Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente
24 de janeiro de 2017
As mitocôndrias pode utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (Δ Ψm) para sequestrar cálcio (Ca2 +), o que lhes permite moldar citosólica de Ca 2+ de sinalização dentro da célula. Descreve-se um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca 2+ de fixação e ΔΨ m em células vivas utilizando corantes fluorescentes e microscopia confocal.
O objetivo geral deste procedimento é fornecer um método simples para medir simultaneamente a captação de cálcio mitocondrial e o potencial de membrana mitocondrial em células vivas usando microscopia confocal. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo mitocondrial, como como as mitocôndrias atuam como depósitos locais de cálcio para regular rigidamente a concentração de cálcio intracelular. A principal vantagem desta técnica é que tanto o cálcio mitocondrial quanto o potencial da membrana mitocondrial podem ser medidos especificamente simultaneamente em células vivas sem a necessidade de manipulação genética.
Embora este método possa fornecer informações sobre a regulação do cálcio na patologia da doença mitocondrial, ele também pode ser usado para estudar outras condições degenerativas mais recentes, quando a regulação do cálcio urinário é crucial. Neste procedimento, cultive as células em placas de cultura de células de dez centímetros, ou frascos de 75 centímetros quadrados, em meios de cultura a 37 graus Celsius por 24 horas. Para colher as células, remova o meio por aspiração e lave as células com cinco mililitros de PBS.
Depois, remova o PBS por aspiração. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de tripsina EDTA e incube as células a 37 graus Celsius por 2 minutos. Em seguida, bata suavemente no prato para remover as células.
Ressuspenda-os em cinco mililitros de meios de cultura. Depois, conte as células com um hemocitômetro. No dia anterior à imagem confocal, coloque as células em 60 a 70 por cento de confluência em pratos ou lamínulas com câmara.
Em seguida, incube as células durante a noite a 37 graus Celsius para permitir que as células se fixem e se recuperem. Neste procedimento, prepare a solução de coloração de registro com TMRM, Fluo 4 AM e surfactante. Remova os meios de cultura e lave as células com 100 microlitros de PBS.
Em seguida, remova o PBS e incube as células em 100 microlitros de solução de coloração por 45 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova a solução de coloração de registro e lave as células em 100 microlitros de HBSS sem cálcio para remover o excesso de Fluo 4 AM e TMRM. Em seguida, prepare a solução de imagem intracelular com digitonina, TMRM e thapsigargin.
Em seguida, remova o HPSS sem cálcio e adicione 300 microlitros de solução de imagem IM às células. Deixe as células se equilibrarem à temperatura ambiente por dez minutos antes de obter imagens com as adições de cloreto de cálcio. Use uma baixa potência de laser de aproximadamente 5% para minimizar qualquer dano fotográfico às células.
Use a configuração nos lasers do microscópio para os espectros de excitação e emissão de TMRM e Fluo 4 AM. Use uma baixa potência de laser de aproximadamente cinco por cento com alto ganho para minimizar os danos fotográficos das células. Em seguida, configure o microscópio para escanear imagens a cada vinte e cinco segundos. Examine as células por dez minutos para estabelecer as leituras da linha de base para sinais TMRM e Fluo 4.
Em seguida, pause a varredura da imagem e adicione 3 microlitros de solução estoque de cloreto de cálcio 40 milimolares diretamente às células em 300 microlitros de solução de imagem IM. Misture delicadamente com uma pipeta. Ao adicionar solução de cálcio às células, tome cuidado para não mover o prato no microscópio stage.
Continue a digitalização de imagens por aproximadamente quatro minutos. Em seguida, repita as adições de cloreto de cálcio a cada quatro minutos até que os sinais TMRM ou Fluo 4 desejados sejam alcançados, geralmente em torno de oito a dez adições. Em seguida, adicione uma diluição de 1 a 100 de um FCCP milimolar diretamente às células para dissipar o potencial da membrana interna.
Em seguida, imagine as células por mais cinco minutos antes que o experimento seja concluído. Quando a imagem estiver concluída, determine a intensidade dos sinais Fluo 4 e TMRM usando o software de análise de imagem. Para isso, abra a imagem, clique na ferramenta de seleção e selecione uma região de interesse que contenha mitocôndrias.
Várias regiões de interesse podem ser selecionadas para medição abrindo Analisar, Ferramentas, Gerenciador de ROI. Clique em Adicionar para incluir o ROI selecionado para medição de intensidade. Repita as etapas anteriores até que todas as ROIs tenham sido adicionadas ao gerenciador de ROI.
Meça a intensidade fluorescente média dos sinais TMRM e Fluo 4 para cada região de interesse, selecionando a função de mais medidas múltiplas. Certifique-se de que a opção Medir todas as fatias esteja selecionada e que a opção Uma linha por fatia esteja desmarcada. Em seguida, clique em OK para obter uma tabela de intensidade fluorescente média dos sinais TMRM e Fluo 4 para cada ROI em cada ponto de tempo.
Em seguida, combine os dados para calcular a intensidade média e o desvio padrão para os sinais TMRM e Fluo 4. Neste experimento, as células 143B foram pré-carregadas com Fluo 4 AM e TMRM antes da permeabilização com digitonina. Após cada adição de cloreto de cálcio, o sinal TMRM diminui à medida que o influxo de íons de cálcio nas mitocôndrias dissipa o potencial da membrana mitocondrial.
Um pequeno potencial de membrana é evidente após a transição de permeabilidade, pois a adição de 10 FCCP micromolares ainda induz um colapso do potencial de membrana. Aqui, a concentração de cálcio mitocondrial, indicada pelo sinal Fluo 4, começa a aumentar após a segunda adição de cloreto de cálcio, quando o cálcio livre no meio atinge 0,32 micromolar. Cada adição subsequente de cloreto de cálcio causou um aumento progressivo no cálcio mitocondrial.
