Name: Exame de fenótipos de acolhimento em Gambusia affinis Após o tratamento antibiótico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda a examinar efeitos colaterais de antibióticos em Gambusia affinis após tratamento. Este método simples e econômico permite analisar fenótipos fisiológicos e disrupção do microbioma de forma não invasiva.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este projeto foi parcialmente financiado por um prêmio FAST (Faculty and Student Team) para TPP e JMC do EURECA (Centro para Aprimorar Experiências de Pesquisa de Graduação e Atividades Criativas) da Sam Houston State University.

Todos os experimentos com animais foram realizados sob a aprovação de protocolos IACUC, numeradas 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01 e 14-04-17-1018-3-01. 1. Animal Collection, manuseio e cuidados éticos <ol><li> Recolha Gambusia affinis do local de campo (guia de identificação no http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) usando uma pequena rede de mergulho e coloque em 19 baldes L. Use inspeção visual para identificar as espécies. </li><li> peixes descanso para 1-2 d em um balde com água da lagoa. Em seguida, transferir o peixe até 76 ou 189 tanques L aquário cheio de meia água da lagoa / metade água da torneira a 25 ° C, gaseificadas com uma pedra porosa borbulhante. Use uma pequena rede de mergulho durante o manuseamento de peixe como para perturbar minimamente o seu microbioma da pele. NOTA: densidade de peixes deve ser superior a 20 peixes / 38 L de água do aquário. Os peixes são aclimatados para o aquário por pelo menos 5 d antes de experimentação. </li><li> Alimentar os peixes em um regime diário com 5 mg de ração por peixe. Hopeixes ld com um 12 h ciclo claro / escuro de 12 h. </li></ol> 2. A exposição a antibióticos inicial para todas as experiências <ol><li> Tiragem Todos os peixes de cada experimento do mesmo aquário, coloque em dois grupos separados (tratados: expostos a antibióticos e controle: não exposto) em 19 baldes L. Dados anteriores recolhidos mostram que o peixe no mesmo aquário têm homogeneizados microbiomes pele que têm pouca variação na composição da comunidade. 12 </li><li> Durante as experiências, manter os peixes em 2 L de lagoa artificial água (APW; 0,33 g / L de CaCl2, 0,33 g / L de MgSO4, 0,19 g / L de NaHCO3) que é esterilizada em autoclave antes do uso. </li><li> Preparar a solução stock de antibiótico rifampicina por adição de 50 mg / ml em sulfóxido de dimetilo (DMSO). A rifampicina é um antibiótico de largo espectro representativo que é não-tóxica para os peixes. Em humanos e ratos, distribui-se bem nos tecidos. </li><li> A partir do estoque rifampicina administrar uma finalconcentração de 25 ug / mL em 2 L de APW para exposição aos antibióticos do grupo dos peixes tratados durante 3 dias. Note-se que após 3 d, pele cultivável números bacterianos retornar semelhante à da pele de peixe pré-tratado. </li><li> Em paralelo, manter um grupo de peixe não tratado em APW e dar uma quantidade equivalente de DMSO (0,5 mL por cada L de APW) na coluna de água para actuar como um grupo de controlo. </li><li> Como as experiências sejam destina-se a medir os efeitos de uma microbiota alterou-antibiótico em fenótipos de peixe, a fim de evitar efeitos directamente a partir do próprio antibiótico, após a exposição de três dias de antibiótico (ou de controlo) período, a transferência de peixe dentro de um balde com 2 L de APW fresco. <ol><li> Use um período de descanso de 10 horas para que o antibiótico é removido por os corpos dos peixes. Base de Dados desta vez eliminação em experimentos onde os peixes foram expostos a 25 mg / mL de antibiótico durante três dias. Euthanize o peixe cortando a medula espinhal seguido de mielotomia, homogeneizar em seguida o corpo inteiro usando um triturador de tecidos.</li><li> Determinar a presença de antibióticos através da colocação de 50 ul desta suspensão, depois de filtração de 0,2 um para o centro de uma placa de petri de agar. Faça um buraco para esta suspensão pressionando uma cabeça para baixo estéril 200 mL ponta da pipeta na agar, que remove um pequeno plug. </li><li> Utilizar placas de agar com 20 ml de volume medido de ágar nutriente, e espalhar uniformemente usando um cotonete de algodão com um organismo indicador, Bacillus subtilis, que é sensível à rifampicina. Obter o B. subtilis a partir de um ágar nutriente incubadas a 25 ° CO / N e utilizando a haste de algodão para se obter uma colónia. Observando-se uma zona de inibição após incubação durante a noite a 25 ° C, indica a presença de antibiótico nos tecidos de peixes. </li></ol></li></ol> 3. Microbiome Extração <ol><li> Extrair uma amostra de pele a partir de microbioma epiderme mucosas exteriores, colocando o peixe dentro de um tubo estéril cónico de 15 mL cheio com 2 ml de PBST estéril (Na 137 mMCl, 10 mM de fosfato, 0,1% de Tween-20, pH 7,4) e solução de vórtex com uma definição de 10 durante 1 min, com incrementos de 10 s pausa. Detergente e sal no tampão promove a dispersão uniforme de bactérias em solução. Resultados