máxima. Sob esta condição, ilhotas aparecer como um pouco cachos cor de rosa, enquanto as células acinares aglomerados de forma irregular como escuras (Figura 1A). A ampliação de ~ 50X (combinando o poder da objetiva e da parte do olho) é recomendado para oferecer a melhor maneira de ilhotas visualização e a abertura ponta da pipeta, simultaneamente, para a colheita. </li><li> Pegar ilhotas com uma ponta de pipeta P20, evitando aglomerados acinares. Fracções dispensar ilhotas enriquecido a um novo prato de 60 milímetros com meio RPMI completo (Figura 1B). </li><li> Repita o processo de mão-picking mais duas vezes. Deixar ilhotas puro em uma nova 60prato mm com 4 ml de meio RPMI completo (Figura 1C). </li></ol></li><li> centrifugação em gradiente: <ol><li> Preparar um tubo de centrífuga de 15 ml que é pré-carregado com 2 mL de polissacarose e diatrizoato de sódio, a uma densidade de 1,077 g / mL. Deixe o tubo em gelo até à sua utilização. </li><li> Transferir a suspensão do passo 4.3 sobre o topo da solução de diatrizoato de sódio e polissacarose com uma pipeta de Pasteur. Não perturbe a camada inferior. Os tecidos de até 10 recém-nascidos ou 2 P17 pancreata pode ser colocada em cada tubo de 15 ml. </li><li> Girar o tubo de a ~ 600 x g num rotor oscilante durante 15 min a 4 ° C. Use as configurações de freio-off. </li><li> Após a centrifugação, transferir a mídia e camadas interfase (note que em condições de operação ideais, as ilhotas será localizado na interfase entre o polissacarose e cultura da mídia após a centrifugação) para um novo tubo de 15 mL. Adicionar 10 ml de mídia, misture delicadamente mas completamente. </li><li> Spin down a fração enriquecida com ilhéua 300 xg durante 5 min. Remova o meio de lavagem. Repetir a lavagem mais uma vez com meio RPMI completo. Pelotas Ressuspender em 4 mL de mídia, que contém a maioria dos ilhéus e dutos (Figura 1D). </li><li> Mão-pegar as ilhotas, conforme descrito na secção 5.1. </li></ol></li></ol> 6. Os ensaios GSIS em isolados Ilhotas <ol><li> Incubar os ilhéus a partir do passo 5.1.4 em meio RPMI completo, durante 2 h num incubador de cultura de tecido C 37 °. </li><li> Usar uma pipeta para remover RPMI sob um microscópio de dissecação. Adiciona-se 3 mL de solução de KRB com glucose 2,8 mM e a placa 3. Agitar 10 vezes para lavar as ilhotas. Remover soluções KRB. <ol><li> Repetir o processo de lavagem uma vez. Incubar as ilhotas com 3 mL de solução de KRB a 37 ° C durante 1 hora numa incubadora. </li></ol></li><li> Aliquota de 1 mL de KRB a cada poço de uma placa de 12 poços. Pré-aqueça o estoque KRB e placa a 37 ° C em uma incubadora. </li><li> Lavar as ilhotas duas vezes com KRB pré-aquecido como em 6.2. transfer 10 ilhotas para cada poço das placas pré-aquecido. Incubar numa incubadora a 37 ° C. </li><li> Após 45 minutos, retirar-se 50 ul de sobrenadante. Este contém a solução de insulina segregada sob basais de glucose. </li><li> Adicionar glucose 32 mL de 500 mM. Agitar a placa 20 vezes para misturar a solução. Incubar numa incubadora a 37 ° C. Agitar a placa 5 vezes a cada 5 min. </li><li> Após 45 minutos, retirar-se 50 uL de sobrenadante. Esta é a insulina segregada sob alto teor de glucose. </li><li> Transfira todas as ilhotas a um tubo de 1,5 mL. Congelar em -20 ° C durante 30 min. Descongelar à temperatura ambiente durante 5 min. Repita o processo de congelamento e descongelamento. </li><li> Adicionar 0,5 mL de etanol a 70% com HCl 20 mM. Deixe durante a noite. Esta é a insulina nas ilhotas. </li><li> Use de ELISA convencional para ensaiar os níveis de insulina, descrito anteriormente 3. </li></ol>

