Name: Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda a medir cálcio mitocondrial e potencial de membrana simultaneamente em células vivas usando microscopia confocal. Este método sem manipulação genética auxilia pesquisadores a estudar doenças mitocondriais.

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Agradecemos Dr Kirstin Elgass e Dr Sarah Creed de Monash Micro Imaging para assistência técnica, eo Wellcome Trust and Medical Research Council do Reino Unido para apoio financeiro. MMcK é suportado do futuro regime Australian Research Council Fellowship (FT120100459), o Buckland Fundação William, O mitocondrial Disease Foundation australiano (AMDF), O Instituto Hudson de Pesquisa Médica e da Universidade de Monash. Este trabalho foi apoiado pelo regime de apoio infra-estrutura operacional Governo de Victoria.

1. Preparação de células <ol><li> Cultivar células em placas de cultura celular de 10 cm ou 75 cm 2 frascos em meio de cultura [10 ml de Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 5% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS) e 1x penicilina / estreptomicina (P / S )] a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Para colher as células, meios remover por aspiração, em seguida, lava-se com 5 ml de 1x tampão de fosfatos salino (PBS 1x). Remover PBS 1x por aspiração, em seguida, adicionar 1,5 ml de 0,25% (w / v) de tripsina / 0,25% (w / v) de ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) e incubar a 37 ° C / 5% de CO 2 durante 2 min. Toque prato ou frasco suavemente para remover as células, em seguida, ressuspender em 5 ml de meio de cultura. </li><li> Contar as células por adição de 12 ul de células ressuspensas em um hemocitómetro. </li><li> células da placa em pratos ou lamelas de câmaras de imagem confocal. NOTA: Estes terão um fundo de plástico ou de vidro adequado que tenha sido desenvolvido para utilização com microscópios invertidos. </li><li> células da placa de modo them ~ 80% de confluência é alcançada no dia da imagiologia. Por exemplo, cerca de 2 x 10 células de osteossarcoma 4 143B pode ser plaqueadas em um poço de uma corrediça de 8 poços um dia antes da câmara de imagiologia. </li><li> Incubar as células durante a noite a 37 ° C / 5% de CO2 para permitir que as células fixar e recuperar. </li></ol> 2. Tampões para TMRM e Fluo-4 Imagem <ol><li> Prepare ficha Solução (RS) contendo NaCl 156 mM, KCl a 3 mM, MgSO 4 2 mM, 1,25 mM de KH 2 PO 4, 10 mM de D-glucose, CaCl2 e 10 mM de HEPES 2 mM pH 7,35. Armazene RS em alíquotas a -20 ºC. </li><li> Prepare intracelular médio (IM) contendo NaCl 6 mM, KCl 130 mM, MgCl 7,8 mM, 2, mM de KH 2 PO 4, mM CaCl 0,4 2, EGTA 2 mM, HEDTA 10 mM, malato 2 mM, glutamato 1 mM 2, 2 mM ADP e 20 mM de HEPES pH 7,1. 200 mM de soluções de reserva de malato, o glutamato e o ADP pode ser preparado separadamente, aliquotados, e armazenados a -20 ° C. estes stocks podem ser adicionados ao IM imediatamente antes da utilização. </li><li> Ca 2+ solução salina tamponada de Hank livre de (HBSS) pode ser obtida pré-preparados a partir de fornecedores comerciais. Adicionar ácido etilenoglicol-bis (éter β-aminoetil) -N, N, N &#39;, N&#39; -tetra-acético (EGTA) para uma concentração final de 500 uM. </li><li> Prepara-se uma solução estoque de 10 mM de tetrametilrodamina, éster metílico, perclorato (TMRM) em metanol a 100%. Deste estoque, fazer um estoque de trabalho de 2 M em H2O destilada </li><li> Prepara-se uma solução estoque de 10 mM de Verapamil em 100% de etanol. </li><li> Prepare 1 mg / ml (p / v) solução stock de Fluo-4 éster de acetoximetilo (Fluo-4, AM) em sulfóxido de dimetilo (DMSO). NOTA: Fluo-4, AM é um indicador de cálcio que exibe aumento da fluorescência mediante Ca 2+ vinculativo. Fluo-4 é um análogo de fluo-3, com os dois substituintes de cloro substituídos por átomos de flúor. Isto resulta num aumento da excitação de fluorescência a 488 nm e os níveis de sinal de fluorescência mais elevados. ogrupo éster AM resulta numa Fluo-4 molécula não carregada que pode permear as membranas celulares. Uma vez dentro da célula, o éster de AM é clivada por esterases inespecíficas, resultando numa forma carregada de Fluo-4, que está preso no interior da célula. </li><li> Prepara-se uma solução de reserva de 1 mM de p-carbonil cianeto Trifluormetoxifenilidrazona (FCCP) em etanol a 100%. </li><li> Prepara-se uma solução estoque de 25 mg / ml (w / v) de digitonina em H2O destilada </li><li> Prepara-se uma solução stock de 100 uM em DMSO tapsigargina. </li><li> Prepara-se uma solução estoque de 40 mM de cloreto de cálcio (CaCl2) em H2O destilada </li></ol> 3. A coloração de células com TMRM e Fluo-4, AM <ol><li> Preparar a solução de coloração RS com 20 nM de TMRM, 5 ug / ml (w / v) de Fluo-4, AM e 0,005% de tensioactivo, tal como Pluronic F-127 em RS. NOTA: Este agente tensioactivo não iónico é um poliol que facilita a solubilização de Fluo-4, AM. Nota: 10 uM verapamil também pode ser adicionado à inhibit TMRM exportação pelo transportador multidroga membrana plasmática se for expresso no tipo celular a ser analisado. </li><li> Remover o meio de cultura de células com uma pipeta e lava-se com 100 ul de PBS 1x. </li><li> Remover PBS 1x com uma pipeta e incubar as células na solução de coloração RS 250 uL durante 45 min à temperatura ambiente. Observação: Uma vez que o Fluo-4, AM entra na célula, o éster de AM é clivada por esterases celulares. A incubação à temperatura ambiente inibe a actividade de esterase, permitindo Fluo-4, AM para introduzir as mitocôndrias. </li><li> Remova a solução RS coloração com uma pipeta e lavar as células em 100 ul de Ca2 + livre HBSS para remover o excesso de Fluo-4, AM e TMRM. </li><li> Prepare solução de imagem primário com 25 ug / ml digitonina (v / w), 200 nM TMRM e 1 PM thapsigargin no IM. NOTA: A concentração de digitonina pode necessitar de ser ajustada para assegurar que a permeabilização da membrana interna mitocondrial não ocorre. Isto pode ser determinado empiricamente através da avaliação da intensidadedo sinal de TMRM em diferentes concentrações de digitonina. </li><li> Remover o Ca2 + livre HBSS por pipeta e adicionar 300 ul de solução de imagem IM para as células. Deixar células para equilibrar à temperatura ambiente durante 10 min. As células são agora pronto para geração de imagens com CaCl 2 adições. </li></ol> Imagem 4. celular <ol><li> Coloque prato ou lamela câmaras com células em solução de imagem IM em um microscópio confocal de varredura a laser invertido. </li><li> Use a configuração sobre os lasers de microscópio para a excitação e emissão espectros de TMRM e Fluo-4. Por exemplo, use 543 nm He-Ne e 473 nm linhas de laser de argônio para excitar TMRM e Fluo-4, respectivamente. Utilizar uma fonte de laser de baixa de cerca de 5% a minimizar qualquer foto-dano para as células. </li><li> Definir microscópio para digitalizar imagens a cada 25 seg. células de digitalização durante 10 min para estabelecer as leituras da linha de base para o TMRM e Fluo-4 sinais. NOTA: O sinal de Fluo-4 pode ser fraco ou indetectável no descanso concent cálciorações. </li><li> Adicione 3 mL de solução de estoque 40 mM de CaCl2 directamente para as células em 300 ul de solução de imagem IM (uma diluição 1: 100) e misturar cuidadosamente com uma