Exame de fenótipos de acolhimento em Gambusia affinis Após o tratamento antibiótico

Este estudo envolve métodos para revelar efeitos sobre um modelo hospedeiro peixe seguintes alterações da pele e do intestino composição comunidades microbioma por um antibiótico.

O objetivo geral deste sistema experimental é examinar os efeitos colaterais negativos para um organismo hospedeiro após o tratamento com antibióticos. Portanto, esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do microbioma, como os efeitos colaterais associados ao enbac na saúde do hospedeiro que são mediados por um microbioma interrompido. Portanto, as principais vantagens dessa técnica são que esse sistema é direto, barato no exame dos fenótipos fisiológicos dos hospedeiros vertebrados e permite a interrupção não invasiva do microbioma da mucosa.

As implicações dessa técnica caracterizam como uma interrupção no microbioma de um animal pode levar a grandes efeitos colaterais. Para começar, coloque uma cepa infecciosa previamente obtida e congelada de Edwardsiella ictaluri em ágar médio seletivo e diferencial E.Ictaluri. Incube a cultura a 27 graus Celsius por dois dias.

Transfira uma colônia isolada pura da cultura e inocule um frasco de 150 mililitros contendo 40 mililitros de caldo nutritivo. Colocar o balão numa incubadora agitada a 27 graus Celsius e 150 RPM durante dois dias. Após a incubação, para calibrar a cultura de E.Ictaluri para os volumes de dose infecciosa desejados, use PBST para diluir uma amostra da cultura para um OD 650 de 0,2.

Depois de coletar Gambusia affinis e tratar os peixes com rifampicina na coluna d'água por três dias, transfira os grupos de peixes controle tratados com antibióticos e não tratados para copos plásticos individuais contendo 130 mililitros de água fresca artificial da lagoa, ou APW, por aproximadamente 10 horas para eliminação do medicamento dos tecidos dos peixes. Em seguida, separe o peixe novamente em copos plásticos individuais de oito onças contendo 130 mililitros de APW limpo. Administre uma dose letal de cultura de E.Ictaluri a cada peixe e incube os peixes a 27 graus Celsius por 24 horas.

Após o banho de E.Ictaluri, transfira cada peixe para um novo copo com 130 mililitros de APW. Sem alimentar os peixes, registre a mortalidade dos peixes ao longo de uma semana. Reúna a matéria fecal coletada em um saco plástico estéril antes de transferi-la para um tubo cônico estéril de 15 mililitros e, em seguida, use PBST para criar uma concentração de estoque de matéria fecal de 500 a 800 miligramas por mililitro, usando uma pipeta de plástico de um mililitro ou maior com a ponta cortada, prepare 130 mililitros por xícara de 15 miligramas por mililitro ou 10 miligramas por mililitro de matéria fecal em APW.

Transfira peixes tratados com antibióticos ou não tratados para xícaras individuais da solução e, em seguida, incube os peixes a 25 graus Celsius por dois dias, observando de perto e registrando a mortalidade durante esse período. Para tratar peixes com solo, colete de um a quilos de solo orgânico rico, aproximadamente sete por 15 centímetros de profundidade, e transfira-o para um recipiente de plástico limpo. Prepare copos plásticos individuais contendo 18,2 gramas de solo e 130 mililitros de APW, misturando bem o solo à mão, depois transfira o peixe tratado com antibiótico ou não para os copos e deixe a 25 graus Celsius por três dias enquanto registra qualquer mortalidade.

Após um período de descanso de 10 horas em APW após tratamento com antibióticos, transfira o peixe para copos individuais contendo 17,5 miligramas por mililitro de cloreto de sódio e APW, observe os peixes por mais de 36 horas quanto à mortalidade, para realizar um desafio de toxicidade de nitrato, após um período de descanso de 10 horas como antes, separe os peixes em copos individuais contendo 10 ou 17,5 miligramas por mililitro de nitrato de sódio e 130 mililitros de APW. Observe os peixes ao longo de um dia quanto à mortalidade na dose alta de nitrato de sódio e quatro dias para os peixes na dose baixa. Depois de completar três dias de exposição a antibióticos ou controle em grupos, para peixes individuais, encha copos de isopor de oito onças com 150 mililitros de APW e, depois de pesar os copos cheios, transfira o peixe para os copos e registre o peso corporal total para avaliação inicial.