<ol><li>Matsumoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+pancreatic+islet+cell+isolation+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+%28Bayl+Univ+Med+Cent%29%22%5BJournal%5D)">Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation.</a> Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galphao+represses+insulin+secretion+by+reducing+vesicular+docking+in+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).</li>
<li>Planas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+for+the+human+pancreas+and+purified+islets+in+type+1+diabetes%3A+new+findings+at+clinical+onset+and+in+long-standing+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes.</a> Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).</li>
<li>Tonne, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+profiling+of+pancreatic+islets+in+mice+during+streptozotocin-induced+beta-cell+damage+and+pancreatic+Glp-1+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy.</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).</li>
<li>London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+functional+evaluation+of+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans.</a> Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).</li>
<li>Rorsman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+glucose+to+elicit+a+normal+secretory+response+in+fetal+pancreatic+beta+cells+results+from+glucose+insensitivity+of+the+ATP-regulated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).</li>
<li>Hellerstrom, C., Swenne, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+and+proliferation+of+fetal+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).</li>
<li>Blum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+beta-cell+maturation+is+marked+by+an+increased+glucose+threshold+and+by+expression+of+urocortin+3%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).</li>
<li>Hegre, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymic+in+vitro+isolation+of+perinatal+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans.</a> In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).</li>
<li>Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), e102445(2015).</li>
<li>White, J., White, D. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+J+%22Source+Book+of+Enzymes%2C+Source+Book+of+Enzymes%22">Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes</a>. , C.R.C. Press. (1997).</li>
<li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).</li>
<li>Bouwens, L., Rooman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pancreatic+beta-cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of pancreatic beta-cell mass.</a> Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes para o trabalho descrito.

Aqui, nós fornecemos um protocolo passo-a-passo de isolamento de ilhotas de pâncreas que são demasiado pequenos para perfusão convencional. Espera-se, para se obter ilhotas prontos para todos os estudos baseados em purificação de ilhotas, tais como beta-célula, a análise da expressão do gene, a maturação das células beta dos ilhéus pancreáticos, proliferação, as respostas de stress celular, sobrevivência celular, metabolismo, e manutenção GSIS funcional, etc. Este será, para o melhor do nosso conhecimento, o pr...

O isolamento de ilhotas pancreáticas puras é essencial para a dosagem da secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) de células beta e para o transplante de ilhotas de doadores cadáveres 1-3. Também é necessário estabelecer a expressão gênica endócrina nas células das ilhotas 4, 5. Para este fim, protocolos detalhados foram estabelecidos para permitir o isolamento de ilhotas pancreáticas de grandes pancreatas (6 e referências neles). Esses métodos são baseados na perfusão enzimática para dissociar o acinar dos tecidos das ilhotas, juntamente com a separação por gradiente e a colheita manual. Assim, o isolamento das ilhotas do pâncreas grande pode ser realizado prontamente na maioria dos laboratórios. Por outro lado, não existe um protocolo passo a passo detalhado para permitir o isolamento de ilhotas do pâncreas que são pequenas demais para serem perfundidas.
Estudar a expressão gênica e a função das ilhotas neonatais é importante. As ilhotas neonatas têm propriedades diferentes dos adultos na capacidade de secreção e proliferação de insulina 7, 8. No entanto, isolar ilhotas de animais recém-nascidos, especialmente camundongos, é um desafio devido ao pequeno tamanho do pâncreas recém-nascido. O tamanho impede o processo de perfusão usual quando a colagenase é injetada através do ducto pancreático. De fato, vários trabalhos apresentaram estudos nesse sentido, com procedimentos de isolamento enzimáticos ou não enzimáticos 7, 9, 10. No entanto, falta uma descrição detalhada do processo de isolamento das ilhotas com auxílio visual 7, 9, tornando um desafio para a maioria dos pesquisadores realizar estudos semelhantes. 
Exploramos várias condições diferentes que produzem ilhotas de alta qualidade de camundongos neonatais. Aqui, apresentamos um protocolo que deve ajudar os pesquisadores a aprender os principais detalhes do processo de isolamento das ilhotas. Este protocolo é aplicável ao pâncreas de camundongos até duas semanas de idade, após o qual a perfusão pode ser realizada para isolamento de rotina das ilhotas. As ilhotas podem ser usadas diretamente para ensaios de secreção de insulina e expressão gênica.