pipeta. Pausar a digitalização de imagem, enquanto a adição e mistura do CaCl 2, se necessário. NOTA: O Ca2 + livre concentração de íons final [Ca 2+] na solução de imagem IM pode ser calculada usando softwares como o Maxchelator WEBMAXC prolongado ( <a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a> ) ou quelante 11. Uma descrição detalhada de como calcular o Ca 2+ concentração final íon livre [Ca 2+] é descrito no ponto 6 abaixo. </li><li> Continuar a digitalização de imagens para aproximadamente 4 min, em seguida, repita CaCl 2 adições a cada 4 min até o TMRM desejado ou Fluo-4 sinais são alcançados, geralmente em torno de 8 a 10 adições. </li><li> Usando uma pipeta, adicionar uma diluição 1: 100 de FCCP 1 mM (final Concentration de 10 uM) directamente para as células para dissipar ΔΨ m. células de imagem por mais 5 min. O experimento foi concluída. </li></ol> Análise 5. Imagem <ol><li> Depois de imagem estiver concluído, determinar a intensidade dos sinais de Fluo-4 e TMRM usando o software de análise de imagem, por exemplo software ImageJ com o plugin Bio-Formatos (download &#39;bioformats_package.jar&#39; do http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / e guardá-lo no &quot;C: Program Files ImageJ plugins &#39;pasta). </li><li> Abra o arquivo de imagem (por exemplo, um arquivo de .oif) em ImageJ. Clique na ferramenta de seleção e selecione uma região de interesse (ROI) que contém mitocôndrias. Use o sinal TMRM inicial para selecionar o ROI. </li><li> Abrir &quot;Analisar&gt; Ferramentas&gt; ROI Manager &#39;, clique em&#39; Adicionar &#39;para incluir o ROI selecionados para medição da intensidade. Várias ROIs pode ser seleccionado de uma única imagem para medição. etapas anteriores Repita até que todos ROIs foram adicionados ao Gestor de ROI. </li><li> Clique em &quot;Mais&gt; Medida multi &#39;, certifique-se de que&quot; Medir todas as fatias&#39; é selecionado e que &quot;uma linha por Slice &#39;não está selecionada, clique em&#39; OK &#39;para obter uma tabela de intensidade de fluorescência média das TMRM e fluo-4 sinais para cada ROI em cada ponto de tempo. </li><li> Use dados de todos os ROIs para calcular as intensidades média e desvio padrão para o TMRM e Fluo-4 sinais. </li></ol> 6. Cálculo do final gratuito Ca2 + Ion Concentração [Ca 2+] <ol><li> A concentração de Ca2 + íon livre [Ca 2+] na solução de imagem IM pode ser determinada usando softwares como o Maxchelator WEBMAXC prolongado ( <a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a> ) ou quelante 11. Por exemplo, definir as variáveis ​​em WEBMAXC prolongada da seguinte maneira: Temperatura = 24 ° C, pH = 7.1, força iónica = 0,162, EGTA = 0,002 M, HEDTA = 0,01 M, Ca2 + H = 0,0004 e = 0,0078 Mg 2+ M. Isto resulta num livre de Ca 2+ concentração final de iões de [Ca 2+] de 62 nM . Note-se que estes programas não podem ter em conta todas as variáveis, tais como a pureza de reagente, a precisão das medições e determinação do pH. O método mais preciso para a determinação da concentração de Ca2 + livre é a utilização de um eléctrodo de Ca 2+ calibrado selectiva. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O cálcio desempenha um papel fundamental em muitos processos celulares, incluindo a contracção do músculo, sinalização neuronal e a proliferação celular 13. Aumentos nas concentrações de cálcio celular são frequentemente associados com a demanda de energia, com o cálcio capaz de estimular diretamente a fosforilação oxidativa mitocondrial para aumentar a geração de ATP 3. Portanto, é essencial que nós temos a capacidade de controlar eficazmente o acúmulo de cálcio mitocondr...