comparáveis ​​foram encontrados com 0,85% de solução salina mas baixou contagens bacterianas com água pura. </li><li> Transferir o peixe do tubo cónico para um balde de recuperação. A letalidade de extracção da pele é tipicamente menor do que 10%. Ou, analisar a suspensão bacteriana no tubo imediatamente após extracção ou sedimentar as bactérias por centrifugação a 2 minutos numa centrifugadora à temperatura ambiente a 15000 xg e armazenar a -80 ° C para análise futura. NOTA: Toda a cultura e análises bioquímicas são imediatos; ADN ou de extracção de proteína pode ser a partir de amostras congeladas. </li><li> Para obter uma amostra do intestino microbioma, primeiro coloque o peixe em uma placa de Petri estéril. Euthanize o peixe, cortando a medula espinhal cervical diretamente atrás da cabeça com uma tesoura cirúrgica, seguido por mielotomia, E, em seguida, o corpo higienizar externamente com 70% de etanol toalhetes. </li><li> Após a dissecção, remover todo o intestino por corte após o esôfago e antes do ânus. </li><li> Cortar o intestino em seções pequenas 1 - 2 mm de comprimento e coloque todas as seções em duas mL de solução PBST em um tubo cônico. Após vortex durante 1 min, remover o sobrenadante para outro tubo limpo (tome cuidado para não chamar-se as secções do intestino). NOTA: O sobrenadante contém as bactérias do intestino extraídos que podem ser utilizados para análises directas ou granuladas pelo método anterior mencionados para amostras de pele. </li></ol> 4. Infecção preparação do modelo e banho de um patógeno específico <ol><li> Obter uma estirpe infecciosa de Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) e manter a cultura armazenada a -80 ° C. Strain 93-146 utilizados neste estudo, isolado a partir de um peixe-gato infectado, foi obtido de Mark Lawrence, Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Estadual de Mississippi. </li><li> streestoque ictaluri AK E. para um meio selectivo e diferenciais chamada E. ictaluri meios (MIE) de agar de 19 a cultura das bactérias e incubar durante 2 d a 27 ° C. </li><li> Transferir uma colónia puro isolado a partir da cultura e inocular um frasco de 150 ml contendo 40 ml de caldo nutriente (NB; 5 g / L de peptona, 4 g / L de extracto de carne de vaca). Colocar o balão num agitador ajustado a 150 rpm durante 2 d a 27 ° C. </li><li> Após a incubação, dilui-se uma amostra da cultura em PBST a um espectrómetro de leitura de 0,2 DO a 650 nm para calibrar E. cultura ictaluri para volumes de doses infecciosas desejados. </li><li> Próxima transferência ambas tratadas (após 3 d da exposição a antibióticos) e grupos de peixes não tratados em copos plásticos contendo 130 mL de água doce da lagoa artificial, ou APW por aproximadamente 10 h para a eliminação da droga dos tecidos do peixe. </li><li> Em seguida, de ambos os grupos, transferir novamente a cada peixe em copos de plástico de 8 onças contendo 130 mL de APW limpo. </li&gt; <li> Dê a cada peixe uma dose letal contendo 2,8 x 10 6 UFC / mL de E. cultura ictaluri na APW (modelo de infecção banheira) e manter-se em um 27 ° C incubadora por 24 h. </li><li> Após o banho ictaluri E., transferir peixe individualmente em novos copos com 130 mL de APW. </li><li> Na sequência de reposição de água, ficha mortandade de peixes ao longo da duração de uma semana. Os peixes não são alimentados ao longo deste período. Em contraste com o peixe-gato, Gambusia não mostram sinais externos de infecção, portanto, é essencial utilizar letalidade como um ponto final experimental. </li></ol> 5. polimicrobiana Desafio com fezes e solo <ol><li> Tratamento fezes <ol><li> Obter fezes humanas frescas de um assunto voluntários saudáveis ​​que não receberam antibióticos nas duas semanas anteriores, usando luvas estéreis e um tubo cônico estéril 50 mL. </li><li> Após a coleta, recolher a matéria fecal em um saco plástico estéril e, em seguida, transferir para um estéril 15 mL ctubo onical. Criar uma concentração da suspensão por fezes em PBST para se obter uma solução de estoque de 500-800 mg / mL. Esta mistura espessa é melhor para transferir com um 1 ml ou maior ponta de pipeta de plástico que tenha sido cortada na parte inferior com uma tesoura esterilizada de modo a que a abertura é maior. </li><li> Após a exposição inicial de antibióticos de grupos de peixes tratados e não tratados controle, separam-se em copos de plástico individuais contendo suspensão fecal em concentrações finais de qualquer de 15 mg / mL ou 10 mg / mL em APW com um volume total de 130 mL. Segurar copos numa incubadora a 25 ° C. </li><li> mortandade de peixes registro durante a exposição fecal pela observação atenta sobre 2 d. </li></ol></li><li> O tratamento do solo <ol><li> Recolha 1 - 2 kg de rico solo orgânico (deve conter a maior densidade e diversidade de micróbios) aproximadamente 7 - 15 centímetros para baixo em profundidade e coloque em um recipiente de plástico limpo. Note-se que o solo deve ser utilizado no prazo de dois dias após a colheita. </li><li> terrívelctly após o período de exposição inicial, separar ambos os grupos de antibiótico