<table><tbody><tr><td>Colagenase Tipo IV</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS com Ca2+/Mg2+</td><td>Mediatech/Cellgro, Manassas, VA</td><td>MT21020CV</td><td>Se o HBSS sem Ca2+/Mg2+ for obtido, CaCl2 e MgSO4 podem ser adicionados a 1,26 e 0,5 mM, respectivamente.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 sem glicose</td><td>Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA</td><td>11879-020</td><td>A glicose precisa ser adicionada a níveis específicos para não interferir no uso subsequente das ilhotas.&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>G-7021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>solução de polissacarose e diatrizoato de sódio</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>Histopaque-10771</td><td></td></tr><tr><td>Estereoscópio</td><td>Carl-Zeiss, Oberkochen, Alemanha</td><td>Stemi2000</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Leica, Wetzlar, Alemanha</td><td>Microcentrífuga Leica M165</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Centrífuga 5417C</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Centrifuge 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Tubos centrfuge de 15 mL</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>Tubos centrfuge de 50 mL</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Balança de precisão</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>VWR-225AC</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfuga</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000</td><td>Fisher Scientific,&nbsp; Waltham, MA</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P20</td><td>Fisher Scientific,&nbsp; Waltham, MA</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>prato de 100 x 15 mm</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>prato de 60 x 15 mm</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25384-168</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de 12 poços</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>Scissor</td><td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA</td><td>14080-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA</td><td>5708-5</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos CD1</td><td>Charles River Laboratories, Wilminton, MA&nbsp;</td><td>CD-1</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>O laboratório Jackson, Farmington, CT&nbsp;</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>B6CBAF1/J</td><td>O laboratório Jackson, Farmington, CT&nbsp;</td><td>B6CBAF1/J</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento eficaz de ilhotas funcionais a partir de ratinho neonato pâncreas

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

protocolos de isolamento de ilhotas-à base de perfusão de grande pâncreas de mamíferos estão bem estabelecidos. Tais protocolos estão prontamente realizado em muitos laboratórios, devido ao grande tamanho do ducto pancreático que permite a injecção pronto colagenase e subsequente perfusão tecidual. Em contraste, o isolamento de ilhotas do pâncreas pequena, como a de ratinhos neonatais, é um desafio porque perfusão não é facilmente realizável na pequena pâncreas. Aqui nós descrevemos um procedimento simples detalhado que recupera um número substancial de ilhotas de ratos recém-nascidos com assistência visual. pancreata inteiro recentemente dissecados foram digeridos com 0,5 mg / ml de colagenase IV dissolvido em Hanks &#39;Solução Salina Equilibrada (SSHE) a 37 ° C, em tubos de microcentrífuga. Os tubos foram aproveitado regularmente para ajudar a dispersão do tecido. Quando a maior parte do tecido foi disperso em pequenos aglomerados de cerca de 1 mM, lisados ​​foram lavados três a quatro vezes com meio de cultura com 10% de soro fetal de bovino (FBS). aglomerados de ilhotas,desprovidas de tecidos acinares reconhecíveis, pode então ser recuperado sob dissecando estereoscópio. Este método recupera 20 - 80 pequenas e ilhotas de grande porte por pâncreas de rato recém-nascido. Estas ilhotas são adequadas para ensaios a jusante mais possíveis, incluindo a secreção de insulina, a expressão do gene, e a cultura. Um exemplo do ensaio de secreção de insulina é apresentado para validar o processo de isolamento. O fundo genético e grau de digestão são os maiores fatores determinantes do rendimento. solução de colagenase recentemente feito com alta atividade é preferível, uma vez que auxilia no isolamento endócrino-exócrina. A presença de catiões [cálcio (Ca2 +) e magnésio (Mg2 +)] em todas as soluções e soro fetal de bovino na lavagem / meios de recolha são necessárias para um bom rendimento de ilhotas com integridade adequada. Um escopo de dissecação com bom contraste e ampliação também vai ajudar.