Alimente os peixes diariamente com dois pellets de comida por peixe, monitore o consumo registrando visualmente os pellets não consumidos. No final de cada semana, ao longo de quatro semanas, determine o peso do peixe pesando primeiro uma xícara de APW fresco e registre o peso, depois despeje o peixe em uma rede de imersão e transfira-o para o novo copo, antes de pesar o copo novamente. Para grupos de peixes, coloque 150 mililitros de APW em um copo e tara a balança.

Mantenha os peixes juntos em ambos os grupos ao transferi-los para novos recipientes de APW e, em seguida, registre o peso total do grupo. Repita a pesagem no final de cada semana ao longo de um mês. Para analisar o tempo de trânsito intestinal, adicione 360 microlitros de água deionizada estéril e 52 miligramas de gelatina em um tubo estéril de 1,7 mililitro e coloque-o em um bloco de calor de 60 graus Celsius até que a gelatina derreta e esteja totalmente dissolvida.

Usando um mortal e um pilão, triture os flocos de comida de peixinho dourado em um pó fino e adicione 40 miligramas do pó ao tubo junto com 20 microlitros de óleo de peixe. Após a mistura, adicione 1,6 miligramas de dextrana FitC. Dispense gotas de 20 microlitros do líquido quente em parafilme na bancada do laboratório e deixe-as esfriar e solidificar rapidamente.

Coloque o parafilme na metade de uma placa de Petri e flutue-o em água estéril dentro de um recipiente de plástico lacrado. Guarde as gotas solidificadas na geladeira por até quatro dias antes que fiquem muito duras para o peixe comer. Pouco antes de alimentar, use uma lâmina de barbear para cortar as gotas em seções de um quarto.

Aclimate o peixe em copos individuais de isopor por dois dias sem alimentação, coloque quatro quartos da comida no copo de peixe e observe o peixe por 30 minutos para ver quantos pedaços de comida cada um come. Para iniciar o monitoramento, transfira peixes individuais para copos com 80 mililitros de APW e, a cada duas horas, pegue uma amostra de 1 mililitro. Armazene-o em um tubo rotulado de 1,7 mililitro a quatro graus Celsius.

Após a conclusão do ensaio, coloque uma amostra inteira de um mililitro em uma cubeta e use um espectrofotômetro de fluorescência para registrar a fluorescência a uma excitação de 495 nanômetros e uma emissão de 520 nanômetros para todas as amostras ao mesmo tempo. como mostrado aqui, peixes com microbioma alterado por antibióticos eram mais suscetíveis a uma infecção por E.Ictaluri do que peixes controle. A diferença no tempo médio de morte para os peixes tratados versus controle não foi significativa.

Isso provavelmente se deve ao pequeno tamanho do grupo. Este gráfico ilustra que os peixes expostos à rifampicina eram mais suscetíveis ao estresse osmótico do que os peixes controle, com este ensaio, níveis de salinidade acima de 18 miligramas por mililitro resultaram em morte rápida dos peixes. Conforme demonstrado nesta tabela, quando exposto à toxina nitrato na coluna d'água, a pré-exposição ao tratamento com antibióticos não afetou a sobrevida.

A 10 miligramas por mililitro, 50% de letalidade foi observada para os grupos tratado com antibiótico e controle em 90 horas. Neste experimento usando peixes de controle em um aquário, duas seções de alimentos marcados com dextrano FitC ou uma seção foram fornecidas aos peixes para examinar o tempo de trânsito dos alimentos, medindo a fluorescência na água circundante ao longo do tempo. Após esse procedimento, outros métodos, como medir os estoques totais de gordura corporal e quantificar a produção de muco da pele, podem ser realizados para entender os mecanismos e restringir os fatores de confusão que podem contribuir para os efeitos negativos do hospedeiro.