tratado e não tratado de peixes em copos de plástico individuais contendo 18,2 g de solo em 130 mL de APW. Misturar o solo no poço de água à mão antes de adicionar o peixe. A maioria das partículas não suspender e ficar no fundo do copo. </li><li> Expor peixe para uma duração de 3 d a 25 ° C e registar qualquer mortalidade. </li></ol></li></ol> 6. Desafio estresse osmótico <ol><li> Após o tratamento, seguido de um período de repouso de 10 h, como descrito acima, individualizar peixes em copos separados contendo NaCl a 17,5 mg / mL (300 mM) em 150 mL de APW. Isto é metade da salinidade da água do mar normal, o que não é completamente letal (&lt;50%) para controlar peixes, mas é fortemente estressante, exigindo osmoregulação eficaz. </li><li> Observar o desenvolvimento de mortandade de peixes ao longo de um período de 36 h. </li></ol> 7. Nitrate Toxicidade Desafio <ol><li> peixes descanso por um período de 10 h após expos antibióticosUre, peixes e, em seguida, separado em copos individuais contendo uma concentração de nitrato de sódio 10 mg / ml (118 mM) ou 17,5 mg / ml (206 mM) em 130 mL de APW. </li><li> Recorde de mortalidade durante 4 d para a dose baixa e 1 d para a dose alta. </li></ol> 8. Análise de crescimento dos peixes individualizada ou agrupada <ol><li> exposição a antibióticos ou controle período de 3 d completa como grupos em baldes. </li><li> Para individual, preencher 8-oz copos de isopor com 150 mL APW cada, transferir uma peixes individuais no copo e registe o peso total do corpo para a avaliação inicial. <ol><li> Repita o procedimento para todos os peixes em ambos os grupos tratados e não tratados. Use copos de isopor branco em vez de copos de plástico transparente porque o peixe não vai comer quando nos copos claros. </li></ol></li><li> Alimentar os peixes diariamente com a dieta padrão de duas pelotas por peixes. Os sedimentos foram usadas em vez de flocos, devido aos projéteis têm baixa variação na massa individual (3,53 ± 0,42 mg cada um, ou variação de 8%), resulting em peixes recebendo quantidades similares de alimentos. Monitorar o consumo gravando visualmente pelotas não consumidos. As taxas de consumo eram tipicamente acima de 80%. </li><li> No final de cada semana, durante 4 semanas, determinar o peso do peixe. Prepare um novo copo com APW fresco, coloque em um equilíbrio, e, em seguida, registrar o peso. Em seguida, verter um peixe em uma rede de mergulho do copo original e transferir para a nova taça, que é então pesado novamente. Os peixes não são tratadas para evitar o estresse. </li><li> Para grupos, coloque 2 litros de APW em um 19 L balde e rasgou a escala. Manter os peixes juntos em ambos os grupos durante a transferência para novos baldes APW, em seguida, gravar o peso total do grupo. Registro do peso do grupo de peixe a cada semana mais de um mês período de tempo, transferindo para um novo balde. </li></ol> 9. Gut Transit Time <ol><li> Use 70 kDa aniónico dextrano marcado com fluoresceína. O dextrano não é significativamente digerido, e é muito grande para ser absorvida através da camada do intestino, assim, a passagem irá medir o tempo de trânsito através do intestino.dextrano marcado foi incorporado em alimentos para peixes. </li><li> Para um tubo de 1,7 ml estéril, adicionar 360 mL de água desionizada estéril e 52 mg de gelatina (solução a 13%), e colocar o tubo num bloco de calor a 60 ° C até derreter gelatina e é totalmente dissolvido. <ol><li> Moagem flocos de peixe do alimento até um pó fino usando um almofariz e pilão, e adicionar 40 mg deste pó ao tubo, em conjunto com 20 uL de óleo de peixe. Depois de misturar, adicionar 1,6 mg de FITC-dextrano. </li></ol></li><li> Distribua a mistura de líquido quente em 20 mL cai sobre Parafilm na bancada do laboratório, e deixá-los esfriar rapidamente e solidificar. Drops pode ser armazenado por até 4 d antes que se tornem muito difícil para os peixes para comer. Loja gotas no frigorífico, colocando o Parafilm para metade de uma placa de Petri, que é então lançada sobre água esterilizada dentro de um recipiente de plástico fechado, o que mantém as gotas umidificadas. </li><li> Pouco antes de alimentação, trimestre cai em seções usando uma lâmina de barbear. Aclimatar o peixe para o Styrocopos de espuma individualmente por 2 dias sem alimentação (Nota: foram utilizados apenas os peixes de controlo não exposto). Coloque quatro trimestres de a comida no copo com o peixe, e observar o peixe por 30 minutos por quantos pedaços de comida que cada um comer. </li><li> Para começar o período de monitoramento, a transferência de peixe individualmente em copos com 80 ml de APW, utilizando uma rede de mergulho. A cada 2 h, rode suavemente o APW à mão, e em seguida, tomar uma amostra de 1 mL e armazenar em um 1,7 tubo rotulado mL a 4 ° C. Colher amostras para 36 h. </li><li> fluorescência da ficha, com um espectrofotómetro de fluorescência, de todas as amostras, ao mesmo tempo após a conclusão do ensaio. Coloque toda a amostra 1 mL numa cuvete e gravar a fluorescência medida com excitação a 495 nm e emissão a 520 nm. </li></ol>