Em condições óptimas, o método apresentado pode rendimento de 20 - 80 de cada pequena ilhotas do pâncreas do rato. Este número depende do fundo genético, idade de ratinhos, e o tamanho das ilhotas para ser recuperado. Entre os comumente usados, CD1 fora de raça C57BL / 6J de raça pura produzem menos ilhotas com tamanho menor do que híbridos entre CD1 e C57BL / 6 ou B6CBAF1 comercial / mice J fazer. Mão directa colheita geralmente deu um menor número de ilhotas, provavelmente devido à exc...

Nós descrevemos um protocolo aqui para isolar ilhotas intactas de ratos recém-nascidos. Pâncreas foi parcialmente digerido com colagenase, seguido por lavagem e colheita manual. 20 - 80 agrupamentos de ilhéus podem ser obtidos por pâncreas de ratinhos recém-nascidos, que são adequados para vários estudos da ilhota.

Isolamento eficaz de ilhotas funcionais a partir de ratinho neonato Pâncreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar ilhotas de Langerhans intactas do pâncreas de camundongos neonatos. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre desenvolvimento e função, tais como excreção de insulina, expressão gênica, sobrevivência paracelular e manutenção funcional.A principal vantagem deste método é que ele é simples e direto, ao mesmo tempo que permite que pesquisadores novatos isolarem um número substancial de ilhotas intactas para estudos posteriores. Comece borrifando um neonato na posição supina com etanol 70%. Em seguida, use pinças para levantar a pele sobre o abdômen e corte as camadas de pele e músculo longitudinalmente ao longo da linha média, desde os genitais até a caixa torácica.Em seguida, transfira todos os órgãos internos para uma placa de 100 centímetros e localize o pâncreas, que é um órgão branco e disperso, com a porção ventral aderida ao duodeno e a porção dorsal aderida ao estômago e ao baço. Adicione HBSS à placa para submergir os órgãos, de modo que os tecidos pancreáticos deixem de aderir ao duodeno, estômago ou baço. Em seguida, use um par de pinças para destacar o pâncreas dos tecidos circundantes.Transfira o pâncreas para um novo recipiente de 60 milímetros contendo HBSS e use tesoura para cortar um a cinco pâncreas em pedaços de cinco milímetros ou menores. Quando todo o tecido tiver sido picado, transfira os pedaços para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro e adicione solução de colagenase em trabalho às amostras. Em seguida, incube os fragmentos de tecido a 37 graus celsius, invertendo os tubos duas vezes a cada minuto.Após cinco minutos, toque levemente o tubo para monitorar o estado da digestão dos fragmentos. Continue a digestão por mais dez minutos, até que o lisado fique turvo e a maioria dos pâncreas apareça como agregados celulares fragmentados com menos de dois milímetros de diâmetro. Ao final da digestão, pelote o lisado por microcentrifugação e use uma pipeta p1000 para remover cuidadosamente o sobrenadante, que deve apresentar-se turvo, mas livre de agregados celulares.Em seguida, adicione um mililitro de meio RPMI 16/40 completo fresco ao pellet. Então, bata suavemente para ressuspender os fragmentos do lisado e inverta o tubo dez vezes. Após a centrifugação, inverta a suspensão do lisado por pelo menos mais duas vezes, conforme demonstrado anteriormente, até que o sobrenadante fique claro.Em seguida, ressuspenda o pellet final em um mililitro de meio completo fresco e adicione dois mililitros de polissacarídeo e diatrizoato de sódio com densidade de 1,077 g/ml a um tubo cônico de 15 mililitros sobre gelo. Usando uma pipeta de Pasteur, sobreponha cuidadosamente o lisado à solução de gradiente sem misturar as camadas