As mitocôndrias desempenham um papel importante na regulação da concentração intracelular de Ca2 +, agindo como locais de Ca2 + tampões 1. Ca 2+ entra as mitocôndrias através da uniporter Ca2 +, um processo conduzido por o gradiente electroquímico que existe através da membrana mitocondrial interna (ΔΨ m) 2. Uma vez dentro da matriz mitocondrial, Ca2 + pode activar a fosforilação oxidativa, estimulando três desidrogenases limitantes da velocidade do ciclo de ácido cítrico 3. Esta estimulação mantém ΔΨ m, que é temporariamente dissipada como os iões de cálcio positivos atravessar a membrana mitocondrial interna na matriz mitocondrial. Se a concentração de Ca 2+ no interior da mitocôndria se torna muito alta, a transição de permeabilidade mitocondrial pode ser iniciado, resultando na dissipação de ΔΨ m, o cessatioN da fosforilação oxidativa e a indução de morte celular percursos de sinalização 4. O importante papel que as mitocôndrias jogar no tamponamento espacial de cálcio celular faz com que o monitoramento preciso do cálcio mitocondrial crítica. Vários métodos têm sido estabelecido para controlar ccio mitocondrial, incluindo a utilização de corantes à base de rodamina. Um tal tintura, Rhod-2, AM, é bastante eficaz no particionamento para a mitocôndria para medir mitocondriais níveis de Ca 2+ 5, 6. No entanto, o cuidado deve ser usado como algum corante irá acumular em outras organelas, tais como lipossomas, ou permanecer no citoplasma celular. No entanto, análises a jusante pode ser utilizado para distinguir estes sinais dos da mitocôndria 7. Uma outra técnica para monitorar cálcio mitocondrial utiliza repórter fluorescente constrói 8 </s<html> -se&gt;. O benefício destas sondas geneticamente codificados é que eles podem ser especificamente dirigidas para a mitocôndria utilizando péptidos endógenos N-terminais, por exemplo o sinal de direccionamento do terminal N da subunidade de COX VIII humano. Este sistema tem sido empregado para gerar uma sonda aequorina alvejado-mitocondrial, que revelou-se extremamente útil para a investigação de cálcio mitocondrial sinalização 9. A principal desvantagem destas sondas geneticamente codificados é que eles têm de ser introduzidos nas células por expressão transitória (que não é viável para certos tipos de células e pode produzir resultados variáveis) ou através da criação de sistemas de expressão estáveis ​​(que é demorado). Para contornar os problemas acima referidos, temos desenvolvido um novo protocolo para medir mitocondrial Ca 2+ e ΔΨ m simultaneamente. Este protocolo baseia-se num método anteriormente descrito que adiciona cálcio exógeno para as células permeabilizadass = &quot;xref&quot;&gt; 10. Nosso protocolo tem três vantagens principais em relação a outros métodos: em primeiro lugar, usamos Fluo-4, AM e TMRM para monitorar Ca 2+ e mitocondrial ΔΨ m, dois corantes que têm propriedades espectrais muito distintas; Em segundo lugar, as células são permeabilizadas de modo a que o sinal de Fluo-4 apenas está detectando mitocondrial de Ca2 + e de Ca2 + não localizada para outros organelos ou o citosol da célula; e em terceiro lugar, a utilização de Fluo-4 para detectar Ca 2+ mitocondrial permite a coloração de células rápido e simples, eliminando qualquer problema de transfecção de células ou de transformação que existem se utilizando sondas geneticamente codificados.