<ol><li>Panda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-Term+Effect+of+Antibiotics+on+Human+Gut+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Short-Term Effect of Antibiotics on Human Gut Microbiota.</a> PloS ONE. 9 (4), 95476(2014).</li>
<li>Perez-Cobas, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+disturbance+during+antibiotic+therapy%3A+a+multi-omic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota disturbance during antibiotic therapy: a multi-omic approach.</a> Gut. 62 (11), 1591-1601 (2013).</li>
<li>Theriot, C. M., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+and+metabolic+interactions+between+the+gastrointestinal+tract+and+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Microbial and metabolic interactions between the gastrointestinal tract and Clostridium difficile infection.</a> Gut Microbes. 5 (1), 86-95 (2014).</li>
<li>Buffie, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+microbiome+reconstitution+restores+bile+acid+mediated+resistance+to+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile.</a> Nature. 517, 205-208 (2015).</li>
<li>Sekirov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-Induced+Perturbations+of+the+Intestinal+Microbiota+Alter+Host+Susceptibility+to+Enteric+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-Induced Perturbations of the Intestinal Microbiota Alter Host Susceptibility to Enteric Infection.</a> Infect Immun. 76 (10), 4726-4736 (2008).</li>
<li>Looft, T., Allen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+effects+of+antibiotics+on+mammalian+gut+microbiomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Collateral effects of antibiotics on mammalian gut microbiomes.</a> Gut Microbes. 3 (5), 463-467 (2012).</li>
<li>Magnadottir, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15950491">Innate immunity of fish.</a> Fish Shellfish Immunol. 20 (2), 137-151 (2006).</li>
<li>Gomez, D., Sunyer, J., Salinas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mucosal+immune+system+of+fish%3A+the+evolution+of+tolerating+commensals+while+fighting+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">The mucosal immune system of fish: the evolution of tolerating commensals while fighting pathogens.</a> Fish Shellfish Immunol. 35 (6), 1729-1739 (2013).</li>
<li>Nunes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Effects+of+Tetracycline+Exposure+in+the+Freshwater+Fish+Gambusia+holbrooki%3A+Antioxidant+Effects%2C+Neurotoxicity+and+Histological+Alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Environ+Contam+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Acute Effects of Tetracycline Exposure in the Freshwater Fish Gambusia holbrooki: Antioxidant Effects, Neurotoxicity and Histological Alterations.</a> Arch Environ Contam Toxicol. 68 (2), 331-381 (2014).</li>
<li>Fryxell, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+ratio+variation+shapes+the+ecological+effects+of+a+globally+introduced+freshwater+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Sex ratio variation shapes the ecological effects of a globally introduced freshwater fish.</a> Proc Biol Sci. , 22(2015).</li>
<li>Nunes, B., Miranda, M. T., Correia, A. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27074930">Absence of effects of different types of detergents on the cholinesterase activity and histological markers of mosquitofish (Gambusia holbrooki) after a sub-lethal chronic exposure.</a> Environ Sci Pollu Res Int. , 1-8 (2016).</li>
<li>Leonard, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://file.scirp.org/pdf/AiM_2014051916164703.pdf">The Skin Microbiome of Gambusia affinis Is Defined and Selective.</a> Adv Microbiol. 4, 335-343 (2014).</li>
<li>Carlson, J. M., Hyde, E. R., Petrosino, J. F., Manage, A. B. W., Primm, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+effects+of+Gambusia+affinis+with+an+antibiotic-disrupted+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+C+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The host effects of Gambusia affinis with an antibiotic-disrupted microbiome.</a> Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 163-168 (2015).</li>
<li>Karsi, A., Gulsoy, N., Corb, E., Dumpala, P. R., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+bioluminescence-based+mutant+screening+strategy+for+identification+of+bacterial+virulence+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High-throughput bioluminescence-based mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (7), 2166-2175 (2009).</li>
<li>Hawke, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edwardsiellosis+caused+by+Edwardsiella+ictaluri+in+Laboratory+Populations+of+Zebrafish+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J+Aquat+Anim+Health%22%5BJournal%5D)">Edwardsiellosis caused by Edwardsiella ictaluri in Laboratory Populations of Zebrafish Danio rerio.</a> J Aquat Anim Health. 25 (3), 171-183 (2013).</li>
<li>Petrie-Hanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Zebrafish+Danio+rerio+as+a+Model+for+Enteric+Septicemia+of+Catfish+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Aquat+Anim+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Zebrafish Danio rerio as a Model for Enteric Septicemia of Catfish (ESC).</a> J Aquat Anim Health. 19 (3), 151-158 (2007).</li>
<li>Fultz, R. S., Primm, T. P. A Laboratory Module for Host-Pathogen Interactions: America's Next Top Model. J. Microbiol. Biol. Educ. 11, abstract 20-B (2010).</li>
<li>Uliano, E., Cataldi, M., Carella, F., Migliaccio, O., Iaccarino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+changes+in+salinity+and+temperature+on+routine+metabolism+and+nitrogen+excretion+in+gambusia+%28Gambusia+affinis%29+and+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Effects of acute changes in salinity and temperature on routine metabolism and nitrogen excretion in gambusia (Gambusia affinis) and zebrafish (Danio rerio).</a> Comp Biochem Physiol A. 157, 283-290 (2010).</li>
<li>Shotts, E. B., Waltman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+medium+for+the+selective+isolation+of+Edwardsiella+ictaluri%5BTitle%5D)+AND+%22J+Wildl+Dis%22%5BJournal%5D)">A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri.</a> J Wildl Dis. 26, 214-218 (1990).</li>
<li>Under animal toxicity studies, sodium chloride entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from:
 <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016).</li>
<li>Under animal toxicity studies, sodium nitrate entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from:
 <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016).</li>
<li>Under animal toxicity studies, sodium nitrite entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from:
 <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016).</li>
<li>Vilz, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Assessment+of+Intestinal+Motility+and+Gut+Wall+Inflammation+in+Rodents%3A+Analyses+in+a+Standardized+Model+of+Intestinal+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation.</a> J Vis Exp. (67), e4086(2012).</li>
<li>Katoh, H. International Harmonization of Laboratory Animals. National Research Council (US) International Committee of the Institute for Laboratory Animal Research. Microbial Status and Genetic Evaluation of Mice and Rats: Proceedings of the 1999 US/Japan Conference. , National Academies Press. (2000).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Alguns desafios requerem um período de descanso na APW limpo após o tratamento antibiótico para a droga para ser empobrecido em tecidos de peixes. Se o período de descanso é ignorado, então a presença de antibióticos podem confundir os resultados, especialmente quando o ensaio envolve a exposição a bactérias. A fim de examinar os efeitos de uma composição microbioma alterada sem grandes alterações no número total de micróbios no host, experimentos preliminares monitorização da composição da microbiota (16S perfis ou seq...