e separe as células por centrifugação. Transfira o meio e as camadas interfaciais contendo os ilhotas para um novo tubo de 15 mililitros e misture suave, porém completamente, os ilhotas com dez mililitros de meio fresco para centrifugação.Após uma segunda lavagem e meio completo fresco, re-suspenda o pellet contendo ilhotas e ductos em quatro mililitros de meio completo fresco. Em seguida, semeie as ilhotas em uma placa de 60 milímetros e adicione cinco mililitros de meio completo às células. Transfira a placa para sob um microscópio estereoscópico e ligue a iluminação de campo claro, ajustando a intensidade da luz para aproximadamente 50% da potência máxima.Em uma ampliação de 50x, as ilhotas aparecerão como aglomerados levemente rosados e as células acinosas como aglomerados escuros com formato irregular. Utilizando uma ponteira de pipeta p20, colete as ilhotas individuais, tomando cuidado para evitar os aglomerados acinosos, e dispense as frações enriquecidas em ilhotas em um novo recipiente de 60 milímetros contendo meio completo. Quando todas as ilhotas tiverem sido coletadas do recipiente original, transfira as ilhotas do recipiente de coleta para um novo recipiente de 60 milímetros contendo quatro mililitros de meio completo fresco, repetindo esse procedimento mais duas vezes, até que apenas ilhotas puras estejam presentes no recipiente final de coleta.Uma digestão e isolamento adequados produzirão ilhotas com superfícies externas lisas. A digestão insuficiente com colagenase pode resultar em ilhotas grandes, facilmente visualizadas, que não podem ser completamente separadas dos tecidos acinares, reduzindo o rendimento total de ilhotas, mesmo que sejam produzidas ilhotas maiores. No caso de superdigestão, embora os tecidos acinares possam ser completamente separados das ilhotas, a estrutura das ilhotas tende a ficar comprometida, resultando em ilhotas com superfície irregular observadas ao microscópio.Islotes neonatais isolados por este método exibem altos níveis basais de secreção de insulina com perfis de secreção de insulina estimulada por glicose típicos de células beta de islotes imaturos, sugerindo que este procedimento de isolamento de islotes conserva amplamente as propriedades funcionais dos islotes neonatais. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em apenas duas horas, se realizada corretamente. Ao tentar o procedimento, é importante lembrar de pré-centrifugar a colagenase para remover qualquer resíduo insolúvel e de adicionar cálcio e magnésio ao tampão de lavagem e de usar o tampão de lavagem pré-tratado para interromper rapidamente a dissociação do tecido.Pois, com este procedimento, nosso experimento, como a secreção de insulina estimulada por glicose, pode ser realizado para responder perguntas adicionais, como a dinâmica da secreção de insulina em células beta neonatais. Além disso, esta técnica abre caminho para pesquisadores na área da biologia das células beta realizarem ensaios adicionais, como estudos de expressão gênica ou outras análises metabólicas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar ilhotas intactas do pâncreas de camundongos neonatos para seus estudos posteriores.Não se esqueça de que trabalhar com o pó de colagenase será extremamente perigoso, portanto, precauções como o uso de luvas e máscara facial devem ser sempre tomadas ao manipular este material.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Transplante de ilhotas isoladas foi proposto para ser um potencial tratamento para diabetes tipo 1. Aqui nós descrevemos um método para isolar ilhotas de rato pancreata e transplantá-las para o espaço subcapsular do rim.