<table><tbody><tr><td>Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>soro fetal bovino (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>1x solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100x penicilina/estreptomicina (p/s)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina/0,25% EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>8-well chambered coverslip</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>malato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ livre Hank' s solução salina tamponada (HBSS)&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>tetrametilrodamina, éster metílico, perclorato (TMRM)</td><td>ThermoFisher</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 éster acetoximetílico (Fluo-4, AM)</td><td>ThermoFisher</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>cianeto de carbonila p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>P3000MP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>hemacitômetro</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células de 10 cm</td><td>Frascos de</td> cultura <td>COR430167 de</td><td></td></tr><tr><td>células de 75 cm2</td><td>Corning</td><td>COR430641</td><td></td></tr></tbody></table>

medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por microscopia fluorescente

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Para além do seu papel fundamental na geração de ATP, mitocôndrias também actuar como cálcio local (Ca 2+), tampões para regular firmemente concentração intracelular de Ca2 +. Para fazer isso, as mitocôndrias utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (ΔΨ m) para sequestrar Ca 2+. O influxo de Ca2 + para as mitocôndrias estimula três desidrogenases limitantes da velocidade do ciclo do ácido cítrico, aumentando a transferência de electrões através da fosforilação oxidativa (FOX) complexos. Esta estimulação mantém ΔΨ m, que é temporariamente dissipada como os iões de cálcio positivos atravessar a membrana mitocondrial interna na matriz mitocondrial. Descrevemos aqui um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca 2+ captação e ΔΨ m em células vivas usando microscopia confocal. Por permeabilização das células, o Ca 2+ mitocondrial podeser medida utilizando o indicador fluorescente de Ca 2+ Fluo-4, AM, com medição de ΔΨ m utilizando o corante fluorescente de tetrametilrodamina, éster metílico, perclorato (TMRM). A vantagem deste sistema é que existe muito pouca sobreposição espectral entre os corantes fluorescentes, permitindo uma medição precisa de Ca 2+ e mitocondrial ΔΨ m simultaneamente. Utilizando a adição sequencial de alíquotas de Ca 2+, Ca 2+ mitocondrial captação pode ser monitorizada, e a concentração na qual Ca 2+ induz a transição da permeabilidade da membrana mitocondrial e a perda de ΔΨ m determinada.

Nós temos usado este protocolo para examinar os efeitos de uma mutação MT-ND5 sobre a capacidade das mitocôndrias de células 143B para o buffer aumenta em cálcio 12. No exemplo mostrado aqui, células 143B de controlo foram carregadas com Fluo-TMRM e 4, antes de SOU permeabilização com digitonina. Após 5 min de imagiologia, oito adições sequenciais de uma diluição 1: 100 de 40 mM de CaCl2 exógenos foram feitos, com o Ca 2+ concentraçã...

As mitocôndrias pode utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (Δ Ψm) para sequestrar cálcio (Ca2 +), o que lhes permite moldar citosólica de Ca 2+ de sinalização dentro da célula. Descreve-se um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca 2+ de fixação e ΔΨ m em células vivas utilizando corantes fluorescentes e microscopia confocal.

Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um método simples para medir simultaneamente a captação de cálcio mitocondrial e o potencial da membrana mitocondrial em células vivas, utilizando microscopia confocal. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área mitocondrial, como a forma pela qual as mitocôndrias atuam como reservatórios locais de cálcio para regular rigorosamente a concentração intracelular de cálcio. A principal vantagem desta técnica é que tanto o cálcio mitocondrial quanto o potencial da membrana mitocondrial podem ser medidos especificamente e simultaneamente em células vivas, sem a necessidade de manipulação genética.Embora este método possa fornecer informações sobre a regulação do cálcio na patologia de doenças mitocondriais, ele também pode ser utilizado para estudar outras condições degenerativas mais recentes, quando a regulação urinária de cálcio é crucial. Neste procedimento, cultive as células em placas de cultura celular de dez centímetros ou em frascos de 75 centímetros quadrados, em meio de cultura a 37 graus Celsius por 24 horas. Para colher as células, remova o meio por aspiração e lave as células com cinco mililitros de PBS.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve um método para medição em tempo real dos fluxos de cálcio mitocondrial por imagem fluorescente. O método se aproveita de uma circular permutated sensor de cálcio YFP baseado excitação dupla raciométrica (raciométrica pericam-mt) seletivamente expressos na mitocôndria.