Foi estabelecido que os antibióticos podem perturbar o microbioma humano levando a dysbiosis, o que significa um desequilíbrio comunidade microbiana. Alteração da composição da microbiota após tratamentos com antibióticos foi demonstrado para diminuir a diversidade da comunidade, reduzir os membros-chave, e alterar o metabolismo da comunidade, especialmente no intestino 1, 2. Perturbação antibiótico do microbioma intestinal pode reduzir a resistência à colonização a Clostridium difficile 3, 4 e 5 Salmonella. Além disso, a interrupção da microbiota tem sido associada com o desenvolvimento de muitas doenças e síndromes em seres humanos (por exemplo, associada a antibióticos enterocolite, doença inflamatória do intestino, desordens metabólicas, etc.). Os antibióticos também são amplamente implementadas na agricultura como promotores de crescimento nagado e aves de produção 6. O uso dessas ferramentas poderosas não é sem efeitos colaterais, o que é evidente no rápido aumento da resistência aos antibióticos, bem como os efeitos de um microbioma interrompido tem com seu hospedeiro habitado. Muitos estudos têm mostrado que o amplo espectro da utilização de antibióticos tem longos consequências duradouras para a estrutura e função da microbiota, mas os efeitos colaterais de um microbioma impactando fisiologia acolhimento interrompido aos antibióticos são apenas especulações que ainda têm de ser suportados. A interação entre hospedeiros, microbiota e antibióticos está longe de ser entendida de uma forma concisa. Portanto, um modelo simples e mais tratável é vantajoso para lançar luz sobre o sistema de mamíferos altamente complexa. superfícies mucosas em seres humanos, incluindo o intestino, abrigam a maior densidade e diversidade de micróbios, e também as interações entre microorganismos e acolhimento mais íntimos. O microbioma da pele da mucosa oferece peixes svantagens everal como um sistema modelo. O Teleostei (peixes ósseos) é uma das primeiras linhagens a divergir na acepção Vertebrados que teleósteos ter tanto inata e adquirida sistemas imunitários que co-evoluíram um relacionamento com comunidades bacterianas comensais 7. Partes de pele de peixe muitas características com as superfícies das mucosas um tipo de mamíferos, tais como as funções fisiológicas, componentes de imunidade, e arranjo de células produtoras de muco 8. A localização externa da superfície do peixe pele mucosa oferece um microbioma fácil de manipular experimentalmente e amostra. O mosquitofish Ocidental, Gambusia affinis (G. affinis), é um modelo de peixe que tem sido utilizado no passado para o estudo de toxicologia de acoplamento e 9, 10, 11. Dado o pequeno tamanho, abundância população em estado selvagem como uma espécie invasora, m<html> o custo de cuidados inimal e natureza resistente, temos desenvolvido G. affinis como um modelo microbioma mucosa. Além disso, Gambusia compartilhar a fisiologia de dar à luz filhotes vivos com mamíferos vivíparos, o que é raro em espécies de peixes. Nós completaram o estudo mais extenso no momento da pele de peixe microbiota normal usando 16S perfilar com Gambusia 12. Além disso trabalho demonstrou três efeitos negativos sobre o hospedeiro seguintes perturbações da pele e da flora intestinal através de um antibiótico de largo espectro 13. Cinco efeitos diferentes foram examinados nos peixes após a exposição aos antibióticos. O benefício de acolhimento mais bem estabelecida do microbioma é a exclusão competitiva de patógenos. O patógeno peixes Edwardsiella ictaluri é conhecido por causar surtos de septicemia entérica em fazendas catfish comerciais 14. E. ictaluri também foi mostrado para infectar letalmente peixe-zebraclass = &quot;xref&quot;&gt; 15, 16 e 17 Gambusia. Um desafio com este agente patogénico a partir da coluna de água pode servir como uma medida de exclusão. Como uma comparação para susceptibilidade a um patógeno indivíduo, sobrevivência durante a exposição a uma alta densidade de organismos mistos também foi efectuada. Fezes e solo orgânico-ricos foram usados ​​como fontes comumente encontradas de comunidades microbianas. Outro papel estabelecido a comunidade intestino bacteriana executa é o processamento de nutrientes e energia colheita, afetando a absorção nutricional global para o anfitrião. Como uma medição bruta de alimentação, o peso do corpo dos peixes foi comparado antes e depois de um mês de ser alimentados com uma dieta padrão. Tratados com antibióticos de peixe como uma média perderam peso, enquanto peixes de controle, em média, ganho de peso ao longo do mês. O mecanismo para esta falta de ganho de peso não é clara. Um factor que contribui possível é o tempo de trânsito dos alimentos no intestino. A moti GIlidade método foi adaptado do peixe-zebra (Adam Rich, SUNY Brockport, comunicação pessoal) para determinar o tempo de trânsito. Ainda não foi determinado se os peixes tratados com antibiótico tem um tempo de trânsito alterada. Um desafio comum vivida no ambiente natural por todos os organismos, especialmente peixes, é o estresse osmótico. Gambusia foram mostrados para adaptar-se rapidamente quando agudamente sublinhado em altas concentrações de salinidade 18. Surpreendentemente, os peixes com um microbioma alterou a antibióticos exibiu reduzido sobrevivência a uma tensão elevada de sal. O mecanismo para este romance fenótipo está sob investigação. Outro esforço comum em animais aquáticos, especialmente em aquários, é formas tóxicas de azoto (amoníaco, nitrato e nitrito). Sobrevivência contra o nitrato não foi significativamente diferente entre os tratados com antibiótico e controle de peixe. Os métodos apresentados neste manuscrito pode ser usado com ou Gambusia modelo peixe semelhante organismos, tais como zebrapeixes e medaka, para medir fenótipos nos peixes após a manipulação experimental.