Aqui estão as imagens de medições simultâneas do potencial de membrana no cálcio mitocondrial. O sinal vermelho indica TMRM e o sinal verde indica Fluo 4. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente duas horas, se executada corretamente.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir os níveis de cálcio mitocondrial e o potencial da membrana mitocondrial simultaneamente na microscopia confocal usando a adição de cálcio exógeno às células permeabilizadas. Não se esqueça de que trabalhar com FCCP e digitonina pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de EPI devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para medir a captação de cálcio mitocondrial e o potencial de membrana em células vivas utilizando microscopia confocal. A técnica permite aos pesquisadores investigar como as mitocôndrias regulam as concentrações intracelulares de cálcio sem manipulação genética.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa Mitochondrial
Antecedentes
- As mitocôndrias desempenham um papel crucial na sinalização de cálcio.
- Compreender a função mitocondrial é importante para o estudo de diversas doenças.
- A regulação do cálcio é vital para a saúde celular.
- Os métodos atuais frequentemente exigem manipulação genética, limitando sua aplicabilidade.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método simples para medir funções mitocondriais.
- Investigar o papel das mitocôndrias como reservatórios locais de cálcio.
- Facilitar a pesquisa sobre doenças mitocondriais e outras condições degenerativas.
Métodos Utilizados
- As células são cultivadas em meios apropriados a 37 graus Celsius.
- As células são coletadas e lavadas com PBS.
- Corantes fluorescentes são usados para medir a captação de cálcio e o potencial de membrana.
- A microscopia confocal é empregada para medições simultâneas.
Resultados Principais
- O método permite o monitoramento em tempo real da dinâmica de cálcio mitocondrial.
- É alcançada a medição simultânea de cálcio e potencial de membrana.
- A técnica pode revelar informações sobre a patologia de doenças mitocondriais.
- Pode ser aplicada para estudar outras condições relacionadas à regulação de cálcio.
Conclusões
- Este método aprimora a compreensão das funções mitocondriais em células vivas.
- Oferece uma ferramenta para investigar o papel das mitocôndrias na saúde e na doença.
- A abordagem é versátil para diversas aplicações de pesquisa em biologia celular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a medição direta da dinâmica do cálcio mitocondrial e do potencial de membrana em células vivas, fornecendo dados essenciais para a validação de alvos em vias de disfunção mitocondrial. Ao quantificar a transição de permeabilidade induzida por cálcio e a perda do potencial de membrana, ele auxilia na redução de riscos mecanicistas de hipóteses terapêuticas relacionadas à falha bioenergética. A leitura simultânea aumenta a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, vinculando o fluxo de cálcio à saúde mitocondrial sem manipulação genética.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas sobre o manuseio de cálcio mitocondrial como regulador da homeostase de cálcio celular.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos mitocondriais em células vivas utilizando leituras fluorescentes.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar compostos que modulam a transição de permeabilidade induzida por cálcio.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Prontidão do Ensaio: Prepara células permeabilizadas com Fluo-4 AM e TMRM para detecção quantitativa e simultânea da captação de cálcio e potencial de membrana.
- Reprodutibilidade: Utiliza adições sequenciais de cloreto de cálcio para gerar curvas dose-resposta na determinação do limiar de permeabilidade transitória.
- Escalabilidade: Compatível com plataformas de microscopia confocal para adaptação em múltiplas poças e análise de intensidade baseada em regiões de interesse (ROI).
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela a sobrecarga mitocondrial de cálcio relevante para neurodegeneração e lesão isquêmica.
- Continuidade Tradutiva: Relaciona medições agudas de fluxo de cálcio com disfunção crônica em modelos pré-clínicos de doenças mitocondriais.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões de avançar/não avançar com base na capacidade de retenção de cálcio e na estabilidade do potencial de membrana.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta que vai do engajamento do alvo à validação funcional, especialmente para vias envolvendo regulação de cálcio mitocondrial e estresse oxidativo.
- Biologia da Descoberta: Testa como perturbações afetam o tampão de cálcio mitocondrial e o acoplamento do potencial da membrana.
- Telamento: Fornece leituras fluorescentes quantitativas que permitem a comparação dos efeitos de compostos sobre a despolarização induzida por cálcio.
- Análises: Fornece dados de intensidade média e desvio padrão dos sinais de Fluo-4 e TMRM ao longo de pontos temporais e regiões de interesse (ROIs).
- Pesquisa Translacional: Relaciona eventos agudos de transição de permeabilidade a falhas bioenergéticas sustentadas em modelos de doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de ensaio reutilizável para farmacologia de segurança mitocondrial e redução de riscos de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao correlacionar diretamente o influxo de cálcio com a dissipação do potencial de membrana.
- Valor Operacional: Padroniza a medição por meio do pareamento de corantes ratiométricos e desafio sequencial ao cálcio.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência de capital ao identificar precocemente falhas mitocondriais na fase de otimização de compostos promissores.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco com base na capacidade de retenção de cálcio e na suscetibilidade à transição de permeabilidade.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em imagem de células vivas, carregamento de corantes e protocolos de permeabilização.
- Depende da microscopia confocal com configurações de laser apropriadas para excitação/emissão de TMRM e Fluo-4.
- Necessita padronização na preparação de HBSS sem cálcio e de solução intracelular para imagem entre as equipes.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes tipos celulares e densidades mitocondriais.
- Inclui limitações práticas, como o risco de fototoxicidade devido à exposição ao laser e vazamento de corante após a permeabilização.