Mudanças Dinâmicas de monitoramento dos níveis de cálcio mitocondrial durante a apoptose através de um sensor de cálcio geneticamente codificado

Nós apresentamos um método para isolar rápido eventos (microssegundo) cálcio dos fluxos mais lento em células vivas usando laser microscopia confocal. O método mede as flutuações de intensidade de fluorescência de indicadores de cálcio através dos exames de gravação de linha de várias centenas de pixels em uma célula. Análise de histograma nos permite isolar as escalas de tempo de fluxos de cálcio diferentes.

Fluxos de medição de cálcio rápido no Cardiomyocytes

Fusão mitocondrial foi medida seguindo o equilíbrio da GFP matriz segmentada photoconverted através da rede mitocondrial ao longo do tempo. Até agora, apenas uma célula possa ser sujeita a uma análise de longo horas cinética de cada vez. Nós apresentamos um método que mede simultaneamente várias células, acelerando assim o processo de coleta de dados.

Uma resolução mais rápida, alta, MTPA-GFP baseada em ensaio de fusão mitocondrial aquisição de dados cinéticos de várias células em paralelo usando microscopia confocal

Este vídeo descreve um ensaio baseado em leitor de placas para medir a captação de cálcio mitocondrial em mitocôndrias isoladas. O ensaio analisa o sinal de fluorescência de um corante fluorescente sensível ao cálcio para estudar a cinética da captação de cálcio mitocondrial e da sobrecarga de cálcio.

Ensaio de captação de cálcio mitocondrial: um método baseado em leitor de placas para medir a captação de cálcio em mitocôndrias isoladas

Este vídeo descreve um ensaio baseado em imagens de microscopia confocal para medir a captação de cálcio mitocondrial em células cultivadas. O ensaio usa o corante fluorescente sensível ao cálcio Rhod-2/AM para medir o cálcio mitocondrial em células cultivadas permeabilizadas.

Ensaio de influxo de cálcio para medir a captação de cálcio mitocondrial em células cultivadas

O vídeo demonstra a medição simultânea dos níveis de cálcio intracelular e alterações no potencial de membrana em células endoteliais de segmentos de artéria cerebral de camundongos. O tubo endotelial isolado é carregado com um indicador fluorescente de cálcio e tratado com um medicamento que induz a liberação intracelular de cálcio, resultando em uma alteração no potencial de membrana. A fluorescência do indicador permite a medição dos níveis de cálcio e um eletrodo de registro é inserido em...

Medição simultânea do cálcio intracelular e do potencial de membrana em um endotélio cerebral de camundongo

Este protocolo destina-se a descrever um método para examinar a capacidade de retenção do Ca2 + e Ca2 +- desencadeada mitocondrial inchaço das mitocôndrias isoladas de SH-SY5Y células passo a passo.

Mitocondrial Ca2 + retenção capacidade do ensaio e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial do ensaio

Aqui, apresentamos dois protocolos para a medição de mitocondrial Ca2 + afluxo em mitocôndrias isoladas e células cultivadas. Por mitocôndrias isoladas, detalhamos uma placa baseada no leitor Ca2 + importação ensaio usando o Ca2 + sensível tingir cálcio verde-5N. Para culturas de células, nós descrevemos um método de microscopia confocal, usar a tintura de Ca2 + Rhod-2h.

Análises de influxo de cálcio mitocondrial em mitocôndrias isoladas e células cultivadas

Demonstrado aqui são protocolos para isolar (1) recém endoteliais cerebrais intactos "tubos" e medições (2) simultâneas de cálcio endotelial e potencial durante o endotélio-derivado hiperpolarização de membrana. Além disso, esses métodos permitem a otimização farmacológica de cálcio da célula endotelial e sinalização eléctrica como variáveis experimentais individuais ou interativas.

Medições simultâneas de cálcio intracelular e potencial de membrana no endotélio Cerebral rato recém isoladas e intacta

Esta técnica descreve um fluxo de trabalho eficaz para visualizar e medir quantitativamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido dentro de células HeLa usando imagens ao vivo baseadas em fluorescência.

Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa

Aprenda a medir cálcio mitocondrial e potencial de membrana simultaneamente em células vivas usando microscopia confocal. Este método sem manipulação genética auxilia pesquisadores a estudar doenças mitocondriais.

Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente

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