<table><tbody><tr><td>Rifampicina</td><td>Calbiochem</td><td>557303-1GM</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de Sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>Marcado com fluoresceína 70 kDa dextrano aniônico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos de solução salina tamponada com fosfato (PBS) Os comprimidos</td><td>de Calbiochem</td><td>6500-OP</td><td>dissolvem-se em água para fazer PBS</td></tr></tbody></table>

exame de fenótipos de acolhimento em<em&gt; gambusia affinis</em&gt; após o tratamento antibiótico

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

A semelhança do uso de antibióticos na medicina significa que a compreensão das consequências resultantes para o hospedeiro é vital. Os antibióticos geralmente diminuem a diversidade da comunidade do microbioma do hospedeiro e alteram a composição da comunidade microbiana. Muitas doenças, como enterocolite associada a antibióticos, doença inflamatória intestinal e distúrbios metabólicos, têm sido associadas a uma microbiota interrompida. A complexa interação entre hospedeiro, microbioma e antibióticos precisa de um modelo tratável para estudar as interações hospedeiro-microbioma. Nossos peixes vertebrados de água doce servem como um modelo útil para investigar os aspectos universais da estrutura e função do microbioma da mucosa, bem como analisar os efeitos consequentes do hospedeiro da alteração da comunidade microbiana. Os métodos incluem desafios do hospedeiro, como infecção por um patógeno de peixe conhecido, exposição a micróbios fecais ou do solo, estresse osmótico, toxicidade por nitrato, análise de crescimento e medição da motilidade intestinal. Essas técnicas demonstram um sistema modelo flexível e útil para determinação rápida de fenótipos de hospedeiros.

Um diagrama esquemático geral do sistema experimental utilizado para estudar os efeitos da exposição do hospedeiro peixe antibiótico 13 está representada na Figura 1A e inclui a técnica para a extracção da pele (Figura 1B) e intestino (Figura 1C) microbiomas do peixe. Três dias foi seleccionado como o período de exposição aos antibióticos porque dados anteriores revela que, enquanto o número total de pele cultiváv...

Este estudo envolve métodos para revelar efeitos sobre um modelo hospedeiro peixe seguintes alterações da pele e do intestino composição comunidades microbioma por um antibiótico.

Exame de fenótipos de acolhimento em<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Após o tratamento antibiótico