Um método para isolamento de ilhotas murino e transplante renal subcapsular

O fornecimento de diabéticos tipo 2 ilhotas para pesquisa é insuficiente. Aqui nós compartilhamos nosso protocolo para isolar ilhotas de pacientes submetidos à pancreatectomia parcial. Esta abordagem representa um local único para a obtenção de ilhotas de diabéticos tipo 2 e clinicamente combinado não-diabéticos em número adequado para estudos básicos e clínicos.

Isolamento de Ilhotas Humanos de pacientes parcialmente pancreatectomizado

Uma descrição detalhada de isolamento de ilhotas do rato está descrito por meio da técnica de canulação na pancreático ductal in situ e a perfusão de uma combinação de colagenase purificados e protease neutra.

Rato Ilhéu de Langerhans isolamento usando uma combinação de colagenase purificada e Protease Neutra

As ilhotas pancreáticas, também chamadas de ilhotas de Langerhans, são um aglomerado de células endócrinas que produzem hormônios para a regulação da glicose e outras funções biológicas importantes. Este protocolo explica um método para isolar ilhotas pancreáticas pela primeira vez perfundindo colagenase via ampola de Vater para digerir o tecido pancreático exócrino e uma centrifugação simplificada com gradiente de densidade para purificar as ilhotas de camundongos.

Isolamento de ilhotas pancreáticas por meio de perfusão de colagenase: um método enzimático para isolar células de ilhotas pancreáticas

Ensaiando in vitro a função das células β usando o mouse ilhotas isoladas de Langerhans é um componente importante no estudo da fisiopatologia do diabetes e terapêutica. Embora muitas aplicações a jusante estão disponíveis, este protocolo descreve especificamente a medida da intracelular monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) como um parâmetro essencial para definir a função das células β.

Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

Apresentamos aqui um protocolo para o isolamento de ilhotas do modelo de camundongo com diabetes tipo 2, Leprdb e detalhes de um ensaio de células vivas para medição da secreção de insulina de ilhotas intactas que utiliza microscopia de 2 fótons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

Este protocolo demonstra isolamento de manchas murinas e semeadura em um andaime decelularizado. As ilhotas suportadas em andaimes foram transplantadas para a almofada de gordura epididimática de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ). As ilhotas sobreviveram no local do transplante e revertearam a condição hiperglicêmica.

Transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos

Este protocolo da isolação da ilhotas descreveu uma rota nova da injeção do colagenase para digerir o tecido exócrina e um procedimento simplificado do inclinação para purificar os ilhotas dos ratos. Envolve a digestão enzimática, separação de gradiente/purificação, e Islet mão-picking. O isolamento bem-sucedido pode produzir 250 – 350 de alta qualidade e ilhotas totalmente funcionais por mouse.

Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Transplante de ilhotas pancreáticas é uma maneira de conseguir normoglycemia no diabetes tipo 1. Este artigo centra-se na técnica de transplante através da rota intraportal para manter os níveis normais de glicose em ratos diabéticos.

Intraportal transplante de ilhotas pancreáticas no modelo de Mouse

Este estudo desenvolveu um método simplificado para extrair eficientemente ilhéus primários funcionais e células acinares do pâncreas do camundongo, oferecendo uma ferramenta valiosa para estudar a comunicação intercelular na patogênese do Diabetes Induzido por Pancreatite Aguda.

Um método simples e rápido para isolamento simultâneo de ilhotas primárias e células acinares pancreáticas primárias de camundongos

Este protocolo descreve um método padronizado para colheita cirúrgica, digestão enzimática e purificação por gradiente de densidade de ilhéus pancreáticos de rato Lewis, permitindo preparações de alto rendimento e alta pureza para uso direto em transplantes ou estudos in vitro .

Isolamento e purificação de ilhotas pancreáticas a partir de ratos Lewis usando digestão enzimática e separação por gradiente de densidade

Aprenda a isolar ilhotas intactas de pâncreas de ratinhos neonatos usando colagenase e centrifugação por gradiente. Este método simples permite obter 20 a 80 ilhotas por pâncreas para estudos de secreção de insulina e expressão gênica.

Isolamento eficaz de ilhotas funcionais a partir de ratinho neonato Pâncreas

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