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

O objetivo geral deste sistema experimental é examinar os efeitos colaterais negativos em um organismo hospedeiro após o tratamento com antibióticos. Assim, este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do microbioma, como os efeitos colaterais associados ao enbac na saúde do hospedeiro, mediados por um microbioma perturbado. As principais vantagens desta técnica são que o sistema é simples, de baixo custo para examinar fenótipos fisiológicos de hospedeiros vertebrados e permite a perturbação não invasiva do microbioma mucoso.As implicações dessa técnica caracterizam como uma interrupção no microbioma de um animal pode levar a efeitos colaterais graves. Para começar, faça um esgotamento de uma cepa infecciosa de Edwardsiella ictaluri, previamente obtida e congelada, em meio-ágar seletivo e diferencial E.Ictaluri. Incube o cultivo a 27 graus Celsius por dois dias.Transfira uma colônia isolada pura do cultivo e inocule um frasco de 150 mililitros contendo 40 mililitros de caldo nutriente. Coloque o frasco em um incubador com agitação a 27 graus Celsius e 150 RPM por dois dias. Após a incubação, para calibrar o cultivo de E. ictaluri para os volumes desejados de dose infecciosa, use PBST para diluir uma amostra do cultivo até uma OD 650 de 0,2.Após coletar Gambusia affinis e tratar os peixes com rifampicina na coluna d'água por três dias, transfira os grupos de peixes tratados com antibiótico e os controles não tratados para copos plásticos individuais contendo 130 mililitros de água artificial de lagoa fresca, ou APW, por aproximadamente 10 horas para a eliminação do fármaco dos tecidos dos peixes. Em seguida, separe novamente os peixes em copos plásticos individuais de oito onças contendo 130 mililitros de APW limpa. Administre uma dose letal de cultura de E.Ictaluri para cada peixe e incube os peixes a 27 graus Celsius por 24 horas.Após o banho com E.Ictaluri, transfira cada peixe para um novo copo com 130 mililitros de APW. Sem alimentar os peixes, registre a mortalidade dos peixes ao longo de uma semana. Colete as fezes em um saco plástico estéril antes de transferi-las para um tubo cônico estéril de 15 mililitros, depois use PBST para criar uma concentração estoque das fezes de 500 a 800 miligramas por mililitro; utilizando uma pipeta plástica de um mililitro ou maior com a ponta cortada, prepare 130 mililitros por copo de 15 miligramas por mililitro ou 10 miligramas por mililitro de matéria fecal em APW.Transfira os peixes tratados ou não tratados com antibiótico para copos individuais contendo a solução e, em seguida, incube os peixes a 25 graus Celsius por dois dias, observando e registrando atentamente a mortalidade durante esse período. Para tratar os peixes com solo, colete um a dois quilogramas de solo orgânico rico, com profundidade aproximada de sete a 15 centímetros, e transfira-o para um recipiente plástico limpo. Prepare copos plásticos individuais contendo 18,2 gramas de solo e 130 mililitros de APW, misturando bem o solo manualmente; em seguida, transfira os peixes tratados ou não tratados com antibiótico para os copos e mantenha-os a 25 graus Celsius por três dias, registrando qualquer mortalidade.Após um período de repouso de 10 horas em APW após o tratamento com antibiótico, transfira os peixes para copos individuais contendo 17,5 miligramas por mililitro de cloreto de sódio e APW, observe os peixes durante 36 horas quanto à mortalidade; para realizar um desafio de toxicidade por nitrato, após um período de repouso de 10 horas como antes, separe os peixes em copos individuais contendo 10 ou 17,5 miligramas por mililitro de nitrato de sódio e 130 mililitros de APW. Observe os peixes ao longo de um dia quanto à mortalidade na dose alta de nitrato de sódio, e quatro dias para os peixes na dose baixa. Após concluir a exposição a antibiótico ou controle por três dias em grupos, para peixes individuais, preencha copos de isopor de oito onças com 150 mililitros de APW, e após pesar os copos cheios, transfira os peixes para os copos, então registre o peso corporal total para avaliação inicial.Alimente os peixes diariamente com dois pellets de ração por peixe e monitore o consumo registrando visualmente os pellets não consumidos. Ao final de cada semana, durante quatro semanas, determine o peso dos peixes pesando primeiro um copo de APW fresco e anotando o peso; em seguida, despeje os peixes em uma peneira e transfira-os para um novo copo antes de pesar o copo novamente. Para grupos de peixes, coloque 150 mililitros de APW em um copo e zerar a balança.Mantenha os peixes juntos em ambos os grupos ao transferi-los para novos recipientes com APW e, em seguida, registre o peso total do grupo. Repita a pesagem ao final de cada semana ao longo de um mês. Para analisar o tempo de trânsito intestinal, adicione 360 microlitros de água estéril desionizada e 52 miligramas de gelatina em um tubo estéril de 1,7 mililitro e coloque-o em um bloco de aquecimento a 60 graus Celsius até que a gelatina derreta e se dissolva completamente.Usando um almofariz e um pistilo, triture as flocas de alimento para peixes dourados em um pó fino e adicione 40 miligramas do pó ao tubo junto com 20 microlitros de óleo de peixe. Após misturar, adicione 1,6 miligrama de dextrana marcada com FitC. Dispense gotas de 20 microlitros do líquido quente sobre parafina colocada na bancada do laboratório e deixe esfriar e solidificar rapidamente.Coloque o parafilm em metade de uma placa de Petri e deixe-a flutuar sobre água estéril dentro de um recipiente plástico fechado. Armazene as gotas solidificadas na geladeira por até quatro dias antes que fiquem muito duras para os peixes comerem. Pouco antes da alimentação, use uma lâmina de barbear para cortar as gotas em quartos.Adapte os peixes a copos individuais de isopor por dois dias sem alimentação, coloque quatro pedaços do alimento no copo com o peixe e observe o peixe por 30 minutos para verificar quantas partes do alimento cada um consome. Para iniciar o monitoramento, transfira peixes individuais para copos com 80 mililitros de APW e, a cada duas horas, colete uma amostra de 1 mililitro. Armazene-a em um tubo de 1,7 mililitro identificado e mantenha a quatro graus Celsius.Após a conclusão do ensaio, coloque uma amostra inteira de um mililitro em uma cubeta e use um espectrofotômetro de fluorescência para registrar a fluorescência com uma excitação de 495 nanômetros e uma emissão de 520 nanômetros para todas as amostras ao mesmo tempo. Como mostrado aqui, peixes com microbioma alterado por antibióticos foram mais suscetíveis à infecção por E. Ictaluri do que os peixes controle. A diferença no tempo médio até a morte entre os peixes tratados e os peixes controle não foi significativa.Isso provavelmente se deve ao tamanho reduzido do grupo. Este gráfico ilustra que peixes expostos à rifampicina foram mais suscetíveis ao estresse osmótico do que os peixes controle; com este ensaio, níveis de salinidade acima de 18 miligramas por mililitro resultaram em morte rápida dos peixes. Como demonstrado nesta tabela, quando expostos à toxina nitrato na coluna d'água, a pré-exposição ao tratamento com antibiótico não afetou a sobrevivência.À concentração de 10 miligramas por mililitro, observou-se letalidade de 50% tanto no grupo tratado com antibiótico quanto no grupo controle após 90 horas. Neste experimento, utilizando peixes controle em um aquário, foram fornecidas aos peixes duas seções ou uma única seção de alimento marcado com dextrana FitC, a fim de examinar o tempo de trânsito alimentar mediante a medição da fluorescência na água ao redor ao longo do tempo. Após este procedimento, outros métodos, como a medição das reservas totais de gordura corporal e a quantificação da produção de muco na pele, podem ser realizados para compreender os mecanismos envolvidos e identificar fatores de confusão que possam contribuir para efeitos negativos no hospedeiro.

examination-host-phenotypes-gambusia-affinis-following-antibiotic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Bernut, A., et al., Decifração e Imagem da Patogênese e Cordamento de Mycobacterium abscessus em embriões de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2015).Este vídeo demonstra um protocolo para isolar e quantificar Mycobacterium abscessus de um embrião infectado de peixe-zebra. O procedimento envolve eutanásia embrionária, lise dos tecidos e homogeneização para liberar as bactérias, seguidas de centrifugação e ressuspensão em um tampão de surfactante. Por fim, a suspensão bacteriana é diluída em...

Isolamento e Cultivo de Bactérias a partir de Embriões de Peixe-Zebra para Avaliar a Carga de Infecção

Fonte: Le, T. A. N. , et al., Medindo os Efeitos de Bactérias e Produtos Químicos na Permeabilidade Intestinal de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra um ensaio baseado em fluorescência para quantificar a permeabilidade intestinal em C. elegans exposto a Pseudomonas aeruginosa. Comparados aos controles alimentados com Escherichia coli, os vermes tratados com patógenos apresentam maior vazamento de fluoróforos para a cavidade corporal, indicando danos na barreira...

Avaliação da permeabilidade intestinal em C. elegans após exposição bacteriana

Um ensaio ovo-in-worm (EIW) é um método útil para quantificar o comportamento de postura. Alterações na postura de ovos pode ser uma resposta comportamental do organismo...

Medição dos Efeitos de bactérias em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento Usando um Retenção Ensaio Egg

Embriões de peixe-zebra opticamente transparentes são amplamente utilizados para estudar e visualizar em tempo real as interações entre microrganismos patogênicos e as células imunes inatas. A microinjeção de Mycobacterium abscessus, combinada com imagens de fluorescência, é usada para examinar características patogênicas essenciais, como a formação de cordão em embriões de peixe-zebra.

Decifrar e Imagem Patogênese e Cording de<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Em embriões Zebrafish

Este protocolo descreve o uso de cotonetes do reservatório e análise de lodos de sistemas de zebrafish, que leva à detecção de aumentada em comparação com o uso exclusivo de sentinelas para detectar agentes patogénicos como Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. e  Tomentosa de Pseudocapillaria. Propõe-se também um sistema para monitorar os ovos p. tomentosa em quarentena.

Análise ambiental de Aeromonas hydrophilae Mycobacterium spp. tomentosa Pseudocapillaria em sistemas de Zebrafish

Devido às semelhanças marcantes do ciclo de vida e biologia de parasitas da malária de roedores para parasitas da malária humana, modelos de malária de roedores tornaram-se indispensáveis para a pesquisa da malária. Neste documento, padronizamos algumas das técnicas mais importantes utilizadas na análise fenotípica de espécies selvagens e transgênicas de malária por roedores.

Análise fenotípica de roedores malária parasita assexuada e estágios do sangue sexual e estágios do mosquito

Aqui, apresentamos o nemátodo Caenorhabditis elegans como modelo de acolhimento versátil para estudar a interação microbiana.

O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio

Peixe-zebra (Danio rerio) estão se tornando vertebrado modelo animal utilizado para colonização microbiana e patogénese. Este protocolo descreve o uso do protozoário Paramecium caudatum como um veículo para a infecção de origem alimentar em larvas de peixe-zebra. P. caudatum prontamente internaliza as bactérias e obter retomadas por larval zebrafish através de comportamento predando natural.

Usando o protozoário Paramecium caudatum como um veículo para infecções de origem alimentar em larvas de Zebrafish

Este protocolo descreve um modelo de infecção de Aspergillus em larvas de zebrafish. Os esporos de aspergillus são microinjetados na cérebro traseira das larvas, e o tratamento químico é usado para induzir a imunossupressão. A progressão da infecção é monitorada através de uma configuração diária de imagens para monitorar o crescimento fúngico e as respostas imunológicas, bem como a enumeração de esporos vivos por placa de unidade formadora de colônias.

Infecção de larvas de zebrafish com esporos de Aspergillus para análise de interações hospedeiro-patógeno

Este artigo apresenta um protocolo para investigar o efeito de bactérias intestinais individuais do mosquito, incluindo isolamento e identificação de micróbios cultivados de mosquitos midgut, esgotamento de antibióticos de bactérias intestinais de mosquitos e reintroduzir uma espécie específica de bactérias.

Um ensaio de alimentação oral bacteriana com mosquitos tratados com antibióticos

Atualmente, faltam modelos in vivo passíveis de triagem de medicamentos contra infecções bacterianas crônicas. Aqui, descrevemos um protocolo para infecção de ferida por um isolado clínico de Pseudomonas aeruginosa para gerar uma infecção persistente em larvas de peixe-zebra.

Modelagem de infecção persistente por Pseudomonas aeruginosa em larvas de peixe-zebra feridas

Aprenda a examinar efeitos colaterais de antibióticos em Gambusia affinis após tratamento. Este método simples e econômico permite analisar fenótipos fisiológicos e disrupção do microbioma de forma não invasiva.

Exame de fenótipos de acolhimento em

Explorar mais vídeos